CN114381417A - 一种提高谷氨酸棒杆菌对抑制物耐受性的方法 - Google Patents

一种提高谷氨酸棒杆菌对抑制物耐受性的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114381417A
CN114381417A CN202210296227.XA CN202210296227A CN114381417A CN 114381417 A CN114381417 A CN 114381417A CN 202210296227 A CN202210296227 A CN 202210296227A CN 114381417 A CN114381417 A CN 114381417A
Authority
CN
China
Prior art keywords
corynebacterium glutamicum
glutamicum
recombinant
phosphoglycerate dehydrogenase
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210296227.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN114381417B (zh
Inventor
王猛
刘叶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Original Assignee
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS filed Critical Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority to CN202210296227.XA priority Critical patent/CN114381417B/zh
Publication of CN114381417A publication Critical patent/CN114381417A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114381417B publication Critical patent/CN114381417B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01095—Phosphoglycerate dehydrogenase (1.1.1.95)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/0101—Formyltetrahydrofolate deformylase (3.5.1.10)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种提高谷氨酸棒杆菌对抑制物耐受性的方法，其通过降低或消除谷氨酸棒杆菌的内源甲酰四氢叶酸脱甲酰酶催化活力，或者突变谷氨酸棒杆菌内源D‑3‑磷酸甘油酸盐脱氢酶以增强其活性，或者将上述两种方法组合，以获得对抑制物的耐受性提高的重组谷氨酸棒杆菌。本发明构建的菌株为后续高性能工业发酵底盘菌株构建提供参考，有利于谷氨酸棒杆菌以木质纤维素水解液为原料生产生物燃料或其他高附加值化学品。

Description

一种提高谷氨酸棒杆菌对抑制物耐受性的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种提高谷氨酸棒杆菌对糠醛等抑制物耐受性的方法。
背景技术
木质纤维素是一类重要的可再生生物质资源，广泛的存在于自然界中。开发以秸秆等木质纤维素作为原料的微生物细胞工厂，用以生产乙醇和丁醇等生物燃料，将有效的降低现阶段对传统化石燃料的依赖，因此近年来备受研究者关注。由于木质纤维素原料的结构致密，须经过一系列的预处理过程，如稀酸处理等，破坏其刚性结构，才能被微生物后续利用。在酸处理过程中，一些毒性副产物会得到释放，包括呋喃醛类、弱酸类、酚类等物质。糠醛、5-羟甲基糠醛作为典型的呋喃醛类化合物，对微生物的生长与发酵过程会产生抑制作用。提高微生物对糠醛、5-羟甲基糠醛等抑制物的耐受性，将有助于高性能细胞工厂的构建。
谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是一株具有重要工业应用价值的底盘微生物，目前被广泛的应用于氨基酸等化学品的生产中。由于具有生物安全、生长速度快、营养需求低、遗传操作背景清晰等优势，谷氨酸棒杆菌不断被开发，其可利用底物和生产产品种类也在不断扩展。目前该菌株已实现以木质纤维素水解液为原料，生产多种高附加值化学品。尽管谷氨酸棒杆菌具有一定的糠醛等抑制物脱毒能力，但是菌体生长仍然受糠醛等抑制物胁迫。构建糠醛、5-羟甲基糠醛等抑制物耐受性提高的菌株，将加速谷氨酸棒杆菌对木质纤维素类可再生生物资源的利用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提高谷氨酸棒杆菌的呋喃醛类（糠醛、5-羟甲基糠醛等）抑制物耐受性。为解决上述技术问题，本发明发掘到两个功能基因，通过降低内源甲酰四氢叶酸脱甲酰酶（formyltetrahydrofolate deformylase）催化活力，包括基因敲除、失活、弱化、表达量降低等，或者突变内源D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶（D-3-phosphoglyceratedehydrogenase）以增强其活性，或者将上述两种方法组合，均可提高谷氨酸棒杆菌的糠醛等抑制物耐受性，其中也可以导入增强活性的外源D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶或过表达了能够达同样的效果。
