JPH0819393A - β−ガラクトシダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 糖転移能の高い新規なβ−ガラクトシダー
ゼ、特にステビオシドに対する糖転移能の高いβ−ガラ
クトシダーゼを提供する。 【構成】 クレブシエラ属に属する細菌、例えばクレブ
シエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）Ａ−５３
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２６３）を培養し、その培養物よ
り分離、精製することにより得られるβ−ガラクトシダ
ーゼであって、ｐＨ６．５〜７．５（４０℃で６０分間
処理）で安定であり、β−Ｄ−ガラクトシド結合を加水
分解するとともに、分解して生成したＤ−ガラクトース
を転移する分子量約３２万のβ−ガラクトシターゼ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、新規なβ−ガラクト
シダーゼに関するものである。さらに詳しくは、この発
明は、各種食品や医薬品の製造に有用な新規なβ−ガラ
クトシターゼに関するものである。

【０００２】

【従来の技術とその課題】β−ガラクトシダーゼは、β
−Ｄ−ガラクトシド結合を加水分解してＤ−ガラクトー
スを遊離する酵素で、生物界に広く存在している。これ
まで、酵母、カビ、細菌等由来のβ−ガラクトシダーゼ
が広く研究されており、食品、医薬品用に利用されてい
る。また、β−ガラクトシダーゼは加水分解と同時にガ
ラクトシド結合を転移させる能力をも有しており、その
Ｄ−ガラクトース基転移能を利用したアスコルビン酸−
Ｄ−ガラクトシル誘導体の製造に利用されている。具体
的には、Ｌ−アスコルビン酸とラクトースまたはラクト
ース含有物との混合物にアスペルギルス・オリーゼ（As
pergillus oryzae）、エッシェリキア・コリ（Escheric
hia coli）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus ni
ger）等の微生物由来の酵素、牛肝臓等の動物由来の酵
素、ジャック・ビーンズ（Jack beans）等の植物種子由
来の酵素を処理して６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ル−Ｌ−アスコルビン酸を製造する方法（特開平２−３
１１４９０号公報）が知られている。

【０００３】さらに、β−ガラクトシダーゼはガラクト
オリゴ糖の製造にも利用されている。すなわち、アスペ
ルギルス・オリーゼが生産したβ−ガラクトシダーゼで
ラクトースを処理することにより、一般式Ｇａｌ−（Ｇ
ａｌ）n −Ｇｌｃ（但し式中Ｇａｌはガラクトース残
基、Ｇｌｃはグルコース残基、ｎは１〜４の整数を、そ
れぞれ表わす）で示されるガラクトオリゴ糖が得られ、
このようにして製造されたガラクトオリゴ糖はビフィド
バクテリウム菌の増殖因子として用いられている（特開
昭５５−１０４８８５号公報）。

【０００４】上記のほかにもβ−ガラクトシダーゼの転
移作用によるＤ−ガラクトース基転移物の生成が多く報
告されている。しかしながら、従来報告されているβ−
ガラクトシターゼの多くは、Ｄ−ガラクトース基転移率
が悪く、収量が低いため糖転移物の大量生産に用いるに
は不適当なものであった。

【０００５】特に、甘味料として利用されているステビ
オシドは、そのままでは味質が余りよくないが、ステビ
オシドにＤ−ガラクトース基を転移することにより味質
が向上し、甘味料としての性質がよりよくなることが知
られている。しかし、ステビオシドに対してＤ−ガラク
トース基転移能の高いβ−ガラクトシダーゼが見つかっ
ていなかったため、工業的に生産することはできなかっ
た。

【０００６】この発明は、以上の通りの事情に鑑みてな
されたものであり、糖転移能の高いβ−ガラクトシダー
ゼ、特にステビオシドに対する糖転移能の高い新規なβ
−ガラクトシダーゼを提供することを目的としている。

【０００７】

【課題を解決するための手段】この発明の発明者らは、
Ｄ−ガラクトース基転移能を有する各種のβ−ガラクト
シダーゼについて鋭意研究した結果、クレブシエラ（Kl
ebsiella）属に属する細菌が、β−１，４ガラクトシド
結合を有するＤ−ガラクトース基転移物を主に生成する
転移作用の強いβ−ガラクトシダーゼを生産することを
見いだし、そのβ−ガラクトシダーゼを精製し、性質を
調べることにより、この発明を完成させた。

