CN106795210B - O-磷酸丝氨酸输出蛋白的新型变体和使用其生产o-磷酸丝氨酸、半胱氨酸和其衍生物的方法 - Google Patents

O-磷酸丝氨酸输出蛋白的新型变体和使用其生产o-磷酸丝氨酸、半胱氨酸和其衍生物的方法 Download PDF

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Abstract

本公开内容涉及具有O‑磷酸丝氨酸(OPS)输出活性的新型多肽、编码该多肽的多核苷酸、表达该多肽的微生物、使用该微生物生产OPS的方法、和用于生产半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括使由其生产的O‑磷酸丝氨酸与硫化物在O‑磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达其的微生物的存在下反应。

Description

O-磷酸丝氨酸输出蛋白的新型变体和使用其生产O-磷酸丝氨 酸、半胱氨酸和其衍生物的方法
技术领域
本公开内容涉及具有输出O-磷酸丝氨酸(OPS)——L-半胱氨酸的前体——的活性的新型修饰的多肽、编码该多肽的多核苷酸、表达该多肽的产O-磷酸丝氨酸微生物、使用该微生物生产O-磷酸丝氨酸的方法、和用于生产半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达其的微生物的存在下使由上述方法生产的O-磷酸丝氨酸与硫化物反应。
背景技术
L-半胱氨酸是一种在所有活的生物体中的硫代谢中起重要作用的氨基酸，不仅被用于合成生物蛋白，比如毛发角蛋白、谷胱甘肽、生物素、甲硫氨酸以及其它含硫代谢物，而且被用作辅酶A生物合成的前体。
使用微生物生产L-半胱氨酸的已知方法包括：1)使用微生物将D，L-2-氨基噻唑啉-4-羧酸(D，L-ATC)生物转化为L-半胱氨酸的方法，2)使用大肠杆菌通过直接发酵生产L-半胱氨酸的方法(EP0885962B；Wada M和Takagi H，Appl.Microbiol.Biochem.，73：48-54，2006)，和3)使用微生物通过发酵生产O-磷酸丝氨酸，并且通过使O-磷酸丝氨酸与硫化物在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶的催化作用下反应而将O-磷酸丝氨酸转化为L-半胱氨酸的方法(韩国专利号1381048)。具体而言，对于通过方法3)以高产量生产半胱氨酸而言，前体O-磷酸丝氨酸应当以过量生产。
就此而言，本发明人已经进行了大量的努力来发现可以平稳地从细胞输出在产O-磷酸丝氨酸微生物中产生的O-磷酸丝氨酸的适合的输出因子。具体地，本发明人已经发现RhtB变体为具有O-磷酸丝氨酸-输出活性的蛋白质(韩国专利申请公布号10-2014-0133751)和新型O-磷酸丝氨酸-输出蛋白(韩国专利申请公布号10-2014-0133754)，并且已经确认当这些蛋白质在产O-磷酸丝氨酸微生物中活化时，O-磷酸丝氨酸浓度增加。
发明内容
技术问题
在这些情况下，本发明人已经进行了努力来发现可以增加O-磷酸丝氨酸生产的具有提高的O-磷酸丝氨酸-输出活性的O-磷酸丝氨酸-输出蛋白，并且开发了其变体，结果，已经成功的开发了可以有效地从产O-磷酸丝氨酸微生物输出O-磷酸丝氨酸的O-磷酸丝氨酸-输出蛋白变体，从而完成本公开内容。
技术方案
因此，本公开内容的目标是提供具有O-磷酸丝氨酸(OPS)输出活性的多肽。
本公开内容的另一目标是提供编码该多肽的多核苷酸。
本公开内容的仍另一目标是提供埃希氏杆菌属(genus Escherichia)的表达该多肽的产O-磷酸丝氨酸微生物。
本公开内容的仍另一目标是提供用于生产O-磷酸丝氨酸的方法，其包括培养生产O-磷酸丝氨酸的微生物。
本公开内容的仍另一目标是提供用于生产半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶或表达其的微生物的存在下使上面生产的O-磷酸丝氨酸与硫化物反应。
发明的有益效果
由选自本公开内容的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的氨基酸序列表示的新型修饰的多肽具有卓越的OPS-输出活性。因此，当本公开内容的新型多肽被应用至生产OPS的微生物时，其可以导致高产率的OPS生产，并且还可以导致通过其有效地生产L-半胱氨酸。
最佳模式
为了实现上述目标，在下面详细描述了本公开内容。
在一方面，本公开内容涉及具有O-磷酸丝氨酸(OPS)输出活性的多肽，其由选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的氨基酸序列表示。
在另一方面，本公开内容涉及由选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的氨基酸序列表示的多肽用于输出O-磷酸丝氨酸的应用。
如本文所使用的，术语“O-磷酸丝氨酸”(在下文中称“OPS”)指的是用作许多蛋白质的组成成分的丝氨酸的磷酸酯。具体地，OPS是L-半胱氨酸的前体并且可以通过与硫化物在OPS硫化氢解酶(在下文中称“OPSS”)的催化作用下反应而转化为半胱氨酸。
如本文所使用的，术语“具有OPS-输出活性的多肽”指的是具有将细胞中的OPS输出至细胞外的活性的膜蛋白，并且具体地，其可以指源自大肠杆菌的膜蛋白。具有OPS-输出活性的本公开内容的多肽可以是YhhS主要协助转运蛋白超家族(major facilitatorsuperfamily)(MFS)转运蛋白或其变体。具体地，该多肽可以是YhhS MFS转运蛋白的变体，其与野生型YhhS MFS转运蛋白的活性相比展示提高的活性，所述YhhS MFS转运蛋白已经被鉴定为在大肠杆菌中具有OPS-输出活性的蛋白质，其中生长抑制在过量OPS存在的情况下被解除。
具体地，多肽可以由选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的氨基酸序列表示，并且可以非限制性地包括与上述序列具有至少70％、具体地至少80％、更具体地至少90％、和甚至更具体地至少95％的序列同源性的膜蛋白，只要它们具有与多肽的OPS-输出活性基本上相同或等同的OPS-输出活性。另外地，显而易见的是，其中部分序列缺失、修饰、置换或插入的多肽变体应当包括在本公开内容的范围内，只要它们是具有这些同源性和OPS-输出活性的氨基酸序列。
