CN104212755A - 一株能降解海水柴油污染物的基因工程细菌Y8-cyp153a - Google Patents
一株能降解海水柴油污染物的基因工程细菌Y8-cyp153a Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一株能降解海水柴油污染物的基因工程菌的制备、鉴定及其降解能力的测定。本发明利用现代生物工程技术，采用合成alkB2基因；并选择柴油降解率低的海洋土著菌Y8，构建了Y8-alkB2基因工程菌。经过鉴定，确定Y8属于克雷伯氏菌属；Y8-alkB2含有alkB2转基因片段，能表达ALKB蛋白。对该基因工程菌的降解率的测定和降解条件的分析，显示该基因工程菌株能有效提高土著菌Y8的柴油降解效率，稳定、高效地对柴油污染物进行降解，有望应用于海水柴油污染的治理。
Description
1技术领域
本发明涉及一株能降解海水柴油污染物的基因工程菌的制备、鉴定及其降解能力的测定。
2背景技术
生物修复是指利用生物特别是微生物来催化降解环境污染物，减小或最终消除环境污染的受控或自发过程，是在生物降解基础上发展起来的新兴的环保技术，其中，微生物降解是生物修复去除环境中石油污染物的主要途径。
土著微生物降解污染物的潜力巨大，但驯化时间长、生长速度慢、代谢活性低，因而转入外源高效污染物降解基因，能够提高生物修复效率。近年来，构建高效的基因工程菌以显著提高污染物的降解效率成为油类污染治理的一个热点，为解决生物修复周期长等问题提供了崭新的途径。国外学者Charkrabany经过研究发现能降解芳烃、萜烃、多环芳烃的细菌的降解基因位于质粒上，根据质粒容易传递的特性将能够降解脂(含质粒A)的一种假单胞菌作为受体细胞，分别将能够降解芳烃(含质粒B)、萜烃(含质粒C)、多环芳烃(含质粒D)的质粒，用遗传工程的方法人工转入受体细胞，获得多质粒的“超级细菌”，这一新型菌能同时降解四种石油组分，能把原油中约2／3的烃类消耗，其突出的优点是比自然菌降解速度快。
烷烃降解菌的降解酶基因中P450家族的CYP153亚族是目前的研究热点。烷烃进入细菌后，先被细胞质中的CYP153A蛋白进行末端羟基化，然后在乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的作用下进一步氧化，最后加上乙酰辅酶A，进入β氧化循环，分解成二氧化碳和水，CYP153A酶是烷烃降解的限速酶。
某些微生物能以烷烃为碳源已被公认，但大多数生化和遗传研究主要还是集中在有限的几个原型系统，Alcanivorax borkumensis烷烃羟化酶系统是其中之一，Alcanivorax borkumensis是海洋微生物中一种独特的、以烷烃为主要的特异性底物生长的杆状γ-蛋白菌。该菌遍布全球众多海域，包括太平洋、地中海、日本海、中国沿海和北极。在没有污染的海洋中，该菌数量很少，但在石油污染的开发海域或海岸，该菌可快速生长成为污染水域中的优势菌群，在石油降解菌群中，该菌所占比例为80-90％。近期研究报道证明A.borkumensis在石油污染生物修复中发挥关键作用。2006年，Nature Biotechnology报道了A.borku-mensis SK2的基因组全长序列及其功能分析结果，发现该菌基因组中含有多个编码烃类物质分解代谢酶系统的基因簇，如alkSBlGJH基因簇，gntR和alkB2，p450等。这些基因编码的蛋白在n-烷烃转变成脂肪酸的过程中发挥重要作用。由于CYP153A蛋白是细菌中氧化中链烷烃的主要酶系统之一，也是使A.borku-mensis SK2具备更强的烃类降解能力的重要因素，因此，本专利选择Alcanivorax borkumensis SK2的cyp153a基因作为目的基因，构建基因工程菌，以期解决土著菌降解效率低的难题。
3发明内容
本发明的目的是制备获得一株能降解海水柴油污染物的基因工程菌，使其降解能力较土著菌大幅度提高。
Y8菌是采用富集培养微生物的方法，从定海港口受污染的海水中分离获得的对油类污染降解效率较低的土著菌，但能在以柴油为唯一碳源的海水培养基中生长繁殖。经紫外分光光度法检测，其对柴油污染物的7天降解效率仅为10～15％。
对Y8菌株直接进行菌落PCR扩增，得到16S rDNA的基因序列，构建系统发育树，结果表明Y8菌株与Klebsiella oxytoca strain ATCC13182相似度达到99％，由此可确定该菌株属于克雷伯氏菌，重建的系统发生树表明Y8与Klebsiella oxytoca strain ATCC13182所构的支为姐妹群关系。
提取Y8基因组和土著质粒，经PCR分析得知Y8中不含有cyp153a基因。而cyp153a酶是柴油降解的重要限速酶，所以采用基因转导的方法，在Y8中转入cyp153a基因，构建基因工程菌Y8-cyp153a。