【０００８】すなわち、この発明は、以下の理化学的性
質、 １）作用：β−Ｄ−ガラクトシド結合を加水分解すると
ともに、分解して生成したＤ−ガラクトース基を転移す
る、 ２）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：至適ｐＨがｐＨ７．
０〜７．５であって、ｐＨ６．５〜７．５（４０℃で６
０分間処理）で安定である、 ３）作用適温の範囲：３０〜４０℃である， ４）分子量：ゲル濾過法による測定で約３２万である、 を有することを特徴とするβ−ガラクトシターゼを提供
する。

【０００９】また、この発明は、クレブシエラ（Klebsi
ella）属に属する細菌が生産するβ−ガラクトシターゼ
であって、上記の理化学的性質を有するβ−ガラクトシ
ターゼを提供する。さらにこの発明は、上記のβ−ガラ
クトシダーゼを酸性する細菌としてクレブシエラ・オキ
シトカ(Klebesiella oxytoca) Ａ−５３（ＦＥＲＭ Ｐ
−１４２６３）をも提供する。

【００１０】以下、この発明を詳細に説明する。まず、
この発明のβ−ガラクトシダーゼの理化学的性質を示
す。 （１）作用および基質特異性 β−ガラクトシド結合を有するラクトース、Ｏ−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下、ＯＮＰ
Ｇと略記する。）等のβ−Ｄ−ガラクトピラノシル誘導
体に作用し、そのβ−ガラクトシド結合を加水分解し
て、ガラクトースとグルコース、ガラクトースとＯ−ニ
トロフェノール等に分解すると同時に、生成したＤ−ガ
ラクトース基を転移する。 （２）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 ＯＮＰＧを基質として各ｐＨのリン酸緩衝液中で４０℃
で１０分間反応させた結果、図１に示すとおり、至適ｐ
ＨはｐＨ７．０〜７．５であった。また、各ｐＨのリン
酸緩衝液中で４０℃で６０分間インキュベートした後の
残存活性を測定した結果、図２に示すとおり、ｐＨ６．
５〜７．５の範囲で９０％以上の残存活性を示した。た
だし、ｐＨ８．０以上の条件ではホウ酸−水酸化ナトリ
ウム緩衝液を、ｐＨ６．５以下の条件ではクエン酸−水
酸化ナトリウム緩衝液を使用した。 図１は、この発明
の酵素の酵素活性に対するｐＨの影響を示すグラフであ
り、縦軸に酵素活性を、横軸にｐＨを示している。な
お、酵素活性は測定値が最高値を示したとき（ｐＨ７．
０）の活性を１００とした相対活性率で表した。また、
図２は、この発明の酵素の安定性に対するｐＨの影響を
示すグラフであり、縦軸に残存活性を、横軸にｐＨを示
しており、残存活性は測定値が最高値を示したとき（ｐ
Ｈ６．５）の活性を１００とした相対活性率で表した。 （３）作用適温の範囲 ＯＮＰＧを基質としてリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中で
各温度において１０分間反応させた結果、図３に示すと
おり、作用適温の範囲は３０〜４０℃であった。図３
は、この発明の酵素の活性に対する温度の影響を示すグ
ラフであり、縦軸に酵素活性を、横軸に温度を示してお
り、酵素活性は４０℃での測定値を１００とした相対活
性率で表した。 （４）分子量 分子量（ＭＷ）は、セファクリルＳ−４００ＨＲ（ファ
ルマシア社製）のカラムを使用したゲルろ過法によって
測定したところ、約３２万であった。分子量既知の試料
としては、アルドラーゼ（ＭＷ１５８０００）、カタラ
ーゼ（ＭＷ２３２０００）、フェリチン（ＭＷ４４００
００）、チログロブリン（ＭＷ６６９０００）を使用し
た。平衡化および溶出は、１００ｍＭの塩化ナトリウム
および５Ｗ／Ｖ％のグリセリンを含む１００ｍＭのリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて室温で、流速
１ミリリットル／分で行った。 （５）ｐＨによる失活 ｐＨ５．０以下またはｐＨ９．５以上の範囲で４０℃で
１時間保つことにより失活する。 （６）阻害および活性化 ＯＮＰＧを基質として各種試薬を所定濃度（金属イオン
１ｍＭ、アルコール６．２５Ｖ／Ｖ％）添加し、各種イ
オンおよびアルコールの活性に対する影響を調べた。結
果は表１に示したとおりである。