如本文所使用的，术语“同源性”指的是与给定多肽序列或多核苷酸序列——其可以享有或可以不享有共同的进化起源——的同一性或等价性的程度，并且可以被指示为百分比。如本文所使用的，与给定多肽序列或多核苷酸序列具有相同或相似活性的同源序列可以根据“％同源性”表示。％同源性可以使用用于计算参数比如分数、同一性和相似性的标准软件——具体地BLAST 2.0——确认，或者经由限定的严格条件下的DNA杂交实验通过比较序列确认，并且限定的严格杂交条件可以通过本领域技术人员已知的方法确定(例如，Sambrook等，1989，下文)。在本公开内容的示例性实施方式中，当两个不同的氨基酸序列对于给定长度的氨基酸序列具有至少21％的多肽序列匹配(具体地，至少大约50％，并且具体而言，大约75％、90％、95％、96％、97％或99％)时，它们“基本上相同”。
在仍另一方面，本公开内容提供了编码具有O-磷酸丝氨酸(OPS)输出活性的多肽的多核苷酸，即，编码YhhS MFS转运蛋白多肽变体的多核苷酸。具体地，本公开内容提供了编码具有O-磷酸丝氨酸输出活性的多肽的多核苷酸，所述多肽由选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：5的氨基酸序列表示。
OPS、YhhS MFS转运蛋白等与上面描述的相同。
如本文所使用的，术语“多核苷酸”指的是核苷酸的聚合物，其中核苷酸单元以长链状方式通过共价键连接，并且其通常指的是具有某一最小长度的DNA或RNA链。
具有OPS-输出活性的多肽的多核苷酸序列可以包括编码选自SEQ ID NO：1、SEQID NO：3和SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多核苷酸序列。基于遗传密码简并性，考虑到生物体表达多肽偏好的密码子，可以在不改变多肽的氨基酸序列的范围内，在编码区上进行对多核苷酸的各种修饰。多核苷酸序列可以包括，例如，选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQID NO：6的多核苷酸序列。另外地，多核苷酸序列可以包括与上述序列——其编码基本上具有OPS-输出活性的多肽——具有70％或更高、具体地80％或更高、更具体地90％或更高、甚至更具体地95％或更高、和最具体地98％或更高的序列同源性的核苷酸序列。另外地，显而易见的是，其中部分序列缺失、修饰、置换或插入的多肽变体应当包括在本公开内容的范围内。
在仍另一方面，本公开内容提供了产生具有O-磷酸丝氨酸输出活性的多肽的微生物，即，表达YhhS MFS转运蛋白多肽变体的产OPS的微生物，并且具体地，埃希氏杆菌属的微生物。
在仍另一方面，本公开内容提供了具有O-磷酸丝氨酸输出活性的多肽的应用，即，表达YhhS MFS转运蛋白多肽变体的微生物，并且具体地，埃希氏杆菌属的微生物的OPS生产应用。
在本公开内容中，OPS、YhhS MFS转运蛋白等与上面描述的相同。
如本文所使用的，术语“产OPS微生物”指的是能够在体内产生OPS的原核或真核微生物菌株，并且具体地是在培养基中或在微生物内通过遗传操作或自然突变可以累积OPS的微生物。
具体地，微生物不被具体地限制，而可以是可以表达选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：5的多肽的任何原核或真核微生物，并且具体地，可以是原核微生物，例如，属于埃希氏杆菌属、欧文氏菌属(genus Erwinia)、沙雷氏菌属(genus Serratia)、普罗维登斯菌属(genus Providencia)、棒状杆菌属(genus Corynebacterium)和短杆菌属类(genus Brevibacterium)的微生物菌株，并且具体地是属于埃希氏杆菌属的微生物，例如大肠杆菌，但是不限于此。
如本文所使用的，术语“表达”可以通过使用重组载体——其可操作地包括编码本公开内容的多肽的多核苷酸——的转化实现，或者通过将编码该多肽的多核苷酸插入染色体实现，但是不限于此。
如本文所使用的，术语“转化”指的是将包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞，从而使得能够在宿主细胞中表达由多核苷酸编码的蛋白质的过程。对于转化的多核苷酸，其插入到宿主细胞的染色体且位于其中或者位于染色体外是无所谓的，只要其可以在宿主细胞中表达。另外地，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式被插入，只要其可以被引入宿主细胞并在其中表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式被引入宿主细胞，所述表达盒是包含自身表达所需的所有必需元件的遗传构建体，但是不限于此。表达盒可以常规地包括可操作地连接至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。另外地，多核苷酸可以按原样引入宿主细胞，并且可操作地连接至对于其在宿主细胞中的表达必需的序列。
另外地，如本文所使用的，术语“可操作地连接”指的是启动子序列和上述基因序列之间的功能性连接，所述启动子序列起始并介导编码本公开内容的靶蛋白的多核苷酸的转录。
如本文所使用的，术语“载体”指的是用于克隆核苷酸序列和/或将核苷酸序列转入宿主细胞的任何中介体。载体可以是可以与不同的DNA片段结合导致组合片段的复制的复制子。如本文所使用的，术语“复制子”指的是起DNA复制的自身单元(self-unit)作用的任何遗传单元，即，可以通过自身调控进行复制的那些(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体和病毒)。载体可以包括用于体内、离体(ex vivo)或体外将核苷酸引入宿主细胞的病毒和非病毒中介体，并且还可以包括微环DNA。例如，载体可以包括不具有任何细菌DNA序列的质粒。富含CpG结构域的细菌DNA序列的去除已经进行，以与质粒DNA载体相比降低转基因的表达沉默和诱导组成型表达(例如，Ehrhardt，A等，(2003)HumGene Ther 10：215-25；Yet，N.S.(2002)MoI Ther 5：731-38；Chen，Z.Y.等，(2004)Gene Ther 11：856-64)。另外地，载体可以包括转座子(Annu Rev Genet.2003；37：3-29.)或人工染色体。具体地，可以使用pACYC177、pACYC184、pCL1920、pECCG117、pUC19、pBR322和pMW118载体，和具有其修饰的启动子的载体，但不限于此。