本发明提供一种提高谷氨酸棒杆菌对呋喃醛类抑制物耐受性或者构建对呋喃醛类抑制物耐受性提高的谷氨酸棒杆菌的方法，其特征在于：通过下述一种或两种方式组合，以获得对抑制物的耐受性提高的重组谷氨酸棒杆菌：
（1）通过降低或消除谷氨酸棒杆菌的内源甲酰四氢叶酸脱甲酰酶催化活力，或者，
（2）突变谷氨酸棒杆菌内源D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶以增强其活性，或者导入外源的突变的D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶基因过表达以增强其活性。
具体实施方式中，所述降低或清除谷氨酸棒杆菌的内源甲酰四氢叶酸脱甲酰酶催化活力通过基因敲除、失活、弱化、表达量降低的基因工程方式实现。
优选地，所述甲酰四氢叶酸脱甲酰酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。更优选地，所述甲酰四氢叶酸脱甲酰酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
具体的，D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶突变体的构建是本领域技术人员可以通过常规方法实现，只要突变后的能够增强的酶活性即可。优选方式中，所述突变谷氨酸棒杆菌内源D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶后的D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或者导入如SEQ ID NO.2所示D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶突变体。更优选地，所述D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶突变体的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
具体地，所述的呋喃醛类抑制物是糠醛、5-羟甲基糠醛。
本发明还进一步提供利用所述的方法获得的重组谷氨酸棒杆菌。
本发明更进一步提供所述的重组谷氨酸棒杆菌在降解或利用木质纤维素原料中的应用。
本发明的一个极具体实施例中，以CorynebacteriumglutamicumATCC 13032为出发菌株，采用同源重组的方法构建。具体步骤如下：
（1）构建重组质粒：以pK18mobsacB质粒作为载体，根据SEQ ID NO.3序列设计用以敲除purU基因的左右同源臂，与载体连接后获得重组质粒pK18mobsacB-△purU；以pK18mobsacB质粒作为载体，根据SEQ ID NO.4序列设计用以突变serA基因的左右同源臂，与载体连接后获得重组质粒pK18mobsacB-serA mutation；
（2）构建重组谷氨酸棒杆菌：将重组质粒pK18mobsacB-△purU电转化至C.glutamicumATCC 13032中，经过两轮交换，获得敲除purU基因的重组谷氨酸棒杆菌，命名为C.glutamicum-F1；将重组质粒pK18mobsacB-serA mutation电转化至C.glutamicumATCC13032中，经过两轮交换，获得serA基因突变的重组谷氨酸棒杆菌，命名为C.glutamicum-F2；将重组质粒pK18mobsacB-serA mutation电转化至C.glutamicum-F1中，经过两轮交换，获得既含purU基因敲除又含serA基因突变的重组谷氨酸棒杆菌，命名为C.glutamicum-F3。
在另一个具体实例中，上述糠醛等抑制物耐受性提高的菌株的构建方法，以C.glutamicumATCC 13032为出发菌株，还可以采用碱基编辑的方法构建。具体步骤如下：
（1）构建重组质粒：以pnCas9(D10A)-AID-gRNA-ccdB TS质粒作为载体，根据SEQ IDNO.3序列设计用以失活purU基因的gRNA序列，与载体连接后获得重组质粒pnCas9(D10A)-AID-gRNA-purU TS；以pnCas9(D10A)-AID-gRNA-ccdB TS质粒作为载体，根据SEQ ID NO.4序列设计用以突变serA基因的gRNA序列，与载体连接后获得重组质粒pnCas9(D10A)-AID-gRNA-serA TS；
（2）构建重组谷氨酸棒杆菌：将重组质粒pnCas9(D10A)-AID-gRNA-purU TS电转化至C.glutamicumATCC 13032中，经过碱基编辑，获得失活purU基因的重组谷氨酸棒杆菌，命名为C.glutamicum-F4；将重组质粒pnCas9(D10A)-AID-gRNA-serA TS电转化至C.glutamicumATCC 13032中，经过碱基编辑，获得serA基因突变的重组谷氨酸棒杆菌，命名为C.glutamicum-F5；将重组质粒pnCas9(D10A)-AID-gRNA-serA TS电转化至C.glutamicum-F4中，经过碱基编辑，获得既含purU基因失活又含serA基因突变的重组谷氨酸棒杆菌，命名为C.glutamicum-F6。
本发明通过将全基因组规模的失活文库在糠醛胁迫的条件下进行筛选，发现的两个功能基因，其中通过降低内源甲酰四氢叶酸脱甲酰酶（formyltetrahydrofolatedeformylase）催化活力，可提高谷氨酸棒杆菌的糠醛等抑制物耐受性；而具有增强的催化活力的D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶突变体可以提高菌株对D-3-磷酸甘油酸盐的催化能力，生成更多的NADH，有利于呋喃醛类抑制物耐受性脱毒。同时，本发明发现上述两种方式之间具有组合效应，能够进一步提高菌株对呋喃醛类抑制物的耐受性。实验表明，与现有技术相比，通过本发明所构建的重组菌均增强了对呋喃醛类抑制物的耐受能力，且对其正常生长未产生明显的影响。如此，本发明为后续高性能工业发酵底盘菌株构建提供参考，有利于谷氨酸棒杆菌以木质纤维素水解液为原料生产生物燃料或其他高附加值化学品。