经鉴定，Y8-cyp153a能特异表达CYP153A蛋白，对柴油的降解率分别为：2天，15.59％；4天，38.17％以及6天，60.47％。
4附图说明
图1：Y8菌株的菌落及菌体形态A：Y8在营养平板上生长的菌落；B：Y8菌体形态；C：电镜下Y8菌体形态。
图2：根据Y816s rDNA序列构建的系统发育树。
图3：Y8菌株基因组和质粒抽提及其cyp153a基因表达的PCR鉴定：P-质粒；G-基因组。
图4：pCom8-cyp153a质粒的鉴定(质粒大小、PCR和酶切鉴定)。
图5：Y8-cyp153a菌株中质粒抽提及酶切、PCR和蛋白表达鉴定。
图6：Y8与Y8-cyp153a菌株对柴油的降解效率比较。
5具体实施方式
以下通过具体实施对本发明做进一步说明。
实施例1.柴油污染海水中细菌的富集、培养
从受柴油污染的海水区域采集表层水样，用灭菌后的4L棕色玻璃瓶取2L表层海水后密封保存，24h内进行微生物的富集培养和分离工作。
将采集的水样取1mL接种于含0.5％(v／v)柴油的100mL灭菌的人工海水培养基(MMC)中。MMC的配方为(每升含量)：NaCl24g；MgSO4·7H2O0.7g；NH4NO31g；K Cl0.7g；KH2PO42g；Na2HPO4·12H2O3g；pH7.5，灭菌后补加适量微量元素混合。微量元素经0.22gm滤膜过滤除菌，其组成(每升含量)如下：CaCl22mg；FeCl36H2O50mg；CuSO40.5mg；MnCl2·4H2O0.5mg；ZnSO4·7H2O10mg／L。在30℃，200r／min的摇床培养7天后，从培养液中取出1mL转入100mL新鲜培养基中，培养基的油浓度提高至1％(v／v)，在相同的条件下培养；油浓度按梯度(0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％)提高，富集培养五个周期。
实施例2.Y8菌株的分离
用移液枪(枪头已灭菌)吸取1mL富集培养物置于9mL无菌水中，作为10-1稀释液进行倍比稀释，分别制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀释液；分别吸取0.2mL不同稀释度的样品滴入LB固体培养基内，涂布8个平板，对应编号，倒置于35℃生化培养箱培养1～2天；再在平板上挑取单菌落，采取分区划线法，使菌种进一步纯化；纯化后的菌株保存在斜面培养基中，并于4℃冰箱中保藏；实验均在无菌室超净工作台操作。
将分离纯化的细菌分别接种于5ml LB液体培养基中，200rpm，35℃下振荡培养12h，至菌悬液OD600nm值为0.8～1.0(菌体浓度为108～109cells／mL)，然后将0.5ml去掉LB培养基的各菌悬液分别加入50mL相同柴油浓度的MMC中，设空白对照，200rpm，30℃下振荡培养7天，将能以柴油作为唯一碳源生长的菌株保存，即为Y8。
实施例3.Y8菌株降解率的初步测定
取保存的Y8菌种，LB平板划线，30℃恒温培养过夜，挑取单克隆，接种于5m L LB培养基中，于30℃、200rpm的摇床培养8小时。吸取0.5mL活化后的菌液至1.5mLEP管中，在3000rpm条件下离心5min，弃上清；用0.5mL的MMC培养基悬浮沉淀，再次在3000rpm条件下离心5min，重复洗涤菌体一次。将沉淀菌体用0.5mL MMC培养基悬浮后，接种于50mL添加过1％柴油的MMC培养基中，于30℃、200rpm的摇床培养一周。
根据《海洋监测规范-海水分析》(GB17378.4-2007)，用石油醚萃取MMC中的残留柴油，采用紫外分光光度法测定柴油的残留量，以未接菌的含相同柴油浓度的MMC培养基为对照，计算降解率。该实验设3个重复。柴油降解率η降解计算公式为：η降解={1-(C0-C1)／C0}×100％，其中，C0和C1分别为对照组柴油浓度和接菌组柴油浓度。Y8的柴油7天降解率初步测定为10-15％。
实施例4.Y8菌株的形态学和生理生化特征
结果见表1。Y8菌株为革兰氏阴性、无鞭毛的杆菌，具有兼性厌氧、呼吸和发酵两种类型的代谢，过氧化氢酶阳性、氧化酶阴性及能将硝酸盐还原成亚硝酸盐等特点，因而被鉴定为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。Y8菌株具有β-半乳糖苷酶，赖氨酸脱羧酶，不具有精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶、色氨酸脱氨酶、脲酶和明胶酶，柠檬酸盐利用阳性，产H2S试验阴性，能形成吲哚，V-P反应阳性，能从葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁甙和阿拉伯糖等产酸的特点(结合氧化酶试验结果)，经编码并查阅API-20E细菌鉴定系统编码本，该菌株被鉴定为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。