载体可以是包含编码靶蛋白的多核苷酸的多核苷酸序列的DNA构建体，其可操作地连接至适合的调控序列，使得靶蛋白可以在适合的宿主中表达。调控序列包括能够起始转录的启动子、用于调控转录的随机操纵序列、编码适合的mRNA核糖体结合结构域的序列、和用于调控转录和翻译的序列。在被转化入适合的宿主细胞之后，载体可以独立于宿主基因组复制或者起作用，或者可以被整合入宿主基因组本身。
在本公开内容中使用的载体可以不被具体地限定，只要载体在宿主细胞中是可复制的，并且可以使用本领域中已知的任何载体。载体的实例可以包括天然的或重组的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λ4SHII、λ4PII、λt10、λt11、Charon4A、Charon21A等，但是不限于此；并且作为质粒载体，可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的那些，但是不限于此。
另外地，在产OPS微生物中，磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)的活性与其内源活性相比可以进一步减弱。
SerB具有将OPS转化为L-丝氨酸的活性，并且因而被修饰以降低SerB活性的微生物具有在其中累积OPS的性质，因而对于OPS的生产是有用的。SerB可以是具有由SEQ IDNO：16表示的氨基酸序列的蛋白质，但是不限于此。另外地，SerB可以包括具有80％或更高、具体地90％或更高、更具体地95％或更高、和甚至更具体地99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，只要其显示SerB活性，但是不限于此。另外地，编码SerB的多核苷酸序列可以具有编码由SEQ ID NO：16表示的氨基酸的多核苷酸序列。
基于遗传密码简并性，考虑到生物体表达多肽偏好的密码子，可以在不改变多肽的氨基酸序列的范围内，在编码区上进行对多核苷酸的各种修饰。多核苷酸序列可以包括例如由SEQ ID NO：17表示的核苷酸序列，并且可以包括与该序列具有80％的序列同源性的核苷酸序列，并且具体地90％或更高，但是不限于此。
如本文所使用的，术语“活性的减弱”指的是与微生物在其野生型状态或修饰之前所拥有的蛋白质活性相比，蛋白质活性的降低，并且其还包括活性被消除时的情况。
减弱是如此概念：其指的是由于蛋白质-编码基因的修饰等，与微生物的内源活性相比，蛋白质活性降低或消除时的情况；由于编码蛋白质的基因的表达的抑制或翻译的抑制等，蛋白质表达的水平低于微生物的野生型菌株的蛋白质表达的水平时的情况；基因根本不表达时的情况；和基因表达但是展示无活性时的情况。
蛋白质活性的减弱可以通过本领域中熟知的多种方法实现。方法的实例可以包括利用突变使得酶活性可以降低——包括蛋白质活性被消除时的情况——的基因置换编码染色体上蛋白质的基因的方法；修饰编码蛋白质的基因的表达调控序列的方法；使染色体上编码蛋白质的基因的部分或全部缺失的方法；引入反义寡核苷酸(即，反义RNA)的方法，所述反义寡核苷酸经由与染色体上基因的转录物互补结合来抑制从mRNA翻译为蛋白质；通过在编码蛋白质的基因的SD序列的前端上将互补序列人工地添加至核糖体结合(Shine-Dalgarno)(SD)序列形成二级结构而使得核糖体的附着不可能的方法；反转录基因工程学(RTE)的方法，所述反转录基因工程学添加启动子从而在相应序列的开放阅读框(ORF)的3’末端上反转录，等，并且还包括其组合，但是不具体地限于此。
具体地，使编码蛋白质的基因的部分或全部缺失的方法可以通过以下执行：利用具有部分缺失的核酸序列的多核苷酸或标记基因替换编码染色体内的内源靶蛋白的多核苷酸，并且使用载体将染色体插入细菌。在示例性的实施方式中，基因可以通过同源重组被缺失。另外地，如本文所使用的，术语“部分”，尽管其根据多核苷酸的种类变化，但可以具体地指1个核苷酸到300个核苷酸，更具体地1个核苷酸到100个核苷酸，并且甚至更具体地1个核苷酸到50个核苷酸，但是不具体地限于此。
另外地，修饰表达调控序列的方法可以通过以下进行：经由缺失、插入、保守置换、非保守置换或其组合诱导表达调控序列中的修饰，从而进一步减弱表达调控序列的活性；或者利用具有较弱活性的核酸序列替换该序列。表达调控序列包括启动子、操纵序列、编码核糖体结合结构域的序列、和用于调控转录和翻译的序列。
另外地，修饰基因序列的方法可以通过以下进行：经由缺失、插入、保守置换、非保守置换、或其组合诱导基因序列中的修饰，从而进一步减弱蛋白质的活性；或者利用改进以具有更弱活性的基因序列或改进以根本不具有活性的基因序列替换该序列。
具体地，本公开内容中的SerB活性的减弱可以通过选自以下的至少一种方法实现：去除SerB活性的方法；利用突变使得SerB活性可以降低的基因置换染色体上SerB-编码基因的方法；在染色体上的SerB-编码基因的表达调控序列中引入修饰的方法；利用具有较弱活性的序列置换SerB-编码基因的表达调控序列的方法；使染色体上的SerB-编码基因缺失的方法和引入反义寡核苷酸的方法，所述反义寡核苷酸经由互补结合至染色体上SerB-编码基因的转录物来抑制从mRNA翻译为蛋白质；通过在编码蛋白质的基因的SD序列的前端上将互补序列人工地添加至核糖体结合(SD)序列形成二级结构而使得核糖体的附着不可能方法；通过在SerB-编码基因的SD序列的前端上将互补序列人工地添加至核糖体结合(SD)序列形成二级结构而使得核糖体的附着不可能的方法；反转录基因工程学(RTE)的方法，所述反转录基因工程学添加启动子从而在相应序列的开放阅读框(ORF)的3’末端上反转录。
另外地，产OPS微生物可以是如此微生物：在该微生物中，磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)或磷酸丝氨酸转氨酶(SerC)的活性与它们各自的内源活性相比进一步增强。
SerA是能够将3-磷酸甘油酸转化为3-磷酸-羟基丙酮酸的蛋白质。SerA可以被用作野生型或变体的形式，在该变体中对丝氨酸的反馈抑制被解除。另外地，SerC是能够将3-磷酸-羟基丙酮酸转化为OPS的蛋白质。因此，具有增强的SerA和/或SerC活性的任何微生物可以被有效地用作产OPS微生物。