附图说明
图1：质粒pK18mobsacB-△purU示意图；
图2：质粒pK18mobsacB-serA mutation示意图；
图3：质粒pnCas9(D10A)-AID-gRNA-purU TS示意图；
图4：质粒pnCas9(D10A)-AID-gRNA-serA TS示意图；
图5：本发明中重组菌株与野生菌株在不含糠醛条件下的生长曲线；
图6：本发明中重组菌株与野生菌株在糠醛胁迫条件下的生长曲线；
图7：本发明中D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶突变体与野生型酶活测试。
具体实施方式
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基（g/L）:蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。
LB固体培养基：在LB液体培养基里加入质量体积比为1.5-2.0 %琼脂粉。
LBHIS液体培养基（g/L）:
LBHIS固体培养基：在LBHIS液体培养基里加入质量体积比为1.5-2.0 %琼脂粉。
LAS培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，蔗糖150
LAS固体培养基：在LAS液体培养基里加入质量体积比为1.5-2.0 %琼脂粉。
实施例1敲除purU基因的重组谷氨酸棒杆菌的构建
(1) 以C.glutamicumATCC13032的基因组DNA为模板，根据SEQ ID NO.3序列设计用以敲除purU基因的左右同源臂（各约1kb）及其引物序列，分别进行PCR扩增，产物纯化回收，然后再与酶切过的pK18mobsacB质粒片段进行三片段同源重组连接，将连接产物使用化学转化法导入E. coli DH5α感受态细胞中，涂布至添加Kan抗性的LB固体平板上，37℃培养箱中过夜培养。待单克隆长出后，挑取单克隆接种至添加Kan抗性的LB液体培养基中，取菌液抽提重组质粒，经酶切、测序验证正确后获得重组质粒pK18mobsacB-△purU（图1）。
(2) 将(1)中得到的重组质粒以电穿孔法转化至谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞中，涂布至含Kan抗性的LBHIS固体平板上，30℃培养箱中培养2-3 d进行第一轮筛选，直至长出单克隆。设计第一轮交换验证引物，挑取转化子作为模板，菌落PCR验证质粒与基因组在上游同源臂处是否发生单交换，将具有正确条带的转化子接种至液体LBHIS中，30℃摇床，220 rpm，过夜培养。第二天将菌液适当稀释，涂布至LAS固体平板上，30℃培养箱中培养，进行二轮交换，直至长出单克隆。挑取LAS平板上的单克隆，点板LBHIS固体平板及添加Kan抗性的LBHIS固体平板，30℃培养箱中培养。挑选无法在添加Kan抗性的LBHIS固体平板上生长的单菌落，进行第二轮菌落PCR验证，将PCR条带大小正确的样品，测序验证，将得到的正确敲除purU基因的重组菌株命名为C.glutamicum-F1。
实施例2失活purU基因的重组谷氨酸棒杆菌的构建
(1) 根据SEQ ID NO.3序列设计用以失活purU基因的sgRNA靶标序列（20 bp），根据靶标序列合成两条对应的正义链与反义链引物（各24 bp），该引物包含在5’端引入的与载体配对的缺口序列（4 bp）。通过两条引物退火结合，形成双链DNA，然后再与pnCas9(D10A)-AID-gRNA-ccdB TS载体质粒进行Golden Gate连接，转化E. coliDH5α感受态细胞中，涂布至添加Cm抗性的LB固体平板上，37℃培养箱中过夜培养。待单克隆长出后，挑取单克隆接种至添加Cm抗性的LB液体培养基中，取菌液抽提重组质粒，经酶切、测序验证正确后获得重组质粒pnCas9(D10A)-AID-gRNA-purU TS（图3）。
(2) 将(1)中得到的重组质粒以电穿孔法转化至谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞中，涂布至含Cm抗性的LBHIS固体平板上，30℃培养箱中培养2-3 d，直至长出单克隆。挑选单克隆接种至含Cm抗性的LBHIS液体培养基中，30℃摇床，220 rpm，过夜培养。将新鲜菌液转接至含IPTG（终浓度0.1 mM）及Cm抗性的LBHIS液体培养基，初始OD为0.5，30℃摇床，220 rpm，培养到OD为10。用生理盐水清洗上述菌体2遍，然后用生理盐水重悬菌体，涂布到含Cm抗性的LBHIS固体平板上，30℃培养箱中培养至长出单克隆。以上述单克隆为模板，菌落PCR扩增相应的目标基因片段，通过测序，获得目标编辑菌株。将上述目标菌株通过在37℃下培养，使其丢失编辑质粒，通过点板LBHIS及含Cm抗生素的LBHIS固体平板，获得丢失质粒的编辑菌株，即为最终的重组菌C.glutamicum-F4。
实施例3含serA突变基因的重组谷氨酸棒杆菌的构建
一、通过基于自杀质粒pK18mobsacB双交换的方法构建，步骤如下：
