JPWO2015159982A1 - 骨芽細胞の調製方法及び骨芽細胞誘導剤 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)スタチン化合物、
(2)カゼインキナーゼ1阻害剤、
(3)cAMP誘導剤、及び
(4)ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤
からなる群から選択される少なくとも1種の化合物の存在下に培養して前記体細胞を骨芽細胞に変換することを特徴とする、骨芽細胞を調製する方法。
(2)カゼインキナーゼ1阻害剤、
(3)cAMP誘導剤、及び
(4)ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤
からなる群から選択される少なくとも1種の化合物のを含む、分化した体細胞を骨芽細胞に誘導するための誘導剤。
(2)カゼインキナーゼ1阻害剤、
(3)cAMP誘導剤、及び
(4)ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤
からなる群から選択される少なくとも1種の化合物、並びに、培地を含む分化した体細胞を骨芽細胞に誘導するためのキット。
カゼインキナーゼ1阻害剤としては、上記の化合物に替えてその誘導体を使用することもできる。誘導体は、必ずしも、カゼインキナーゼを阻害する活性を有さなくてもよい。例えば、カゼインキナーゼ1阻害剤であるD4476(4-[4-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-5-(2-pyridinyl)1H-imidazol-2-yl]-benzamide)に替えて、WO00/61576号に記載の下記式(I)で表されるD4476の誘導体を使用することができる:
R2は、H、NH(CH2)n−PhまたはNH−C1-6アルキルであり(ここで、nは、0、1、2または3である);
R3は、CO2H、CONH2、CN、NO2、C1-6アルキルチオ、−SO2−C1-6アルキル、C1-6アルコキシ、SONH2、CONHOH、NH2、CHO、CH2OH、CH2NH2、またはCO2Rであり(ここで、Rは、水素またはC1-6アルキルである);
X1およびX2のうち一方は、NまたはCR'であり、他方は、NR'またはCHR'である(ここで、R'は、水素、OH、C1-6アルキル、またはC3-7シクロアルキルである)か;またはX1およびX2のうち一方がNまたはCR'である場合、他方は、SまたはOであってもよい]。
4−[4−(4−フルオロフェニル)−5−(2−ピリジル)−1−ヒドロキシ−1H−イミダゾール−2−イル]ベンゾニトリル;
4−[4−(4−フルオロフェニル)−5−(2−ピリジル)−1H−イミダゾール−2−イル]ベンゾニトリル;
4−[4−(4−フルオロフェニル)−5−(2−ピリジル)−1H−イミダゾール−2−イル]安息香酸;
4−[4−(4−フルオロフェニル)−5−(2−ピリジル)−1H−イミダゾール−2−イル]安息香酸メチル;
4−[4−(4−フルオロフェニル)−5−(2−ピリジル)−1H−イミダゾール−2−イル]安息香酸エチル;
4−(4−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−1−ヒドロキシ−5−ピリジン−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル)ベンゾニトリル;
4−(4−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−5−ピリジン−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル)ベンゾニトリル;
4−(4−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−5−ピリジン−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル)安息香酸;
2−[4−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−2−(4−ニトロフェニル)−1H−イミダゾール−5−イル]ピリジン;
3−(4−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−5−ピリジン−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル)フェニルアミン;
4−[4−(4−フルオロフェニル)−2−(4−ニトロフェニル)−1H−イミダゾール−5−イル]ピリジン;
4−[4−(4−フルオロフェニル)−5−ピリジン−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル)フェニルアミン;
4−(4−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−5−ピリジン−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル)フェニル]メタノール;
4−(4−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−5−ピリジン−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル)ベンズアミド;
4−[4−(2,3−ジヒドロ−ベンゾ[1,4]ジオキシン−6−イル)−5−ピリジン−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル]−ベンゾニトリル;
4−[4−(2,3−ジヒドロ−ベンゾフラン−5−イル)−5−ピリジン−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミド;
3−[4−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−5−ピリジン−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル)ベンゾニトリル;
4−[4−(2,3−ジヒドロ−ベンゾフラン−6−イル)−5−ピリジン−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル]ベンゾニトリル;
4−[4−(2,3−ジヒドロ−ベンゾフラン−6−イル)−5−ピリジン−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミド;
3−(4−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−5−ピリジン−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル)安息香酸;
4−[4−(4−メトキシフェニル)−5−(2−ピリジル)−1H−イミダゾール−2−イル]ベンゾニトリル;
4−[4−(2,2−ジフルオロ−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル)−5−ピリジン−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミド;
4−[4−(2,3−ジヒドロ−ベンゾ[1,4]ジオキシン−6−イル)−1−メチル−5−ピリジン−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミド;
4−[5−(2,3−ジヒドロ−ベンゾ[1,4]ジオキシン−6−イル)−1−メチル−4−ピリジン−2−イル−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミド;
4−(5−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−4−ピリジン−2−イル−オキサゾール−2−イル)ベンゾニトリル;
4−(5−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−4−ピリジン−2−イル−オキサゾール−2−イル)ベンズアミド;および 4−(4−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−イル−5−ピリジン−2−イル−1H−ピロール−2−イル)ベンズアミド。
1-1、Alizarin Red S染色(図1)
ヒト正常皮膚線維芽細胞株HDFsを、5×104 細胞/ウェルの濃度で35 mm培養ディッシュに培養し、100 nMのシンバスタチン(SS)、または、100 nMのシンバスタチン(SS)と1μMのDZnepを添加した誘導培地にて、標準条件下で培養した。誘導培地の組成は、50 μg/ml アスコルビン酸、10 mM β-Glycerophosphate、100 nM dexamethasone(いずれも最終濃度)、10% FBS、1% 抗生剤、1% NEAA 、α-MEMである。標準条件とは、37°C、5%CO2, 95% humidified airである。約4日に1回培地交換を行い、28日間培養した。培養ディッシュから培養液を吸引除去し、蒸留水で2回洗浄を行い、10%ホルマリンで固定。滅菌蒸留水で洗浄した後、アリザリンレッドS染色液を加え、室温で20分間静置。滅菌蒸留水で洗浄した後、肉眼および顕微鏡で観察した。結果を図1に示す。赤い染色は石灰化骨基質を示している。SS、またはSSとDZnepの添加により、線維芽細胞が石灰化骨基質を多量に産生する骨芽細胞に転換したことがわかる。
ヒト正常皮膚線維芽細胞株HDFsを、24-well plateに培養し、100 nMのシンバスタチン(SS)と、種々の濃度のハイドロキシコルチゾンおよびβ-グリセロフォスフェイトを添加した誘導培地にて、標準条件下で培養した(表中、〇は各濃度の化合物を添加したことを示す)。約4日に1回培地交換を行い、28日間培養した。プレートから培養液を吸引除去し、蒸留水で2回洗浄を行い、10%ホルマリンで固定。滅菌蒸留水で洗浄した後、アリザリンレッドS染色液を加え、室温で静置。20分後、染色反応液を回収した後、滅菌蒸留水で洗浄した、肉眼および顕微鏡で観察した。結果を図2に示す。また各ウェルから回収した染色反応液の吸光度(550 nm)をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。結果を図3に示す。100 nMのシンバスタチン(SS)は、ハイドロキシコルチゾンとβ-Glycerophosphate の存在下に、線維芽細胞を骨芽細胞に転換すること、その際ハイドロキシコルチゾンは125〜4000 nM、β-Glycerophosphate は10〜20 μMの濃度であることが望ましいことが分かる。
ヒト正常皮膚線維芽細胞株HDFsを、24-well plateに培養し、100 nMのシンバスタチン(SS)と、種々の濃度のデキサメサゾン(Dex)およびβ-グリセロフォスフェイトを添加した誘導培地にて、標準条件下で培養した(表中、〇は各濃度の化合物を添加したことを示す)。約4日に1回培地交換を行い、28日間培養した。プレートから培養液を吸引除去し、蒸留水で2回洗浄を行い、10%ホルマリンで固定。滅菌蒸留水で洗浄した後、アリザリンレッドS染色液を加え、室温で静置。20分後、染色反応液を回収した後、滅菌蒸留水で洗浄した、肉眼および顕微鏡で観察した。結果を図4に示す。また各ウェルから回収した染色反応液の吸光度(550 nm)をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。結果を図5に示す。100 nMのシンバスタチン(SS)は、デキサメサゾンと、β-Glycerophosphate の存在下に、線維芽細胞を骨芽細胞に誘導すること、その際デキサメサゾンは25〜800 nM、β-Glycerophosphate は10〜20 μMの濃度であることが望ましいことが分かる。
ヒト正常皮膚線維芽細胞株HDFsを、24-well plateに培養し、種々の濃度のシンバシタチン(SS)を添加した誘導培地にて、標準条件下で培養した。約4日に1回培地交換を行い、28日間培養した。培養プレートから培養液を吸引除去し、蒸留水で2回洗浄を行い、10%ホルマリンで固定。滅菌蒸留水で洗浄した後、アリザリンレッドS染色液を加え、室温で静置。20分後の染色反応液を回収した後、滅菌蒸留水で洗浄した、肉眼および顕微鏡で観察した。また回収した染色反応液の吸光度(550 nm)をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。結果を図6に示す。シンバスタチンが骨芽細胞を誘導する望ましい濃度は10〜100nMであることが分かる。
ヒト正常皮膚線維芽細胞株HDFsを、24-well plateに培養し、種々の濃度のシンバスタチン(SS)とD4476(カゼインキナーゼインヒビター)を添加した誘導培地にて、標準条件下で培養した。約4日に1回培地交換を行い、28日間培養した。その後培養プレートから培養液を吸引除去し、蒸留水で2回洗浄を行い、10%ホルマリンで固定。滅菌蒸留水で洗浄した後、アリザリンレッドS染色液を加え、室温で静置。20分後の染色反応液を回収した後、滅菌蒸留水で洗浄した、肉眼および顕微鏡で観察した。また回収した染色反応液の吸光度(550 nm)をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。結果を図7に示す。100 nMのシンバスタチンに、2〜5 μMのD4476が共存すると、骨芽細胞への誘導効率がより高まることが分かる。
ヒト正常皮膚線維芽細胞株HDFsを、12-well plateに培養し、100 nMのシンバスタチン(SS)と種々の濃度のD4476(カゼインキナーゼインヒビター)を添加した誘導培地にて、標準条件下で培養した(カッコ内の数字はμM)。約4日に1回培地交換を行い、21日間培養した。細胞からISOGEN IIにてtotal RNAを回収し、Rever Tra Ace qPCR RT Master Mixを用いてcDNAを作製した。Real-time PCR Master Mix、Taqman probes、Specific PrimersおよびcDNAを混和し、AB7300 Real-time PCR systemを用いてReal-time RT-PCRを行い、Runx2、オステオカルシン(OC)、アルカリフォスファターゼ(ALP)遺伝子のmRNAを定量した。コントロールとしてシンバスタチンを添加しない培養を行った線維芽細胞からRNAを採取し同様の解析を行った。またヒト骨芽細胞からRNAを採取し同様の解析を行った。結果を図8に示す。縦軸は、コントロールの細胞のmRNAレベルを1としたときの各遺伝子のmRNAの相対値である。100nMのシンバスタチンによって線維芽細胞から誘導された骨芽細胞が、Runx2、オステオカルシン(OC)、アルカリフォスファターゼ(ALP)を発現すること、また2〜5 μMのD4476が共存すると、それらの発現が同等もしくはより高まることが分かる。
ヒト正常皮膚線維芽細胞株HDFsを、60 mm培養ディシュに培養し、100 nMのシンバスタチン(SS)、または100 nMのシンバスタチンと2μMのD4476(SS+D4)を添加した誘導培地にて、標準条件下で培養した。約4日に1回培地交換を行い、21日間培養した。細胞からISOGEN IIにてtotal RNAを回収した。ヒト線維芽細胞(HDFs)とヒト骨芽細胞(OBs)からも同様にtotal RNAを回収した。各細胞のmRNA発現パターンをaffymetrix 社のDNAチップを用いてゲノムワイドに解析した。結果を図9に示す。SS、SS+D4とも、線維芽細胞よりも骨芽細胞に類似の網羅的遺伝子発現パターンを示し、SS+D4の方がSSよりもより骨芽細胞に類似の網羅的遺伝子発現パターンを示すことが分かる。
2-1、Alizarin Red S染色(図10)
ヒト正常皮膚線維芽細胞株HDFsを、5×103 細胞/ウェルの濃度で24 well plateに播種した(day 0)。翌日、各wellの培養液を棄て、500 μl/wellの新しい培地に交換した。誘導培地はDulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)、50 μg/mlアスコルビン酸、10 mM β-glycerophospahte、100 nM Dexamethasoneに10% ウシ胎仔血清(FBS)を添加したものである。また記載の小分子化合物を加えた。ただし、ASはAtorvastatin、LSはLovastatin、RSはRosuvastatin、PiSはPitavastatin、SSはSimvastatin、PrSはPravastatin、FSKはforskolinを示す。ASはLKT Laboratories(St Pau, USA)、LSはCayman chemical(Ann Arbor, USA)、RSはCayman chemical(Ann Arbor, USA)、PiSはCayman chemical(Ann Arbor, USA)、SSはSigma(St Louis, USA)、PrSは(Cayman chemical(Ann Arbor, USA)、FSKはSigma(St Louis, USA)からそれぞれ購入した。3〜4日に1度、培養液を交換して培養した。
ヒト正常皮膚線維芽細胞株HDFsを、5×103 細胞/ウェルの濃度で24 well plateに播種した(day 0)。翌日、各wellの培養液を棄て、500 μl/wellの新しい培地に交換した。誘導培地はDulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)、50 μg/mlアスコルビン酸、10 mM β-glycerophospahte、100 nM Dexamethasoneに10% FBSを添加したものである。また記載の小分子化合物を加えた。3〜4日に1度、培養液を交換して培養した。
ヒト正常皮膚線維芽細胞株HDFsを、5×103 細胞/ウェルの濃度で24 well plateに播種した(day 0)。翌日、各wellの培養液を棄て、500 μl/wellの新しい培地に交換した。誘導培地はDulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)、50 μg/mlアスコルビン酸、10 mM β-glycerophospahte、100 nM Dexamethasoneに5% Human Serumを添加したものである。また記載の小分子化合物を加えた。3〜4日に1度、培養液を交換して培養した。
上記「2-1、」と同様の培養を、記載の化合物を添加して行った。
上記「2-1、」と同様の培養を、記載の化合物を添加して行った。
ヒト正常皮膚線維芽細胞株HDFsを、5×103 細胞/ウェルの濃度で24 well plateに播種した(day 0)。翌日、各wellの培養液を棄て、500 μl/wellの新しい培地に交換した。誘導培地はDulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)、50 μg/mlアスコルビン酸、10 mM β-glycerophospahte、100 nM Dexamethasoneに5% Human Serumを添加したものである。また記載の小分子化合物を加えた。3〜4日に1度、培養液を交換して培養した。
上記「2-6、」と同様の培養を、記載の化合物を添加して行った。
上記「1、」と同様の培養を、記載の化合物を添加して行った。
上記「2-1、」と同様の培養を、記載の化合物を添加して行った。
実施例1と同様の培養を、記載の化合物を添加して行った。DZnepは、Cayman chemical (Ann Arbor, USA)、CX-4945はBiovision(Zurich, Switzerland)から購入して用いた。
ヒト正常皮膚線維芽細胞株HDFsを、60 mm培養ディシュに培養し、100 nMのシンバスタチン(SS)、または100 nMのシンバスタチンと2μMのD4476(SS+D4)を添加した誘導培地にて、標準条件下で培養した。3〜4日に1回培地交換を行い、21日間培養した。
細胞からISOGEN IIにてtotal RNAを回収した。ヒト線維芽細胞(HDFs)とヒト骨芽細胞(OBs)からも同様にtotal RNAを回収した。各細胞のmRNA発現パターンをaffymetrix 社のDNAチップを用いてゲノムワイドに解析した。
動物実験は、京都府立医科大学の認可を得て行った。8週齢オスのNOD/SCIDマウス(Charles River)の腹腔内にペントバルビタールを注射し麻酔した。注水下に歯科ドリルを用いて左大腿骨骨幹に直径約4mmの部分骨欠損を作成した。実施例11と同様の方法で、HDFsをシンバスタチンとD4476存在下で21日間培養した細胞を、50 μLの培地と50 μLのマトリゲル (BD Bioscience, San Jose, CA)の1:1混合液に懸濁し、骨欠損部とその周辺の骨表面に5×105 個 /マウスの濃度で移植した. また、同様に骨欠損を作ったのち線維芽細胞を移植したマウスも準備した。21日後にマウスを安楽死させ、大腿を切除し、中性ホルマリンで固定後、X-ray CT device (Scan Xmate-L090, Com Scan Techno, Yokohama, Japan)を用いてマイクロ・コンピューター断層撮影(μCT)した。
動物実験は、京都府立医科大学の認可を得て行った。上記「2-12、」と同様に移植実験を行った。また、線維芽細胞を移植したマウスも準備した。21日後にマウスを安楽死させ、実施例11と同様に大腿を切除し、中性ホルマリンで固定後、骨組織をSCEM (Leica Microsystem) compoundで包埋し、急速凍結した。6 μmの切片にスライス後、連続切片をヘマトキシリン・エオジン (H&E)(左)およびAlizarin Red S (右)で染色した。
ヒト正常白色脂肪前駆細胞(HWPs)を、5×104 細胞/ディシュの濃度で35mmディシュに播種した(day 0)。翌日、各wellの培養液を棄て、2 mL/wellの新しい培地(通常培地、または、記載の小分子化合物を加えた誘導培地)に交換した。通常培地は、Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)に10% FBSを添加した培地であり、誘導培地はDMEMに50 μg/mLアスコルビン酸、10 mM β-glycerophospahte、100 nM Dexamethasoneおよび10% FBSを添加したものである。3〜4日に1度、培養液を交換して培養した。
Claims (6)
- 哺乳動物の分化した体細胞を培地中、
(1)スタチン化合物、
(2)カゼインキナーゼ1阻害剤、
(3)cAMP誘導剤、及び
(4)ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤
からなる群から選択される少なくとも1種の化合物の存在下に培養して前記体細胞を骨芽細胞に変換することを特徴とする、骨芽細胞を調製する方法。 - 前記体細胞が線維芽細胞、歯肉細胞または脂肪細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記培地が、骨芽細胞の誘導培地である、請求項1または2に記載の方法。
- (1)スタチン化合物、
(2)カゼインキナーゼ1阻害剤、
(3)cAMP誘導剤、及び
(4)ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤
からなる群から選択される少なくとも1種の化合物のを含む、分化した体細胞を骨芽細胞に誘導するための誘導剤。 - (1)スタチン化合物、
(2)カゼインキナーゼ1阻害剤、
(3)cAMP誘導剤、及び
(4)ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤
からなる群から選択される少なくとも1種の化合物、並びに、培地を含む分化した体細胞を骨芽細胞に誘導するためのキット。 - 前記培地が、骨芽細胞の誘導培地である、請求項5に記載のキット。
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