SerA可以具有由SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19表示的氨基酸序列，但是其不限于此。SEQ ID NO：18是野生型SerA的序列，并且SEQ ID NO：19是其中对丝氨酸的反馈抑制被解除的变体的序列。另外地，可以包括与上述氨基酸具有至少80％，具体地至少90％，更具体地至少95％，并且甚至更具体地至少99％的序列同一性的那些氨基酸序列，只要它们展示野生型SerA或SerA变体——其中对丝氨酸的反馈抑制被解除——的活性，但是不限于此。其中反馈抑制被解除的变体代表那些蛋白质——在其中通过插入、置换等在SerA-编码基因上引入修饰，从而使得能够维持活性免于丝氨酸或甘氨酸的反馈抑制，或者具有增强的其活性，并且其中反馈抑制被解除的那些变体已经是熟知的(Grant GA等，J.Biol.Chem.，39：5357-5361，1999；Grant GA等，Biochem.，39：7316-7319，2000；Grant GA等，J.Biol.Chem.，276：17844-17850，2001；Peters-Wendisch P等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，60：437-441，2002；EP专利号EP0943687B)。
另外地，编码野生型SerA或变体——其中对丝氨酸的反馈抑制被解除——的多核苷酸序列可以是编码由SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19表示的任一种氨基酸序列的多核苷酸序列，但是不限于此。由于遗传编码简并性或者考虑到生物体表达多肽偏好的密码子，可以在不改变多肽的氨基酸序列的范围内，在编码区上执行对多核苷酸的各种修饰。多核苷酸序列可以是，例如，由SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：25表示的多核苷酸序列的任一种，并且可以具有与该多核苷酸序列具有至少80％，并且具体地至少90％同源性的核苷酸序列，但是不限于此。
SerC可以是具有例如由SEQ ID NO：21表示的氨基酸序列的蛋白质，但是不限于此。另外地，氨基酸序列——只要其展示SerC活性——还可以包括与上述氨基酸序列具有至少80％，具体地至少90％，更具体地至少95％，和甚至更具体地至少99％序列同一性的氨基酸序列，但是不限于此。
另外地，编码SerC的多核苷酸序列可以是编码由SEQ ID NO：21表示的氨基酸的多核苷酸序列。由于遗传编码简并性或者考虑到生物体表达多肽偏好的密码子，可以在不改变多肽的氨基酸序列的范围内，在编码区上执行对多核苷酸的各种修饰。多核苷酸序列可以是，例如，由SEQ ID NO：22表示的多核苷酸序列，并且可以具有与该多核苷酸序列具有至少80％，并且具体地至少90％同源性的核苷酸序列，但是不限于此。
如本文所使用的，术语“内源活性”指的是野生型状态或修饰之前状态的微生物中多肽的活性状态。如本文所使用的，术语“与其内源活性相比增强”指的是与其野生型状态或修饰前状态拥有的活性相比，微生物中多肽的增加的活性，并且是如此概念：包括使得不具有特定多肽的活性的微生物具有特定多肽的活性。
如本文所使用的，术语“活性增强”不仅指由于多肽本身活性的增加，与原始功能相比更高效果的产生(drawing)，而且指由于——通过内源基因活性增加，通过内部或外部因素的内源基因扩增，启动子的替换、修饰或突变等引起的——酶活性增加而造成的其活性增加，但是不具体限于此。具体地，活性增强可以通过如下方法执行：比如，用于增加细胞中编码多肽的基因的拷贝数的方法，用于修饰编码多肽的基因的调控序列的方法，用于利用突变基因置换染色体上编码多肽的基因以增加多肽活性的方法，用于在染色体上编码多肽的基因中引入修饰以增强多肽活性的方法，等，但是方法不限于此。这些用于增强活性的方法可以以与增强本公开内容的其它多肽活性相同的方式参考。
具体地，在本公开内容中活性增强可以通过选自以下的至少一种方法实现：用于增加细胞中编码SerA或SerC的基因的拷贝数的方法；用于在染色体上编码SerA或SerC的基因的调控序列中引入修饰的方法；用于利用具有强活性的序列置换染色体上编码SerA或SerC的基因的调控序列的方法；用于利用突变基因置换染色体上编码SerA或SerC的基因以增加SerA或SerC的活性的方法；和在染色体上编码SerA或SerC的基因中引入修饰以增强SerA或SerC的活性的方法。
在上述中，基因拷贝数的增加可以以可操作地连接至载体的状态，或通过被插入宿主细胞内的染色体中执行，但是不限于此。具体地，方法可以通过将载体——其与编码本公开内容的蛋白质的多核苷酸可操作地连接，并且其可以独立于宿主复制并且起作用——引入宿主细胞来执行；或者通过将能够将多核苷酸插入宿主细胞染色体的载体——其与多核苷酸可操作地连接——引入宿主细胞来执行。将多核苷酸插入染色体可以使用本领域中已知的方法执行，例如，通过同源重组。
然后，用于增加多核苷酸表达的表达调控序列的修饰可以通过以下进行：经由缺失、插入、保守置换、非保守置换、或其组合诱导多核苷酸序列中的修饰，从而进一步增强表达调控序列的活性；或者利用具有更强活性的核酸序列替换多核苷酸序列；但是不限于此。表达调控序列可以包括启动子、操纵序列、编码核糖体结合结构域的序列、和用于调控转录和翻译的终止的序列等，但是不限于此。
强启动子，而不是原始启动子，可以连接至多核苷酸的表达单元的上端，但是不限于此。已知的强启动子的实例可以包括cj1启动子(韩国专利号10-0620092)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子和tet启动子，但是不限于此。
另外地，对染色体上多核苷酸序列的修饰可以通过以下进行：经由缺失、插入、保守置换、非保守置换、或其组合诱导多核苷酸序列的表达调控序列中的修饰，从而进一步增强多核苷酸序列的活性；或者利用具有更强活性的增强的多核苷酸序列替换多核苷酸序列；但是不限于此。
一般而言，蛋白质活性的引入和增强可以使相应蛋白质的活性和浓度相对于在初始阶段的野生型蛋白质或在微生物菌株中的活性或浓度增加至少1％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％至最大1000％或2000％，但是不限于此。
另外地，微生物可以是其将OPS引入细胞或分解的能力进一步减弱的微生物。具体地，PhnC/PhnD/PhnE膦酸烷基酯ABC转运蛋白(PhnCDE操纵子，具体地膦酸酯转运蛋白的ATP结合成分(PhnC；EG 10713)-Pn转运蛋白的周质结合蛋白成分(PhnD；EG 10714)-膦酸烷基酯ABC转运蛋白的整合膜成分(PhnE；EG 11283))、碱性磷酸酶(PhoA)或酸性磷酸酶(AphA)的活性与其内源活性相比可以被减弱。