(1) 以C.glutamicumATCC13032的基因组DNA为模板，根据SEQ ID NO.4序列设计用以突变serA基因的左右同源臂（各约1kb）及其引物序列，在引物中引入突变位点（Q184K）序列，分别对左右同源臂进行PCR扩增，产物纯化回收，然后再与酶切过的pK18mobsacB质粒片段进行三片段同源重组连接，将连接产物使用化学转化法导入E. coli DH5α感受态细胞中，涂布至添加Kan抗性的LB固体平板上，37℃培养箱中过夜培养。待单克隆长出后，挑取单克隆接种至添加Kan抗性的LB液体培养基中，取菌液抽提重组质粒，经酶切、测序验证正确后获得重组质粒pK18mobsacB-serA mutation（图2）。其中，相比野生型D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶，serA突变基因编码的D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶酶活得到提高（具体见实施例7）
(2) 将(1)中得到的重组质粒以电穿孔法转化至谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞中，涂布至含Kan抗性的LBHIS固体平板上，30℃培养箱中培养2-3 d进行第一轮筛选，直至长出单克隆。设计第一轮交换验证引物，挑取转化子作为模板，菌落PCR验证质粒与基因组在上游同源臂处是否发生单交换，将具有正确条带的转化子接种至液体LBHIS中，30℃摇床，220 rpm，过夜培养。第二天将菌液适当稀释，涂布至LAS固体平板上，30℃培养箱中培养，进行二轮交换，直至长出单克隆。挑取LAS平板上的单克隆，点板LBHIS固体平板及添加Kan抗性的LBHIS固体平板，30℃培养箱中培养。挑选无法在添加Kan抗性的LBHIS固体平板上生长的单菌落，进行第二轮菌落PCR验证，将PCR条带大小正确的样品，测序验证，将得到的正确突变serA基因的重组菌株命名为C.glutamicum-F2。
二、通过碱基编辑的方法构建，步骤如下：
(1) 根据SEQ ID NO.4序列设计用以突变serA基因的sgRNA靶标序列（GGCTCAGCTGAACGTTGAGT），其中下划线标注的CAG为要编辑的目标密码子（野生型序列），通过碱基编辑的方法会被编辑为AAG（突变体序列）。根据靶标序列合成两条对应的正义链与反义链引物（各24 bp），该引物包含在5’端引入的与载体配对的缺口序列（4 bp）。通过两条引物退火结合，形成双链DNA，然后再与pnCas9(D10A)-AID-gRNA-ccdB TS载体质粒进行Golden Gate连接，转化E. coliDH5α感受态细胞中，涂布至添加Cm抗性的LB固体平板上，37℃培养箱中过夜培养。待单克隆长出后，挑取单克隆接种至添加Cm抗性的LB液体培养基中，取菌液抽提重组质粒，经酶切、测序验证正确后获得重组质粒pnCas9(D10A)-AID-gRNA-serA TS（图4）。
(2) 将(1)中得到的重组质粒以电穿孔法转化至谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞中，涂布至含Cm抗性的LBHIS固体平板上，30℃培养箱中培养2-3 d，直至长出单克隆。挑选单克隆接种至含Cm抗性的LBHIS液体培养基中，30℃摇床，220 rpm，过夜培养。将新鲜菌液转接至含IPTG（终浓度0.1 mM）及Cm抗性的LBHIS液体培养基，初始OD为0.5，30℃摇床，220 rpm，培养到OD为10。用生理盐水清洗上述菌体2遍，然后用生理盐水重悬菌体，涂布到含Cm抗性的LBHIS固体平板上，30℃培养箱中培养至长出单克隆。以上述单克隆为模板，菌落PCR扩增相应的目标基因片段，通过测序，获得目标编辑菌株。将上述目标菌株通过在37℃下培养，使其丢失编辑质粒，通过点板LBHIS及含Cm抗生素的LBHIS固体平板，获得丢失质粒的编辑菌株，即为最终的重组菌C. glutamicum-F5。
实施例4组合purU基因敲除及serA基因突变的重组谷氨酸棒杆菌的构建
准备C.glutamicum-F1的感受态细胞，将重组质粒pK18mobsacB-serA mutation以电穿孔法转化至C.glutamicum-F1感受态细胞中，涂布至含Kan抗性的LBHIS固体平板上，30℃培养箱中培养2-3 d进行第一轮筛选，直至长出单克隆。设计第一轮交换验证引物，挑取转化子作为模板，菌落PCR验证质粒与基因组在上游同源臂处是否发生单交换，将具有正确条带的转化子接种至液体LBHIS中，30℃摇床，220 rpm，过夜培养。第二天将菌液适当稀释，涂布至LAS固体平板上，30℃培养箱中培养，进行二轮交换，直至长出单克隆。挑取LAS平板上的单克隆，点板LBHIS固体平板及添加Kan抗性的LBHIS固体平板，30℃培养箱中培养。挑选无法在添加Kan抗性的LBHIS固体平板上生长的单菌落，进行第二轮菌落PCR验证，将PCR条带大小正确的样品，测序验证，将得到的正确重组菌株命名为C.glutamicum-F3。
实施例5组合purU基因失活及serA基因突变的重组谷氨酸棒杆菌的构建
将重组质粒pnCas9(D10A)-AID-gRNA-serA TS以电穿孔法转化至C.glutamicum-F4感受态细胞中，涂布至含Cm抗性的LBHIS固体平板上，30℃培养箱中培养2-3 d，直至长出单克隆。挑选单克隆接种至含Cm抗性的LBHIS液体培养基中，30℃摇床，220 rpm，过夜培养。将新鲜菌液转接至含IPTG（终浓度0.1 mM）及Cm抗性的LBHIS液体培养基，初始OD为0.5，30℃摇床，220 rpm，培养到OD为10。用生理盐水清洗上述菌体2遍，然后用生理盐水重悬菌体，涂布到含Cm抗性的LBHIS固体平板上，30℃培养箱中培养至长出单克隆。以上述单克隆为模板，菌落PCR扩增相应的目标基因片段，通过测序，获得目标编辑菌株。将上述目标菌株通过在37℃下培养，使其丢失编辑质粒，通过点板LBHIS及含Cm抗生素的LBHIS固体平板，获得丢失质粒的编辑菌株，即为最终的重组菌C. glutamicum-F6。
实施例6比较不同菌株在糠醛胁迫条件下的生长曲线