【００１１】

【表１】

【００１２】表１に示すとおり、このβ−ガラクトシタ
ーゼは、銀イオン、銅イオン、ブチルアルコールにより
阻害され、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、カ
ルシウムイオン、亜鉛イオン、メチルアルコールにより
活性化される。次に、この発明のβ−ガラクトシターゼ
の製造方法について説明する。この発明のβ−ガラクト
シダーゼを得るには、クレブシエラ属に属する細菌を培
養し、その培養物より目的とする酵素を採取すればよ
い。その具体的菌株として、クレブシエラ・オキシトカ
（Klebsiella oxytoca）Ａ−５３〔以下、Ａ−５３と略
記する。（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２６３）〕が挙げられ
る。

【００１３】このＡ−５３菌学的性質は次の通りであ
る。 （ａ） 形態的性質 １）細胞の形および大きさ 桿菌 長さ0.6 〜6.0 μm ×幅0.3 〜1.0 μm ２）細胞の多形成の有無 無 ３）運動性の有無 無 ４）胞子の有無 無 （ｂ） 培養的性質 １）肉汁寒天平板培養 白色で光沢のあるコロニーを形成する。

【００１４】 拡散性色素は生成しない。 ２）肉汁液体培養 特に表面発育は見られず、培地の懸濁も 見られない。 ３）肉汁ゼラチン穿刺培養 ゼラチンを液化しない。 （ｃ） 生理学的性質 １）グラム染色性 − ２）硝酸塩の還元 ＋ ３）ＭＲテスト − ４）ＶＰテスト ＋ ５）インドールの生成 ＋ ６）硫化水素の生成 − ７）デンプンの加水分解 ＋ ８）クエン酸の利用 ＋ ９）無機窒素源の利用 ＋ 10）色素の生成 − 11）ウレアーゼ − 12）オキシダーゼ − 13）カタラーゼ ＋ 14）生育の範囲 １０〜４０℃、ｐＨ６〜１０ 15）酸素に対する態度 好気性 16）Ｏ−Ｆテスト Ｆ 17）糖類から酸およびガスの生成の有無 １）L-アラビノース ＋ ２）D-キシロース ＋ ３）D-グルコース ＋ ４）D-マンノース ＋ ５）マルトース ＋ ６）シュークロース ＋ ７）ラクトース ＋ ８）トレハロース ＋ ９）D-ソルビトール ＋ 10）D-マンニトール ＋ 11）イノシトール ＋ 12）デンプン ＋ 13）ラムノース ＋ 14）メリビオース ＋ 15）アミグダリン ＋ （ｄ） その他諸性質 １）グルコン酸の酸化 − ２）エクスリンの分解 ＋ ３）アルギニンの分解 − ４）リジンの脱炭酸反応 ＋ ５）オルニチンの脱炭酸反応 − ６）フェニルアラニンの脱アミノ酸反応 − ７）シアン化カリウムの耐性 ＋ ８）トリプトファンの脱アミノ酸反応 − 以上の同定試験結果から、Ａ−５３株はクラブシエラ・
オキシトカと同定された。

【００１５】この他にも、Ａ−５３株の自然的および人
工的変異株は勿論、クラブシエラ属に属する菌種でβ−
ガラクトシダーゼ産生能を有する細菌はすべてこの発明
において使用することができる。また、それらのβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子を組み入れた組換え微生物も生産
菌として使用できるものと期待される。これらの菌株の
培養には一般によく用いられる培地を使用することがで
きる。具体的には、炭素源としては、ブドウ糖、乳糖、
でんぷん、糖蜜等の糖類が使用できる。また窒素源とし
ては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等の有機の窒素
源と共に塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機
の窒素源も使用することができる。また、必要に応じて
ビタミン、ミネラルを添加してもよい。さらにβ−ガラ
クトシダーゼ生産性を上げるために、イソプロピル−β
−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド等の誘導物質を添加し
てもよい。

【００１６】培養条件としては、好気培養が採用され、
例えば培養温度２０〜４０℃、培養液のｐＨは２〜１０
の範囲内で、１〜１２時間培養することにより菌体を得
ることができる。さらに、新鮮な培地を一定速度で供給
しながら培養する連続培養法も適用できる。培地および
培養条件は上記の条件に応じて適宜選定することが可能
であることは言うまでもない。

【００１７】このように培養して得られる培養液から、
ろ過あるいは遠心分離等の常法によって菌体を得る。こ
のようにして得られる菌体を、例えば、ホモジナイザ
ー、ブレンダー、音波処理装置、加圧型細胞破壊装置等
を用いて菌体破砕処理を行うことにより粗酵素液を得る
ことができる。さらにゲルろ過クロマトグラフィー（例
えば、樹脂はファルマシア社製）、イオン交換クロマト
グラフィー（例えば、樹脂はファルマシア社製）、疎水
クロマトグラフィー（例えば、樹脂はトーソー社製）、
高速液体クロマトグラフィー（例えば、カラムはウォー
ターズ社製）等の適当な分離精製方法によりβ−ガラク
トシダーゼ精製酵素を得ることができる。