表1Y8菌株的形态学和生理生化特征*
注：1.“+”，表示阳性：“-”，表示阴性。
2.*：采用国际公认主要适用于肠杆菌科菌种鉴定的API-20E细菌鉴定系统的鉴定卡所得结果。
实施例5.Y8菌株的16S rDNA鉴定
Y8菌株用TAKARA的DNA提取试剂盒直接提取DNA作为模板，PCR反应体系(50μl)为Premix EXTaq PCR MasterMix(TAKARA)25μl，引物27F(5′-AGR GTTTGATYVTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGHTACCTTGTTACGACTT-3′)各2μl(10pmol)，DNA模板2μl(约20ng)，超纯水19μl。PCR扩增程序为94℃10min；94℃1min，53℃90s，72℃90s，30个循环；72℃10min。扩增产物进行测序，测序结果用DNAstar软件包中Seqman来拼接。(引物序列中合并碱基的表示如下：A，G=R；A，T=W；C，T=Y；G，T=K；A，T，C=H；A，C，G＝V)，DNA序列检测结果如下：
5’-TGCAAGTCGAACGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGGGTAAGGTTAATAACCTTGTTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTGGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCG-3’
将测得的菌株的16S rDNA序列通过EzTaxon Serverversion2.1与其中核酸数据库进行比对分析，相似的序列进行多重匹配排列分析(clustalx1.83)，用Mega4分析软件中的NeighborJoining方法构建系统发育树(图2)。结果表明：Y8菌株与Klebsiellaoxytoca strainATCC13182相似度达到99％，由此可确定该菌株属于克雷伯氏菌，重建的系统发生树表明Y8与Klebsiellaoxytoca strainATCC13182所构的支为姐妹群关系。
实施例6.Y8的cyp153a基因表达
通过碱裂解法，抽提Y8z基因组和土著质粒，按照genebank上cyp153a序列，设计cyp153a通用引物，经PCR鉴定Y8的cyp153a基因表达，结果如图3所示：与阳性对照菌W3相比，Y8中无cyp153a基因表达，由于Y8能在以以柴油作为唯一碳源的条件扩增，说明Y8具有利用柴油的一系列酶，然而作为柴油降解限速酶CYP153A，其在Y8中表达缺失，为了进一步增强Y8的降解效率，采用基因工程的手段，转入cyp153a基因，以期提高Y8的柴油降解效率。
实施例7.pCom8-cyp153a质粒的构建和鉴定
按照genebank上cyp153a序列，运用DNA club、Clustal X等软件设计目的基因两端的酶切位点：Sal I和Nde I，交由生物技术公司合成目的基因cyp153a-SK2。目的基因序列为：
1 atgtcaacga gttcaagtac aagtaatgac atccaggcaa aaataattaa cgccacatcc
61 aaagtcgtgc caatgcatct acagatcaag gcactaaaaa acttgatgaa ggtgaagcgg
121 aagaccattg gcacttcccg ccctcaggtg cactttgttg aaaccgattt gcctgacgtc
181 aatgatttgg cgatagaaga tatcgatacg agtaaccctt ttttataccg acaaggtaag
241 gcgaatgcgt actttaagcg gttgcgtgat gaagcgccgg tgcactacca gaagaacagt
301 gctttcgggc cgttctggtc ggtaacacgc tacgaagata ttgtcttcgt ggacaagagc
361 catgatttgt tttccgccga accccaaatt atcttgggtg atcctccgga aggcctgtcg
421 gttgaaatgt tcatcgctat ggatcctccc aagcacgacg tacagcgtcg ggcagtccag