(1) 种子培养：分别将C.glutamicum-F1，C.glutamicum-F2，C.glutamicum-F3，C.glutamicum-F4，C.glutamicum-F5，C.glutamicum-F6及对照野生型菌株C.glutamicumATCC13032接种至LBHIS液体培养基中，30℃摇床，220 rpm转速，过夜培养。每种菌株设置三个平行。
(2) 生长曲线测试：将上述种子液以2%的接种量分别接种至含LBHIS液体培养基或添加20 mM糠醛的LBHIS液体培养基的48孔板中，置于全自动生长曲线测试仪中，在30℃，800 rpm转速下，每间隔1 h测量一次菌体OD600，培养时间为60 h。
结果表明：在不添加糠醛的培养条件下，相比野生型菌株C.glutamicumATCC13032，各重组菌株均未表现出生长优势（见图5，其中需要说明的是，因为有6株重组菌，放在一个图中看不清楚各曲线，所以就拆分成左右两个图，每三株菌和一个对照菌即野生型菌株C.glutamicumATCC 13032放在一个图中）。
而在糠醛胁迫的培养条件下，敲除或失活purU基因的重组菌株（C.glutamicum-F1，C.glutamicum-F4）以及含serA突变基因的重组菌株（C.glutamicum-F2，C.glutamicum-F5），相比野生型菌株均表现出生长优势，在培养20 h后，重组菌的生物量（OD600）约为对照菌的1.3倍。组合purU基因敲除或失活及serA基因突变的重组菌株（C.glutamicum-F3，C.glutamicum-F6），相比单一方式的重组菌株，生长优势进一步增强，在培养20 h后，组合突变的重组菌的生物量（OD600）约为对照菌的1.9倍，说明两种突变具有叠加效果（图6，其中需要说明的是，因为有6株重组菌，放在一个图中看不清楚各曲线，所以就拆分成左右两个图，每三株菌和一个对照菌即野生型菌株C.glutamicumATCC 13032放在一个图中）。
实施例7 serA突变基因编码蛋白的异源表达、纯化及酶活检测
(1) 蛋白的异源表达：分别以C. glutamicum ATCC 13032或C.glutamicum-F2的基因组DNA为模板，设计引物，PCR扩增serA及serA突变基因，并在起始密码子后添加His标签，与酶切后的pET28a质粒连接。连接产物转化至E. coli DH5α感受态细胞中。经过质粒酶切、测序验证后，将正确的重组质粒分别命名为pET28a-serA及pET28a-serA mutation。将重组质粒转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,得到相应的重组菌。将上述重组菌接种至添加Kan抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床，220 rpm转速，过夜培养。次日以1%接种量转接至新鲜培养基中，37℃，220 rpm继续培养。在OD长到0.6-0.8时，添加IPTG诱导剂，终浓度为0.5 mM，并将温度调为20℃，220 rpm转速下培养24 h，收集菌体，放置冰上。
(2) 蛋白纯化：将收集的菌体用预冷的20 mM Tris-HClbuffer-500 mM NaCl（pH7.5）洗涤两次，然后再用该缓冲液重悬菌体。将上述重悬液置于冰水中，进行超声破碎，工作2s，间隔4s，工作总时间为30-40 min。在12000 rpm转速下离心20min收集上清液，即为蛋白表达的粗酶液。将上述粗酶液采用镍柱亲和层析方法，首先将粗酶液与葡聚糖镍混合均匀后放入试管中，在4℃下结合至少2h，在此过程中需要不断上下翻转。然后缓慢滤出上清液，用含50 mM咪唑的洗杂缓冲液重复多次洗脱杂蛋白，用含500 mM咪唑的洗脱液将目标蛋白洗脱下来，最后将洗脱下来的蛋白进行浓缩并置换咪唑，最终保存在含10%甘油的20mM Tris-HCl buffer-500 mM NaCl（pH7.5）缓冲液中。采用SDS-PAGE凝胶电泳分析蛋白的表达情况，采用Easy II Protein Quantitative Kit (BCA)蛋白定量试剂盒对蛋白浓度进行定量。
(3 )酶活检测：1ml的反应体系包含100 mM Tris-HCl（pH 7.5），1 mM二硫苏糖醇，5 mM EDTA-Na2，2 mg/ml NAD，纯酶300 μg，反应以添加15 mM的3-磷酸甘油酸二钠开始，340 nm吸光度下检测10 min，反应在室温下进行。
实验结果表明：相比野生型D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶，serA突变基因编码的D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶酶活得到提高，提高约1倍（图7）。
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种提高谷氨酸棒杆菌对抑制物耐受性的方法
<160> 4
<210> 1
<211> 304
<212> PRT
<213> Corynebacteriumglutamicum
<400> 1
MTPSSPEVRNRPSAAPEERQFVLTFGCPDSTGIVAKLSSFLAERGGWITEAGYFTDPDSNWFFTRQAIRAESIDTTIEQLREEFAPLAEEFGPRAKWSFTDTAQVKKAVLLVSKEGHCLHDLLGRVAENDYPMEVVAVVGNHENLRYIAENHNVPFFHVPFPKDAVGKRKAFDQVAEIVNGYDPDAIVLARFMQILPPDLCEMWAGRVLNIHHSFLPSFMGARPYHQAYSRGVKLIGATCHYATGDLDDGPIIEQDVIRVTHKDTPTEMQRLGRDAEKQVLARGLRFHLEDRVLVYGNRTVVFD 304
<210> 2
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