【００１８】

【実施例】以下、実施例を示してこの発明についてさら
に詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に
限定されるものではない。なお、以下の例において％は
Ｗ／Ｖ％を表す。また、β−ガラクトシダーゼの活性
は、ＯＮＰＧに対する加水分解力の測定による値で示し
た。すなわち、５ｍＭのＯＮＰＧ０．２５ミリリットル
を含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
２）０．７４ミリリットルに、酵素液０．０１ミリリッ
トルを加えて４０℃で１０分間反応させた後、１．０Ｍ
のＮａ₂ ＣＯ₃ ０．２５ミリリットルを加えて反応を停
止させ、生成したＯ−ニトロフェノールを波長４２０ｎ
ｍにおける吸収により測定した。１分間に１μモルのＯ
ＮＰＧを分解する酵素量を１ユニット（Ｕ）とした。 実施例１ クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）Ａ−
５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２６３）を酵母エキス０．５
％、ペプトン１．０％、塩化ナトリウム１．０％からな
る液体培地に接種し、３０℃で、１６時間前培養した
後、培養液１．８ミリリットルを１ｍＭのＩＰＴＧを含
む同培地１８０ミリリットルに植菌し、３０℃で９時間
培養した。

【００１９】この培養液を遠心分離し、得られた菌体の
３０ｇを１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
２）に懸濁し、超音波破砕により菌体を破砕した後に遠
心分離（２００００ｇで６０分間）して粗β−ガラクト
シダーゼ液を得た。この粗β−ガラクトシダーゼ液は、
総活性３９００Ｕ、総タンパク質１４３００ｍｇであっ
た。 実施例２ 実施例１で得た粗β−ガラクトシダーゼ液を出発原料と
して、（１）ＤＥＡＥ−セファロースファストフロー
（ファルマシア社製）による精製、（２）ブチルトヨパ
ール（東ソー社製）による精製、（３）ＤＥＡＥ−セフ
ァロースファストフローによる再精製を順次行い、酵素
標品を得た。

【００２０】以下各精製工程について詳述し、併せて、
各精製工程における酵素の総活性、総タンパク質、比活
性、回収率を示す。 （１）ＤＥＡＥ−セファロースファストフローによる精
製 実施例１で得た粗酵素液１２０ミリリットルを１００ｍ
Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化した
ＤＥＡＥ−セファロースファストフローのカラム（直径
３．６×１０ｃｍ）に通塔して酵素を吸着させ、１００
ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）２００ミリリ
ットルで洗浄した後、塩化ナトリウムの直線勾配（０〜
５００ｍＭ）で溶出し、β−ガラクトシダーゼ活性画分
１４ミリリットルを回収した。

【００２１】この精製段階の酵素液は、総活性１８００
Ｕ、総タンパク質６５４ｍｇ、比活性２．７４Ｕ／ｍ
ｇ、回収率４６．２％であった。 （２）ブチルトヨパールによる精製 上記（１）で得た粗酵素液１４ミリリットルに０．５Ｍ
となるように硫酸アンモニウムを加え、０．５Ｍ硫酸ア
ンモニウムを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．２）で平衡化したブチルトヨパールのカラム
（直径１．６×１５ｃｍ）に通塔して酵素を吸着させ、
０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む１００ｍＭのリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄後、硫酸アンモニウ
ムの直線勾配（５００ｍＭ〜０ｍＭ）で溶出し、β−ガ
ラクトシダーゼ活性画分を回収した。この溶液に硫酸ア
ンモニウムを終濃度が６０％飽和になるまで添加し、生
じた沈澱を遠心分離（２００００ｇで３０分）で回収し
た。得られた沈澱を１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．２）２０ミリリットルに溶解し、粗酵素液２
２ミリリットルを得た。

【００２２】この精製段階の酵素液は、総活性７１３
Ｕ、総タンパク質１１８ｍｇ、比活性６．０Ｕ／ｍｇ、
回収率１８．３％であった。 （３）ＤＥＡＥ−セファロースファストフローによる再
精製 上記（２）で得た粗酵素液の２０ミリリットルを１００
ｍＭのリン酸カリウム緩衝液．ｐＨ７．２）で平衡化し
たＤＥＡＥ−セファロースファストフローカラム（直径
１．６×１５ｃｍ）に通塔して酵素を吸着させ、１００
ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１２０ミリ
リットルで洗浄した後、塩化ナトリウムの直線勾配（０
〜５００ｍＭ）で溶出し、β−ガラクトシダーゼ活性画
分を回収した。得られた酵素液をセントリプレップ−１
０（アミコン社製）を用いて濃縮し、グリセロールを終
濃度が２０％となるように加えた。

【００２３】この精製段階の酵素液は、総活性７２３
Ｕ、総タンパク質８２．６ｍｇ、比活性８．８Ｕ／ｍ
ｇ、回収率１８．５％であった。また、このβ−ガラク
トシダーゼは前記した理化学的性質を有していた。 実施例３ 実施例２で得られた酵素標品と市販の酵素（大和化成社
製 Bacillus circulans由来）を用いて、ステビアに対
するＤ−ガラクトース基転移反応の比較実験を行った。

【００２４】反応液は最終濃度で、５０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．２）、１Ｍラクトース、０．０２
５Ｍステビオシド、酵素２０Ｕ／ミリリットルとなるよ
うに混合した。この反応液を、４０℃で３時間インキュ
ベートした後、１００℃で１０分間処理することにより
酵素反応を停止した。反応生成物を以下の条件で高速液
体クロマトグラフィ（以下、ＨＰＬＣと略記する）で分
析を行った。

【００２５】 カラム：LiChrospher 100 NH2(250mm x 4mm) 検出器：Shimadzu SPD-6A 移動相：Acetonitrile-Water (80:20) 流速 ：1.0ml/min 温度 ：４０℃ この結果を図５に示す。なお、図５（ａ）は、この発明
の酵素を用いたときの生成物を示すチャートであり、図
５（ｂ）は、市販の酵素を用いたときの生成物を示すチ
ャートである。また、１０分付近に見られるピークがス
テビオシドのピークであり、２２分付近に見られるピー
クが糖転移物のピークである。この図５に示した結果か
ら、この発明のβ−ガラクトシダーゼは、市販のβ−ガ
ラクトシダーゼと比べてステビオシドに対する糖転移能
が高いことが確認された。

【００２６】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明の
β−ガラクトシターゼは特にステビオシドに対して優れ
た糖転移能を有しているため、この酵素を利用してステ
ビオシドの糖転移物を工業的に生産することができる。
また、その優れた糖転移能を利用して各種食品や医薬品
の原料等となる糖転移物を大量生産することも可能とな
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明の酵素の活性に及ぼすｐＨの影響を示
すグラフである。

【図２】この発明の酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響を
示すグラフである。

【図３】この発明の酵素の活性に及ぼす温度の影響を示
すグラフである。

【図４】この発明の酵素の安定性に及ぼす温度の影響を
示すグラフである。

【図５】（ａ）（ｂ）は、各々この発明の酵素および市
販の酵素のステビオシドに対するＤ−ガラクトース基転
移反応後のＨＰＬＣチャート図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:22） (72)発明者 鈍宝 宗彦 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内 (72)発明者 柴山 慶三 徳島県板野郡北島町高房字川の上８番地 東邦レーヨン株式会社徳島工場内 (72)発明者 栗山 敏直 徳島県板野郡北島町高房字川の上８番地 東邦レーヨン株式会社徳島工場内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の理化学的性質、 １）作用：β−Ｄ−ガラクトシド結合を加水分解すると
   ともに、分解して生成したＤ−ガラクトース基を転移す
   る、 ２）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：至適ｐＨがｐＨ７．
   ０〜７．５であって、ｐＨ６．５〜７．５（４０℃で６
   ０分間処理）で安定である、 ３）作用適温の範囲：３０〜４０℃である， ４）分子量：ゲル濾過法による測定で約３２万である、 を有することを特徴とするβ−ガラクトシターゼ。
2. 【請求項２】 クレブシエラ（Klebsiella）属に属する
   細菌が生産するβ−ガラクトシターゼであって、以下の
   理化学的性質、 １）作用：β−Ｄ−ガラクトシド結合を加水分解すると
   ともに、分解して生成したＤ−ガラクトース基を転移す
   る、 ２）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：至適ｐＨがｐＨ７．
   ０〜７．５であって、ｐＨ６．５〜７．５（４０℃で６
   ０分間処理）で安定である、 ３）作用適温の範囲：３０〜４０℃である， ４）分子量：ゲル濾過法による測定で約３２万である、 を有することを特徴とするβ−ガラクトシターゼ。
3. 【請求項３】 請求項１記載のβ−ガラクトシターゼを
   生産する細菌株クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella
   oxytoca）Ａ−５３（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２６３）。