另外地，本公开内容的微生物可以利用核苷酸转氢酶(PntAB；EC 1.6.1.1)的活性进一步增强。PntAB，如在先前的参考文献中指出的(Sauer U P等，J Biol Chem.20；279(8)：6613-9.Epub 2003)，参与NADPH的代谢并且控制细胞内氧化还原平衡。
关于产OPS微生物的内容，除了上面描述的那些之外，韩国专利号1381048或美国专利申请公布号2012-0190081中的公开内容也可以被用作本公开内容的参考文献。
在仍另一方面，本公开内容提供了用于生产OPS的方法，其包括在培养基中培养表达具有OPS-输出活性的多肽——即，YhhS MFS转运蛋白多肽变体——的产OPS微生物。
在本公开内容中，OPS、具有OPS-输出活性的多肽、YhhS MFS转运蛋白和产OPS微生物与上面解释的相同。
具体地，方法可以包括培养表达由选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的氨基酸序列表示的多肽的产OPS微生物；和从上述步骤中的产OPS微生物或培养基中分离OPS，但是方法不限于此。
如本文所使用的，术语“培养”指的是在适当调节的环境中使微生物生长。培养过程可以根据本领域中已知的适合的培养基和培养条件进行。培养过程可以由本领域技术人员根据被选择的菌株容易地调整以进行使用。具体地，培养可以是分批培养、连续培养和补料培养，但是不限于此。
在培养与其内源活性相比具有降低的SerB活性的重组微生物中，培养基可以进一步包含甘氨酸或丝氨酸，这是因为重组微生物的丝氨酸需求被诱导。甘氨酸可以以纯化甘氨酸、含甘氨酸的酵母提取物或胰蛋白胨的形式提供。培养基中包含的甘氨酸的浓度通常是0.1g/L到10g/L，并且具体地0.5g/L至3g/L。另外地，丝氨酸可以以纯化丝氨酸、含丝氨酸的酵母提取物或胰蛋白胨的形式提供。培养基中包含的丝氨酸的浓度通常是0.1g/L到5g/L，并且具体地0.1g/L to 1g/L。
培养基中包含的碳源的实例可以包括糖类和碳水化合物，比如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油脂，比如豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸比如软脂酸、硬脂酸和亚油酸；醇类，比如丙三醇和乙醇；和有机酸，比如乙酸。这些碳源可以单独或组合使用，但是不限于此。培养基中包含的氮源的实例可以包括有机氮源比如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆和豆粉；和无机氮源比如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可以单独或组合使用，但是不限于此。作为磷源，培养基可以进一步包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠的盐，但是不限于此。培养基可以包含金属比如硫酸镁和硫酸铁。另外地，可以包含氨基酸、维生素和适合的前体。这些培养基或前体可以以分批培养或连续培养的形式被加入到培养基，但是不限于此。
另外地，培养基的pH可以通过在培养期间以适合的方式加入化合物来调节，所述化合物比如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸。另外地，可以在培养期间使用消泡剂比如脂肪酸聚乙二醇酯来阻止气泡形成。另外地，可以加入氧气或含氧气体至培养基中以便于维持培养液的需氧条件；或者可以注入氮气、氢气或二氧化碳以维持厌氧或微需氧条件。培养温度可以在从27℃到37℃，并且具体地从30℃至35℃的范围内。培养可以继续直到可以获得期望物质的生产，并且具体地持续从10小时到100小时，但是不限于这些说明性实例。
在本公开内容中，在培养期间产生的OPS可以进一步被分离和纯化。预期的OPS可以根据培养方法——例如，分批培养、连续培养和补料培养——使用本领域已知的适合方法从培养物中回收，但是不限于此。
在仍另一方面，本公开内容提供了用于生产半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括在培养基中培养表达具有OPS-输出活性的多肽——即，YhhS MFS转运蛋白多肽变体——的产OPS微生物来生产O-磷酸丝氨酸；和在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达OPSS的微生物的存在下使上面生产的OPS与硫化物反应。
另外地，本公开内容提供了用于生产半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括在培养基中培养表达具有OPS-输出活性的多肽——即，YhhS MFS转运蛋白多肽变体——的产OPS微生物来生产O-磷酸丝氨酸；从上述步骤中的产OPS微生物或培养基中分离OPS；和在OPSS或表达OPSS的微生物的存在下使上面生产的OPS与硫化物反应。
在本公开内容中，OPS、具有OPS-输出活性的多肽、YhhS MFS转运蛋白和产OPS微生物与上面描述的相同。
如本文所使用的，术语“O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)”指的是催化如此反应的多肽：在该反应中硫羟(SH)基被提供至OPS以将OPS转化为半胱氨酸。该酶首先在敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatics)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)中发现(Mino K和Ishikawa K，FEBS Letters，551：133-138，2003；Burns KE等，J.Am.Chem.Soc.，127：11602-11603，2005)。另外地，OPSS的范围不仅包括野生型OPSS蛋白，而且包括在编码OPSS的多核苷酸序列的一部分中包含缺失、置换或添加的变体——其显示活性等于或高于野生型OPSS蛋白的生物活性，并且还包括在韩国专利号1381048和1208267中公开的所有OPSS蛋白和其变体。
在本公开内容中使用的硫化物可以是任何硫化物，由于pH、压力和溶解度的不同，其不仅以本领域中通常使用的固体形式，而且以液体或气体形式提供，并且因而可以以例如硫离子(S2-)或硫代硫酸盐(S2O3 2-)的形式被转化为硫羟(SH)基。具体地，在本公开内容中使用的硫化物可以包括Na2S、NaSH、H2S、(NH4)2S和Na2S2O3——其可以将硫羟基提供给OPS，但不限于此。在反应中，单个硫羟基被提供至单个反应性OPS基团以产生单个半胱氨酸或其衍生物。在该反应中，硫化物具体地以基于OPS的摩尔浓度0.1到3摩尔当量，并且具体地1到2摩尔当量的量加入，但是不限于此。当提供硫羟基的OPS和硫化物以1∶1(一比一)摩尔比提供时，经济上最佳转化可能发生。
此外，本公开内容的方法可以进一步包括分离和纯化上述反应步骤中产生的半胱氨酸。具体而言，期望的半胱氨酸可以使用本领域已知的适合反应通过从反应溶液分离和纯化进行回收。
另外地，根据本公开内容的方法制备的半胱氨酸可以通过本领域中已知的化学合成反应容易地合成。
如本文所使用的，术语“衍生物”指的是通过化学修饰任何化合物的一部分获得的类似化合物。通常，该术语指的是如此化合物：在该化合物中氢原子或特定的原子基团被另一氢原子或原子基团替换。
如本文所使用的，术语“半胱氨酸衍生物”指的是如此化合物：在该化合物中，半胱氨酸中的氢原子或特定的原子基团被另一原子或原子基团替换。例如，半胱氨酸衍生物可以具有如此形式：在该形式中，半胱氨酸中胺基(-NH2)的氮原子或硫羟基(-SH)的硫原子具有附接至其的另一原子或原子基团。半胱氨酸衍生物的实例可以包括N-乙酰半胱氨酸(NAC)、S-羧甲基半胱氨酸(SCMC)、Boc-Cys(Me)-OH、(R)-S-(2-氨基-2-羧乙基)-L-高半胱氨酸、(R)-2-氨基-3-磺丙酸、D-2-氨基-4-(乙基硫代)丁酸、3-亚磺基-L-丙氨酸(3-sulfino-L-alanine)、Fmoc-Cys(Boc-甲基)-OH、硒基-L-半胱氨酸、S-(2-噻唑基)-L-半胱氨酸、S-(2-噻吩基)-L-半胱氨酸、S-(4-甲苯基)-L-半胱氨酸，但是不限于此。半胱氨酸可以通过与乙酰化试剂反应并且在碱性条件下被容易地合成为N-乙酰半胱氨酸(NAC)，其可以通过与卤代乙酸反应被合成为S-羧甲基半胱氨酸(SCMC)。这些半胱氨酸衍生物可以主要地被用作止咳药，咳嗽缓解剂，和用于支气管炎、支气管哮喘、咽喉炎等的治疗剂的药物材料。
在仍另一方面，本公开内容提供了通过多肽输出OPS的用途，所述多肽由选自SEQID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的氨基酸序列表示。
优选实施方式
在下文中，将参照下面的实施例更详细地描述本公开内容。但是，这些实施例仅出于说明性目的，并且本公开内容不意欲被这些实施例限制。
实施例1：YhhS主要协助转运蛋白超家族(MFS)转运蛋白变体的制备
为了提高OPS-输出蛋白(输出蛋白(exporter))的活性以便于提高产OPS菌株中OPS-输出活性，对于YhhS主要协助转运蛋白超家族(MFS)转运蛋白(SEQ ID NO：23)——一种最近被鉴定的OPS-输出蛋白，和yhhS(SEQ ID NO：24)——编码其的基因，制备变体。详细过程在下文描述。
首先，构建yhhS基因变体的文库。为此，基于作为模板的大肠杆菌K12W3110(ATCC27325)的基因组DNA，使用基因特异性引物对(SEQ ID NO：7和8)进行随机诱变PCR(JENA易错PCR)。将由诱变如此制备的基因片段克隆入pCLPrhtB载体，其中rhtB启动子(SEQID NO：13)——其经历使用基因特异性引物对(SEQ ID NO：14和15)的PCR——被插入pCL1920载体(GenBank号AB236930)的SacI-EcoRV位点。具体地，利用EcoRV和PstI切割pCLPrhtB载体，并且然后使用In-fusion Cloning Kit(Clontech Laboratories，Inc.)将来自诱变的基因片段克隆入其中。该克隆在50℃下进行10分钟，从而完成pCL PrhtB yhhS变体的质粒文库的构建。
如此构建的重组质粒文库经由高流量筛选(HTS)进行筛选。具体而言，用于筛选的平台菌株是CA07-0012(KCCM11121P)，其是被修饰以降低野生型大肠杆菌菌株W3110中内源磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)的活性的重组微生物(韩国专利号10-1381048；美国专利申请公布号2012-0190081)。
随后，为了获得具有提高的OPS-输出活性的变体，如此构建的质粒文库经由电穿孔被转化入平台菌株CA07-0012，在包含过量OPS的培养基中培养，并且选择其中生长抑制被解除的三个菌落。然后，质粒从三个选择的菌落获得并且经由测序技术进行分析。
因此，选择在添加OPS条件下参与生长抑制去除的三种yhhS变体，并且这些变体分别被命名为yhhS M2、yhhS M25和yhhS M45。
在分析yhhS M2、yhhS M25和yhhS M45的核苷酸序列之后，确认yhhS M2具有由SEQID NO：1表示的氨基酸序列，yhhS M25具有由SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列，和yhhS M45具有由SEQ ID NO：5表示的氨基酸序列。
实施例2：确认产OPS菌株中yhhS变体的OPS-输出活性
2-1.使用CA07-0012构建具有增强的YhhS MFS转运蛋白的菌株并且评估产OPS能 力
将包含在实施例1中鉴定的三种不同变体的质粒通过在本领域中常规使用的电脉冲方法分别转化入CA07-0012——产OPS菌株。因此，构建引入有yhhS变体的产OPS菌株，即，CA07-0012/pCL-PrhtB-yhhS M2、CA07-0012/pCL-PrhtB-yhhS M25和CA07-0012/pCL-PrhtB-yhhS M45，并且这些菌株分别被命名为大肠杆菌CA07-0345、大肠杆菌CA07-0344和大肠杆菌
Figure BPA0000234788750000161
具体地，将每种菌株平板接种在固体LB培养基中并且在33℃培育箱中培养过夜。将在固体LB培养基中培养过夜的菌株接种入下面表1中示出的25mL效价培养基(titermedium)中并且在34.5℃培育箱中在200rpm的速率下培养48小时。结果在下面的表2中示出。
表1
组分 浓度(每1L)
葡萄糖 50g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 6g
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 17g
MgSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O 1g
FeSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O 5mg
MnSO<sub>4</sub>.4H<sub>2</sub>O 10mg
L-甘氨酸 2.5g
酵母提取物 3g
碳酸钙 30g
pH 6.8
表2
Figure BPA0000234788750000162
Figure BPA0000234788750000171
如上面的表2中所示，在菌株引入有本公开内容的yhhS变体的情况下，这些菌株与引入有野生型yhhS基因的菌株相比，显示了卓越的结果，表明OPS生产增加了128％到165％。具体地，分别与野生型的增加相比，yhhS M2变体显示了128％的增加，yhhS M25显示了165％的增加，和yhhS M45变体显示了156％的增加。
2-2.使用具有增强的SerA和SerC的菌株构建具有增强的YhhSMFS转运蛋白的菌株 并且评估产OPS能力
为了再次证实本公开内容的yhhS变体的活性，使用CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC(KCCM11103P，韩国专利号10-1381048)，其为具有提高的产OPS能力的产OPS菌株，作为OPS生物合成途径具有增强的D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)和3-磷酸丝氨酸转氨酶(SerC)活性。
为了构建pCL-Prmf-serA(G336V)-serC_PrhtB-基因载体，基于作为模板的pCL-PrhtB-yhhS变体，使用引物对(SEQ ID NO：9和10)对yhhS变体中的每个进行扩增，并且将生成物克隆入pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC载体的HindIII限制位点。
具体地，将菌株——在该菌株中每个质粒通过常规使用的电脉冲方法转化——平板接种在固体LB培养基中并且然后在33℃培育箱中培养过夜。将在固体LB培养基中培养过夜的菌株接种入上面表1中示出的25mL效价培养基中并且在34.5℃培育箱中在200rpm的速率下培养48小时。结果在下面的表3中示出。
表3
Figure BPA0000234788750000172
Figure BPA0000234788750000181
如上面的表3中所示，可以确认，当本公开内容的yhhS变体被引入至具有增强的OPS生物合成基因的产OPS菌株时，OPS生产增加了130％至176％。这些结果表明本公开内容的yhhS变体可以有效地用于OPS生产。
2-3.根据染色体上的启动子强度构建具有增强的YhhS MFS转运蛋白的菌株并且 评估产OPS能力
从上面的实验进一步，为了确认当yhhS变体被引入染色体上时，OPS-输出活性是否提高，利用pCJ1启动子(韩国专利号10-0620092)置换微生物的自身启动子，并且构建引入有本公开内容的变体的菌株并评估它们的产OPS能力。将pCJ1启动子和变体引入染色体通过本领域中常规使用的方法进行。首先，为了转化，作为初始步骤，通过电脉冲方法(ApplMicrobiol Biotechnol.1999 Oct；52(4)：541-5)将重组载体插入CA07-0022/pCL-Prmf-serA*(G336V)-serC(KCCM11103P，韩国专利号10-1381048)——产OPS菌株。然后，通过同源序列的重组插入染色体的菌株在包含25mg/L卡那霉素的培养基中选择。如此选择的初始(primary)菌株经历交换的第二步骤，并且然后选择菌株——在该菌株中，pCJ1启动子和变体被置换并且载体被去除。
最后，通过进行使用引物对(SEQ ID NO：11和12)的PCR确认存在转化的菌株的启动子和变体的置换。
将每种菌株平板接种在固体LB培养基中并且然后在33℃培育箱中培养过夜。将在LB固体培养基中培养过夜的菌株接种入上面表1中示出的25mL效价培养基中并且在34.5℃培育箱中在200rpm的速率下培养40小时。结果在下面的表4中示出。
表4
Figure BPA0000234788750000191
如上面的表4中所示，可以确认，当染色体上的每个蛋白变体的活性增加时，通过蛋白变体的OPS生产的量与引入有野生型yhhS的菌株的OPS生产的量相比表现了172％的最大值。
根据上面的描述，本公开内容所属领域的技术人员将能够理解，本公开内容可以以其它具体的形式体现而不修改本公开内容的技术概念或必要特征。就此而言，本文公开的示例性实施方式仅仅出于说明性的目的并且不应当被解释为限制本公开内容的范围。相反，本公开内容意欲覆盖不仅示例性实施方式而且覆盖各种替代方案、修改、等价方案和可以包含在本公开内容的精神和范围内的如所附权利要求书所限定的其它实施方式。
国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
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Figure BPA0000234788750000201
1如果第6.4(d)条适用，该日期是获得国际保藏机构资格的日期；如果在获得国际保藏机构资格的日期之后在布达佩斯条约之外的保藏被转化成在布达佩斯条约之下的保藏，该日期是由该国际保藏机构收到该微生物的日期。
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BP/4表
Figure IPA0000234788710000011
Figure IPA0000234788710000021
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Claims (10)

1.具有O-磷酸丝氨酸(OPS)输出活性的多肽，其由选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的氨基酸序列表示。
2.多核苷酸，其编码权利要求1所述的多肽。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸由选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：6的核苷酸序列表示。
4.生产O-磷酸丝氨酸的埃希氏杆菌属的微生物，其中所述微生物表达权利要求1所述的多肽。
5.根据权利要求4所述的微生物，其中磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)的活性与其内源活性相比被进一步减弱。
6.根据权利要求4所述的微生物，其中磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)或磷酸丝氨酸转氨酶(SerC)的活性与其内源活性相比进一步增强。
7.根据权利要求4所述的微生物，其中所述埃希氏杆菌属的微生物是大肠杆菌。
8.用于生产O-磷酸丝氨酸(OPS)的方法，其包括在培养基中培养权利要求4到7中任一项所述的微生物。
9.用于生产半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括：
a)在培养基中培养权利要求4-7中任一项所述的微生物以生产O-磷酸丝氨酸(OPS)；和
b)使在步骤a)中生产的所述O-磷酸丝氨酸与硫化物在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或表达其的微生物的存在下反应。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述硫化物是选自Na2S、NaSH、(NH4)2S、H2S和Na2S2O3中的至少一种。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220062542A (ko) * 2020-06-09 2022-05-17 씨제이제일제당 (주) O-포스포세린 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
KR102414743B1 (ko) * 2020-09-09 2022-06-29 씨제이제일제당 주식회사 신규 o-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산 방법
KR20220163754A (ko) * 2021-06-03 2022-12-12 씨제이제일제당 (주) 신규한 YhhS 변이체 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
KR20220166947A (ko) * 2021-06-11 2022-12-20 씨제이제일제당 (주) 신규한 MdtH 변이체 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
KR102654301B1 (ko) * 2021-06-23 2024-04-04 씨제이제일제당 주식회사 NADH:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102741400A (zh) * 2010-10-20 2012-10-17 Cj第一制糖株式会社 O-磷酸丝氨酸巯解酶突变体以及利用其生产半胱氨酸的方法
CN102906272A (zh) * 2010-10-20 2013-01-30 Cj第一制糖株式会社 生产o-磷酸丝氨酸的微生物和使用该微生物由o-磷酸丝氨酸生产l-半胱氨酸或其衍生物的方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19726083A1 (de) 1997-06-19 1998-12-24 Consortium Elektrochem Ind Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolidinderivaten
JP3997631B2 (ja) * 1998-01-12 2007-10-24 味の素株式会社 発酵法によるｌ−セリンの製造法
JP4066543B2 (ja) * 1998-01-12 2008-03-26 味の素株式会社 発酵法によるｌ−セリンの製造法
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
WO2012053794A2 (en) * 2010-10-20 2012-04-26 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism producing o-phosphoserine and method of producing l-cysteine or derivatives thereof from o-phosphoserine using the same
KR101404376B1 (ko) * 2011-12-15 2014-06-11 씨제이제일제당 (주) 신규 ｏ-포스포세린 설프하이드릴라아제를 이용하여 시스테인 또는 이의 유도체를 생산하는 방법
KR101525663B1 (ko) * 2013-05-10 2015-06-04 씨제이제일제당 (주) 신규 ｏ-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 ｏ-포스포세린의 생산방법
KR101493154B1 (ko) * 2013-05-10 2015-02-13 씨제이제일제당 (주) 신규 ＲｈｔＢ 단백질 변이체 및 이를 이용한 Ｏ-포스포세린의 생산방법
KR101677328B1 (ko) * 2014-08-12 2016-11-18 씨제이제일제당 (주) O-포스포세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인 생산 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102741400A (zh) * 2010-10-20 2012-10-17 Cj第一制糖株式会社 O-磷酸丝氨酸巯解酶突变体以及利用其生产半胱氨酸的方法
CN102906272A (zh) * 2010-10-20 2013-01-30 Cj第一制糖株式会社 生产o-磷酸丝氨酸的微生物和使用该微生物由o-磷酸丝氨酸生产l-半胱氨酸或其衍生物的方法
CN104762273A (zh) * 2010-10-20 2015-07-08 Cj第一制糖株式会社 O-磷酸丝氨酸巯解酶突变体以及利用其生产半胱氨酸的方法
CN104862352A (zh) * 2010-10-20 2015-08-26 Cj第一制糖株式会社 生产o-磷酸丝氨酸的微生物和使用该微生物由o-磷酸丝氨酸生产l-半胱氨酸或其衍生物的方法

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