MSQNGRPVVLIADKLAQSTVDALGDAVEVRWVDGPNRPELLDAVKEADALLVRSATTVDAEVIAAAPNLKIVGRAGVGLDNVDIPAATEAGVMVANAPTSNIHSACEHAISLLLSTARQIPAADATLREGEWKRSSFNGVEIFGKTVGIVGFGHIGQLFAQRLAAFETTIVAYDPYANPARAAKLNVELVELDELMSRSDFVTIHLPKTKETAGMFDAQLLAKSKKGQIIINAARGGLVDEQALADAIESGHIRGAGFDVYSTEPCTDSPLFKLPQVVVTPHLGASTEEAQDRAGTDVADSVLKALAGEFVADAVNVSGGRVGEEVAVWMDLARKLGLLAGKLVDAAPVSIEVEARGELSSEQVDALGLSAVRGLFSGIIEESVTFVNAPRIAEERGLDISVKTNSESVTHRSVLQVKVITGSGASATVVGALTGLERVEKITRINGRGLDLRAEGLNLFLQYTDAPGALGTVGTKLGAAGINIEAAALTQAEKGDGAVLILRVESAVSEELEAEINAELGATSFQVDLD 530
<210> 3
<211> 915
<212> DNA
<213> Corynebacteriumglutamicum
<400> 3
atgaccccgagttctcctgaagttcgtaatcgtccgagcgctgcgcctgaagagcgtcagtttgtgctcacttttggctgccctgactccactggaattgtggcgaagttgtcgtcgttcctagctgagcgtgggggttggattactgaggctggatatttcacggatcctgattcgaattggttctttactcgtcaggcgattcgcgctgagtcgattgataccacgattgagcagttgcgggaggagttcgctccgcttgcggaggagttcggcccgagggctaagtggagtttcactgacactgcgcaggtgaagaaggctgtgttgttggtgtctaaggagggccactgcttgcacgatttgttaggtcgtgtggctgagaatgattatccgatggaagttgttgcggttgtgggtaaccatgagaacttgcgttatattgcggagaaccataatgttccgtttttccatgtgccgtttcctaaggatgcggttggtaagcggaaggcgtttgaccaggtcgctgagattgtgaatggttatgatccggatgcgattgttttggctcgttttatgcagattttgccgccggatttgtgtgagatgtgggctggtcgtgtgttgaatattcatcacagtttcttgccgtcgtttatgggtgcgcgcccgtatcatcaggcgtatagccgtggtgtgaagttgattggtgcgacctgccattatgcgactggggatctggatgatggtccgatcattgagcaggatgttattcgtgtgacgcataaggatacgccgactgagatgcagcgtttgggccgcgatgcggagaagcaggtgctggctcgcggtttgcgtttccacttggaggaccgggtgctggtttacggtaaccgcacggttgtctttgattaa 915
<210> 4
<211> 1593
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtgagccagaatggccgtccggtagtcctcatcgccgataagcttgcgcagtccactgttgacgcgcttggagatgcagtagaagtccgttgggttgacggacctaaccgcccagaactgcttgatgcagttaaggaagcggacgcactgctcgtgcgttctgctaccactgtcgatgctgaagtcatcgccgctgcccctaacttgaagatcgtcggtcgtgccggcgtgggcttggacaacgttgacatccctgctgccactgaagctggcgtcatggttgctaacgcaccgacctctaatattcactccgcttgtgagcacgcaatttctttgctgctgtctactgctcgccagatccctgctgctgatgcgacgctgcgtgagggcgagtggaagcggtcttctttcaacggtgtggaaattttcggaaaaactgtcggtatcgtcggttttggccacattggtcagttgtttgctcagcgtcttgctgcgtttgagaccaccattgttgcttacgatccttacgctaaccctgctcgtgcggctaagctgaacgttgagttggttgagttggatgagctgatgagccgttctgactttgtcaccattcaccttcctaagaccaaggaaactgctggcatgtttgatgcgcagctccttgctaagtccaagaagggccagatcatcatcaacgctgctcgtggtggccttgttgatgagcaggctttggctgatgcgattgagtccggtcacattcgtggcgctggtttcgatgtgtactccaccgagccttgcactgattctcctttgttcaagttgcctcaggttgttgtgactcctcacttgggtgcttctactgaagaggctcaggatcgtgcgggtactgacgttgctgattctgtgctcaaggcgctggctggcgagttcgtggcggatgctgtgaacgtttccggtggtcgcgtgggcgaagaggttgctgtgtggatggatctggctcgcaagcttggtcttcttgctggcaagcttgtcgacgccgccccagtctccattgaggttgaggctcgaggcgagctttcttccgagcaggtcgatgcacttggtttgtccgctgttcgtggtttgttctccggaattatcgaagagtccgttactttcgtcaacgctcctcgcattgctgaagagcgtggcctggacatctccgtgaagaccaactctgagtctgttactcaccgttccgtcctgcaggtcaaggtcattactggcagcggcgcgagcgcaactgttgttggtgccctgactggtcttgagcgcgttgagaagatcacccgcatcaatggccgtggcctggatctgcgcgcagagggtctgaacctcttcctgcagtacactgacgctcctggtgcactgggtaccgttggtaccaagctgggtgctgctggcatcaacatcgaggctgctgcgttgactcaggctgagaagggtgacggcgctgtcctgatcctgcgtgttgagtccgctgtctctgaagagctggaagctgaaatcaacgctgagttgggtgctacttccttccaggttgatcttgactaa1593

Claims (9)

1.一种提高谷氨酸棒杆菌对呋喃醛类抑制物耐受性或者构建对呋喃醛类抑制物耐受性提高的谷氨酸棒杆菌的方法，其特征在于：通过下述一种或两种方式组合，以获得对抑制物的耐受性提高的重组谷氨酸棒杆菌：
（1）通过降低或消除谷氨酸棒杆菌的内源甲酰四氢叶酸脱甲酰酶催化活力，或者，
（2）突变谷氨酸棒杆菌内源D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶以增强其活性，或者导入外源的突变的D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶基因过表达以增强其活性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述降低或消除谷氨酸棒杆菌的内源甲酰四氢叶酸脱甲酰酶催化活力通过基因敲除、失活、弱化、表达量降低的基因工程方式实现。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲酰四氢叶酸脱甲酰酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述甲酰四氢叶酸脱甲酰酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变谷氨酸棒杆菌内源D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶后的D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或者导入如SEQ ID NO.2所示D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶突变体。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述D-3-磷酸甘油酸盐脱氢酶突变体的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
7.如权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于，所述的抑制物是糠醛、5-羟甲基糠醛。
8.利用如权利要求1至7任一项所述的方法获得的重组谷氨酸棒杆菌。
9.如权利要求8所述的重组谷氨酸棒杆菌在降解或利用木质纤维素原料中的应用。
CN202210296227.XA 2022-03-24 2022-03-24 一种提高谷氨酸棒杆菌对抑制物耐受性的方法 Active CN114381417B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210296227.XA CN114381417B (zh) 2022-03-24 2022-03-24 一种提高谷氨酸棒杆菌对抑制物耐受性的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210296227.XA CN114381417B (zh) 2022-03-24 2022-03-24 一种提高谷氨酸棒杆菌对抑制物耐受性的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114381417A true CN114381417A (zh) 2022-04-22
CN114381417B CN114381417B (zh) 2022-06-24

Family

ID=81204814

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210296227.XA Active CN114381417B (zh) 2022-03-24 2022-03-24 一种提高谷氨酸棒杆菌对抑制物耐受性的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114381417B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104411821A (zh) * 2012-06-18 2015-03-11 代谢探索者公司 用于发酵生产甲硫氨酸的重组微生物