481 ggtgttgttg cgcccaagaa cctgaaagaa atggaaggac tgatccgcaa gcgcaccggg
541 gacgtactcg atagcctgcc gttggacact ccgttcaact gggtgccggt ggtgtcgaaa
601 gagctgaccg ggcgcatgct cgcctcactg ttagatttcc cgtatgacga acgcgaaaaa
661 ctggttggct ggtcggatcg attgtccggc gcgtcctcgg caaccggcgg cgagtttacg
721 aatgaagatg tgttttttga tgatgctgca gatatggcgt gggctttctc caagctttgg
781 cgtgataaag aagcccgtca aaaagcaggt gaagagccgg gtttcgattt gatcagcatg
841 cttcagtcca atgaagacac aaaagatctg atcaatcgtc ctttggaatt cattggtaat
901 ctcgcgttgt tgattgttgg cggtaatgac accacgcgta actcaatgag cgggggggtg
961 ctggctttaa atcagttccc agagcaattc gagaagctaa aggcgaaccc aaagcttatc
1021 cccaatatgg tctctgaaat cattcgctgg caaacgccgc ttgcgtatat gcgccgggtt
1081 gccaagcagg atgtggagct gaacggacag accatcaaga agggtgatcg cgtgctgatg
1141 tggtatgcgt cgggcaacca ggatgagaga aaatttgaga atcctgagca attcatcatc
1201 gaccgcaaag atacgcgtaa ccatgtgtcg tttggttatg gggttcaccg ttgtatgggc
1261 aaecgccttg ccgaactgca gctgcgtatt ctgtgggaag agcttctccc tcgctttgaa
1321 aacatcgaag tgatcggtga gccggagcgc gtgcaatcga actttgtgcg gggctattcc
1381 aagatgatgg ttaagttgac ggctaaaaaa taa／／
pCom8空载体和PCR产物经Sal I和Nde I酶切，酶切条件为37℃，6h。酶切产物过柱回收，回收的空载体和PCR产物经T4连接酶连接，连接条件为4℃，过夜。连接产物转导入大肠杆菌DH5α，经LB平板培养过夜，挑取单克隆，抽提质粒，根据目的基因序列，设计上下游引物对提取的重组质粒进行PCR鉴定，引物序列为：上游引物5′CCCAAGAACCTGAAAGAAA3′；下游引物5′TAACAGTGAGGCGAGCAT3′；根据酶切位点，通过Sal I和Nde I酶切鉴定质粒；根据质粒大小，通过琼脂糖凝胶电泳，鉴定质粒，具体结果如图4所示，结果表明重组质粒pCom8-cyp153a PCR片段大小为141bp，酶切产物全长为1414bp。电泳鉴定后，质粒又交由生物技术公司测序，经blast表明，各目的基因与genebank登录序列一致，证明重组质粒构建成功。
实施例8.Y8-cyp153a菌株的构建与鉴定
pCom8-cyp153a质粒通过电转化的方式导入土著菌Y8，完成基因工程菌Y8-cyp153a构建。阳性菌克隆通过对抽提的质粒进行酶切和PCR鉴定，结果如图5所示：质粒PCR片段大小为141bp，酶切产物全长为1414bp，与pCom8-cyp153a相同，证明质粒成功导入Y8。为了进一步验证pCom8-cyp153a质粒在土著菌Y8中能否表达CYP153A蛋白，我们通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测cyp153a基因在Y8中的表达。结果表明：cyp153a基因在1％柴油诱导时，在Y8中能够正确表达，表达的目的蛋白分子量与预期一致，条带大小约为60KD。
实施例9.Y8-cyp153a菌株的柴油降解率检测
检测基因工程菌Y8-cyp153a和土著菌Y8在1％柴油浓度的海水培养基中培养3d后的柴油降解率。结果如图6所示：土著菌Y8和基因工程菌Y8-cyp153a的降解率分别为9.64％和15.59％(2天)；11.26％和38.17％(4天)；11.33％和60.47％(6天)，提示基因工程菌Y8-cyp153a能显著提高土著菌的降解效率。
本发明，本领域技术人员可通过借鉴本文，明显能不脱离本发明内容、精神和范围内，适当改变动物模型、辐射剂量和检测方法实现本应用。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动，都被视为在本发明精神、范围和内容中。
Claims (8)
1.一株能降解海水柴油污染物的基因工程细菌Y8-cyp153a，其特征是土著菌Y8转入一段P450家族的cyp153a基因片段，该基因工程菌能在以柴油为唯一碳源的海水培养基中生长繁殖，提高土著菌Y8的柴油降解率。
2.权利要求1所述的土著菌Y8，其特征为Y8属于变形菌纲、肠杆菌目、肠杆菌科、克雷伯氏菌属，其中Y8的16s rDNA序列BLAST比对与Klebsiella oxytoca strain ATCC13182相似度达到99％，其具体序列为：
5’-TGCAAGTCGAACGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGGGTAAGGTTAATAACCTTGTTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTGGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGT GAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCG-3’。
3.权利要求1所述的土著菌Y8，其特征为：Y8能在以柴油为唯一碳源的海水培养基中生长繁殖，经紫外分光光度法检测，其对柴油污染物的7天降解效率为10～15％。
4.权利要求1所述的土著菌Y8，其特征为：可以通过基因工程改造，提高对柴油污染物的降解能力。
5.权利要求1所述的cyp153a目的基因片段具有如下的序列：
1 atgtcaacga gttcaagtac aagtaatgac atccaggcaa aaataattaa cgccacatcc
61 aaagtcgtgc caatgcatct acagatcaag gcactaaaaa acttgatgaa ggtgaagcgg
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1321 aacatcgaag tgatcggtga gccggagcgc gtgcaatcga actttgtgcg gggctattcc
1381 aagatgatgg ttaagttgac ggctaaaaaa taa／／。
6.按照权利要求1所述，基因工程细菌Y8-cyp153a培养基是以柴油为唯一碳源的海水培养基，其特征为：基因工程细菌Y8-cyp153a能在以柴油为唯一碳源的海水培养基中生长繁殖。
7.按照权利要求1所述，所说的提高土著菌Y8的柴油降解率，其特征为：在以柴油为唯一碳源的海水培养基中培养2天、4天和6天，Y8和Y8-cyp153a的平均降解率分别为：9.64％和15.59％(2天)；11.26％和38.17％(4天)；11.33％和60.47％(6天)。
8.按照权利要求1所述，该基因工程菌能应用于海水柴油污染生物降解。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN111235132A (zh) * | 2019-12-23 | 2020-06-05 | 浙江工业大学 | 一种β-半乳糖苷酶、基因、工程菌及其应用 |
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| WO2013024114A2 (de) * | 2011-08-15 | 2013-02-21 | Evonik Degussa Gmbh | Biotechnologisches syntheseverfahren von omega-funktionalisierten carbonsäuren und carbonsäure-estern aus einfachen kohlenstoffquellen |
| WO2013135650A1 (de) * | 2012-03-12 | 2013-09-19 | Evonik Industries Ag | Enzymatische omega-oxidation und -aminierung von fettsäuren |
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2013
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