CN104862352A (zh) * 2010-10-20 2015-08-26 Cj第一制糖株式会社 生产o-磷酸丝氨酸的微生物和使用该微生物由o-磷酸丝氨酸生产l-半胱氨酸或其衍生物的方法
CN109652351A (zh) * 2018-12-18 2019-04-19 江南大学 一种高产5-甲基四氢叶酸重组枯草芽孢杆菌及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104862352A (zh) * 2010-10-20 2015-08-26 Cj第一制糖株式会社 生产o-磷酸丝氨酸的微生物和使用该微生物由o-磷酸丝氨酸生产l-半胱氨酸或其衍生物的方法
CN104411821A (zh) * 2012-06-18 2015-03-11 代谢探索者公司 用于发酵生产甲硫氨酸的重组微生物
CN109652351A (zh) * 2018-12-18 2019-04-19 江南大学 一种高产5-甲基四氢叶酸重组枯草芽孢杆菌及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PETER L. NAGY ET AL.: "purU, a Source of Formate for purT-Dependent Phosphoribosyl-N-Formylglycinamide Synthesis", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 *
邓辉等: "大肠杆菌磷酸甘油酸脱氢酶突变体的构建及抗反馈抑制效应", 《生物工程学报》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114381417B (zh) 2022-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5907865B2 (ja) 改善されたアラビノース資化能を有するザイモモナス（ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）
US5798237A (en) Recombinant lactobacillus for fermentation of xylose to lactic acid and lactate
CN105420154B (zh) 双基因敲除重组红球菌、构建方法及其应用
CN110699394B (zh) 一种生产1,5-戊二胺的生物转化法
CN111500517B (zh) 产l-乳酸的重组菌株及其构建方法和发酵产l-乳酸的方法及应用
US6107093A (en) Recombinant cells that highly express chromosomally-integrated heterologous genes
US20070172937A1 (en) Recombinant cells that highly express chromosomally-integrated heterologous genes
CN104630100A (zh) 改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其生产r-乙偶姻的应用
AU668677B2 (en) Recombinant cells that highly express chromosomally-integrated heterologous genes
CN112126615B (zh) 一种产丁酸的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用
CN112375723B (zh) 生产马来酸的工程菌及其构建方法和应用
CN114381417B (zh) 一种提高谷氨酸棒杆菌对抑制物耐受性的方法
CN113234611B (zh) 酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用
CN116121160A (zh) 过表达pyrB基因的基因工程菌及其生产L-精氨酸的方法
CN111575221B (zh) 一种基于PNTs的生产灵菌红素的方法
Su et al. Development and application of a novel screening method and experimental use of the mutant bacterial strain Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 for production of butanol via fermentation of fresh cassava
CN114015634B (zh) 高产琥珀酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用
CN117106836B (zh) 磷脂酰甘油磷酸酶编码基因在发酵生产胞苷中的应用
CN113817761B (zh) 一种无三羧酸循环的大肠杆菌底盘菌及其构建方法与应用
US20240018556A1 (en) Acid tolerant clostridia
CN116004496A (zh) 一种生产透明质酸的基因工程菌及其应用
CN117070542A (zh) 一种半纤维素降解酶系共表达菌株及其构建方法与应用
CN117946228A (zh) Cey17_04535突变体及其应用
CN118109333A (zh) 一株高产耐热谷氨酰胺转氨酶的茂原链霉菌菌株
CN116536292A (zh) 磷酸葡萄糖酸脱水酶突变体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant