JP2002527386A - 骨形成調節方法 - Google Patents

骨形成調節方法

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JP2002527386A JP2000575499A JP2000575499A JP2002527386A JP 2002527386 A JP2002527386 A JP 2002527386A JP 2000575499 A JP2000575499 A JP 2000575499A JP 2000575499 A JP2000575499 A JP 2000575499A JP 2002527386 A JP2002527386 A JP 2002527386A
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マハワーテ，モハメド
ロダン，ギデオン・エイ
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、哺乳動物における骨形成調節方法であって、処置を必要とする哺乳動物に対して治療上有効量の骨芽細胞系細胞のアポトーシス阻害薬を投与する段階を有する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、哺乳動物における骨形成の調節方法であって、処置を必要とする哺
乳動物に対して、治療上有効量の骨芽細胞系細胞におけるアポトーシス阻害薬を
投与する段階を有する方法に関する。
【０００２】 （背景技術） ヒトおよび他の哺乳動物における各種障害には骨損失が関与していたり関連し
ている。そのような障害には骨粗鬆症、糖質コルチコイド誘発骨粗鬆症、ページ
ェット病、骨代謝異常亢進、歯周病、歯喪失、骨折、慢性関節リウマチ、補綴具
周囲骨溶解、骨形成不全症、転移骨疾患、悪性腫瘍の高カルシウム血症および多
発性骨髄腫などがあるが、これらに限定されるものではない。これらのうちの最
も一般的なものの一つが骨粗鬆症であり、それが最も高頻度で起こるのは閉経後
女性においてである。骨粗鬆症は、低い骨密度および骨組織の微小構造的変質を
特徴とする全身性骨格疾患であり、結果的に骨が脆弱となり、骨折しやすくなる
。骨粗鬆症性骨折は、高齢者における罹患率および死亡率の主要原因となってい
る。５０％もの女性および１／３の男性が骨粗鬆症性骨折を経験する。比較的高
齢群の大半がすでに骨密度が低くなっており、骨折のリスクが高い。そこで、骨
粗鬆症および骨損失に関連する他の状態の治療およびリスク低下（すなわち予防
）のいずれも非常に必要とされている。骨粗鬆症ならびに骨損失に関連する他の
障害は一般的に慢性状態であることから、適切な治療法は通常慢性投与を必要と
すると考えられている。
【０００３】 正常な骨の生理には、モデリングおよびリモデリングのプロセスによって骨組
織が連続的に代謝されていくプロセスが関与する。すなわち通常は、既存の骨組
織の吸収と新たな骨組織の形成との間には適切なバランスがある。骨吸収と骨形
成との間の連携の基礎となる詳細な機序については未解明である。しかしながら
これらプロセスにおける不均衡が、各種疾患および骨格状態で発現される。
【０００４】 骨形成プロセスおよび骨吸収プロセスにおいてはそれぞれ、骨芽細胞および破
骨細胞と称される２種類の異なる細胞が関与している（H. Fleisch, Bisphospho
nates In Bone Disease, From The Laboratory To The Patient, 3rd Edition,
Parthenon Publishing (1997)参照；これは引用によってその全内容が本明細書
に含まれるものとする）。
【０００５】 骨芽細胞は、骨表面に局在する細胞である。この細胞は骨性有機マトリックス
を分泌し、それが石灰化する。フッ化物などの物質、副甲状腺ホルモンおよびプ
ロスタグランジン類などのある種のサイトカイン類は、骨芽細胞に対する刺激効
果を提供することが知られている。しかしながら最近の研究の目標は、骨芽細胞
の骨形成活性を選択的に向上または刺激する治療薬開発となっている。
【０００６】 破骨細胞は通常は、皮質骨もしくは小柱骨の表面または皮質骨内のいずれかに
ある大型の多核細胞である。破骨細胞は、その細胞と骨の間にある密閉され封じ
込まれた微小環境で骨を吸収する。破骨細胞の補充および活動は、一連のサイト
カイン類およびホルモン類によって影響されることが知られている。ビスホスホ
ネート類が破骨細胞性骨吸収の選択的阻害薬であることが知られており、それに
よって骨吸収異常によって生じるまたはそれに関連する各種の全身性または局所
性骨障害の治療または予防における重要な治療薬となっている。しかしながら、
ビスホスホネート類を利用できたとしても、研究者は破骨細胞の骨吸収活性を阻
害するさらなる治療薬を開発し、骨芽細胞の骨形成活性を高めることをなおも望
んでいる。
【０００７】 プロスタグランジン類は、基本化合物であるプロスタン酸に関連する脂環式化
合物である。天然プロスタグランジンであるＰＧＥ２は以下の構造を有する。
【０００８】
【化３】 ＰＧＥ２などのプロスタグランジン類は、骨形成を刺激し、ヒトを含む哺乳動
物において骨量を増加させることが知られている。ＰＧＥ２効果介在に、ＥＰ１ 、ＥＰ２、ＥＰ３およびＥＰ４と称される４種類の異なる受容体サブタイプが関
与すると考えられている。骨に存在する主要なプロスタグランジン受容体はＥＰ ４ であり、それはサイクリックＡＭＰを介して信号を送ることで効果を発揮する
と考えられている。しかしながら詳細な作用機序は不明であることから、プロス
タグランジン介在骨効果について現在知られている科学データはかなり限られた
ものである。プロスタグランジン類およびそれの誘発（accosted）受容体につい
ては、例えばオノらの報告（K. Ono et al., Important role of EP4, a subtyp
e of prostaglandin (PG) E receptor, in osteroclast-like cell formation f
rom mouse bone marrow cells induced by PGE2, J. of Endocrinology, 158, R
1-R5 (1998)）、フンクらの報告（C. D. Funk et al., Cloning and Expression
of a cDNA for the Human Prostaglandin E Receptor EP! Subtype, Journal o
f Biological Chemistry, vol.268, no.35, pp.26767-26772 (1993)）、レーガ
ンらの報告（J. W. Reagan et al., Cloning of a Novel Human Prostaglandin
Receptor with Characteristics of the Pharmacologically Defined EP2 Subty
pe, Molecular Pharmacology, vol.46, pp.213-220 (1994)）、ヤンらの報告（J
, Yang et al., Cloning and Expression of the EP3-Subtype of Human Recept
ors for Prostaglandin E2, Biochemical Biophysical Research Communication
, vol.198, pp.999-1006 (1994)）、バスチエンらの報告（L. Bastien et al.,
Cloning, Functional Expression and Characterization of the Human Prostag
landin E2 Receptor EP2 Subtype, Journal Biological Chemistry, vol.269, p
p.11873-11877 (1994)）により詳細に記載されている（これらはいずれも引用に
よって本明細書に含まれるものとする）。
【０００９】 本発明においては、骨芽細胞系の細胞におけるプログラムされた細胞死の自然
プロセスであるアポトーシスを調節（例えば阻害）する化合物が骨形成調節に有
用であることが認められている。理論に拘束されるものではないが、これらの化
合物は骨芽細胞系の細胞における細胞死を抑制することで、骨芽細胞の活性を長
くし、数を上昇させると考えられている。
【００１０】 そこで本発明の目的は、哺乳動物における骨形成の調節方法であって、処置を
必要とする哺乳動物に対して、治療上有効量の骨芽細胞系細胞におけるアポトー
シスを阻害する化合物を投与する段階を有する方法を提供することにある。
【００１１】 本発明の別の目的は、治療または予防を必要とする哺乳動物における骨関連疾
患状態を治療したり、それへの罹患のリスクを低下させる方法であって、その哺
乳動物に対して治療上有効量の骨芽細胞系細胞におけるアポトーシスを阻害する
化合物を投与する段階を有する方法を提供することにある。
【００１２】 本発明のさらに別の目的は、骨形成の調節に有用な医薬組成物であって、治療
上有効量の骨芽細胞系細胞におけるアポトーシスを阻害する化合物を含む医薬組
成物を提供することにある。
【００１３】 本発明のさらに別の目的は、骨形成の調節に有用な医薬組成物であって、治療
上有効量の骨芽細胞系細胞におけるアポトーシスを阻害する化合物を含む医薬組
成物を提供することにある。
【００１４】 本発明のさらに別の目的は、骨芽細胞系細胞におけるアポトーシスを阻害する
上で有用な化合物を確認することにある。
【００１５】 上記および他の目的は、以下の詳細な説明から容易に理解されよう。
【００１６】 （発明の開示） 本発明は、哺乳動物における骨形成の調節方法において、処置を必要とする哺
乳動物に対して、治療上有効量の、骨芽細胞系細胞におけるアポトーシスを阻害
する化合物を投与する段階を有することを特徴とする方法に関する。
【００１７】 別の実施態様において本発明は、 本発明の別の目的は、治療またはリスク低下を必要とする哺乳動物における骨
関連疾患状態を治療したり、それへの罹患のリスクを低下させる方法において、
その哺乳動物に対して治療上有効量の骨芽細胞系細胞におけるアポトーシスを阻
害する化合物を投与する段階を有することを特徴とする方法に関する。
【００１８】 さらに別の実施態様において本発明は、哺乳動物での骨形成の調節方法におい
て、治療上有効量の骨芽細胞系細胞におけるアポトーシスを阻害する化合物およ
びビスホスホネート活性成分を投与する段階を含むことを特徴とする方法に関す
る。
【００１９】 さらに別の実施態様において本発明は、治療上有効量の骨芽細胞系細胞におけ
るアポトーシスを阻害する化合物を含む医薬組成物に関する。
【００２０】 さらに別の実施態様において本発明は、治療上有効量の骨芽細胞系細胞におけ
るアポトーシスを阻害する化合物およびビスホスホネート活性成分を含む医薬組
成物に関する。
【００２１】 さらに別の実施態様において本発明は、哺乳動物での骨形成を調節する医薬の
製造における組成物の使用であって、処置を必要とする哺乳動物に対して治療上
有効量の骨芽細胞系細胞におけるアポトーシスを阻害する化合物を投与する段階
を含むことを特徴とする組成物の使用に関する。
【００２２】 本明細書で使用されるパーセントおよび比はいずれも、別段の断りがない限り
重量基準である。本明細書における発明は、本明細書に記載の必須ならびに適宜
の成分、構成要素および方法を含んだり、それらから成ったり、あるいは本質的
にそれらから成ることができる。
【００２３】 （発明を実施するための最良の形態） 本発明は、哺乳動物における骨形成の調節方法において、処置を必要とする哺
乳動物に対して、治療上有効量の骨芽細胞系細胞におけるアポトーシスを阻害す
る化合物を投与する段階を有することを特徴とする方法に関する。
【００２４】 解剖学的に長骨の外部皮質の被覆（lining）組織と定義される骨膜は、生涯を
通じて骨成長において役割を果たすものである。骨膜は線維層および骨形成層と
いう２層から構成される。線維層は低細胞性（hypocellular）であって、主とし
て線維芽細胞およびコラーゲン性基質からなる。骨形成層は、付加的骨形成およ
び長骨の放射方向成長を行う骨芽細胞に分化する骨芽細胞前駆体の薄層からなる
。
【００２５】 骨膜骨発生はいくつかの刺激の制御下にある。形質転換成長因子（ＴＧＦ）ｂ
１、骨形態形成蛋白、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｅ２または塩基性線維芽細胞
成長因子（ｂＦＧＦ）の骨膜への局所注射によって、広範囲の骨膜骨形成が誘発
される。現在までのところ、確立されたin vitro骨膜細胞系がないために、これ
らおよび他の骨形成因子に対する細胞応答の理解には限界がある。本発明では、
培養で脛骨骨膜細胞から自然に不死化されたラット骨膜細胞系（ＲＰ−１）を確
立している。このＲＰ−１細胞は、in vitroで骨芽細胞表現型のマーカーを発現
し、in vivoに置くと、石灰化基質を産生する。骨膜骨形成の強力な誘発剤であ
るプロスタグランジンＰＧＥ２は、ＲＰ−１細胞の寿命を長くすることで、その
細胞数を増やすことが認められている。骨代謝すなわち骨形成などのプロセスは
、骨組織におけるアポトーシス細胞死に影響する薬剤によって調節される。すな
わち、骨芽細胞系細胞のアポトーシス阻害剤が、骨形成の調節に有用であること
が認められている。
【００２６】 本発明においては、ＲＰ−１細胞が培養で分化することができる骨芽細胞前駆
体の特徴を示し、集密時に骨芽細胞マーカーを発現し、細胞外基質を石灰化する
ことが認められている。ＲＰ−１細胞がin vivoで石灰化基質を形成する能力は
、ヌードマウスで調べる。ＲＰ−１細胞施主から６〜８週間後、注射部位で触知
可能な腫瘍が検出されることが認められている。腫瘍が骨組織を含むか否かを確
認するには、パラフィン切片について無機物含有率ならびにアルカリホスファタ
ーゼ（ＡＬＰ）およびオステオカルシン（ＯＣ）の発現を分析する。ＲＰ−１細
胞がヌードマウスにおいてin vivoで分化し、骨芽細胞表現型マーカーを発現し
、石灰化基質を形成できることが認められる。
【００２７】 プロスタグランジンＥ２はアポトーシスを抑制することでＲＰ−１骨膜細胞数
を増加させる。ＰＧＥ２はラットおよびヒトにおいてin vivoで骨膜骨形成の強
力な誘発剤であることが知られている。本発明においては、ＲＰ−１骨膜細胞に
対するＰＧＥ２の効果が示される。５日間にわたって２％血清存在下にＰＧＥ２ （０．０１μＭ〜１μＭ）でＲＰ−１細胞を処理することで用量依存的に細胞数
が増加し、１μＭで効果が最大であることが認められている。細胞数増加は、こ
れら細胞の増殖増加および／または寿命延長によって生じるものと考えられる。
しかしながら、ＰＧＥ２はＲＰ−１細胞における［３Ｈ］チミジン取り込みに対
してほとんど効果を持たないことが認められており、細胞数増加は増殖増加の結
果ではないことを示している。
【００２８】 ＲＰ−１細胞生存に対するＰＧＥ２の効果について調べる。フローサイトメト
リーによるＤＮＡ含有量の定量分析により、２％ＦＢＳ存在下に４８時間の培養
後にＲＰ−１細胞の１５％がアポトーシスを受けることが明らかである。ＰＧＥ ２ （１μＭ）はアポトーシスを４８％抑制する。ＰＧＥ２によるＲＰ−１におけ
るアポトーシスの抑制は、トランスフェラーゼ介在ジゴキシゲニン（digoxygeni
n）−ｄＵＴＰニック末端標識（以下、「ＴＵＮＥＬ」と称する）を用いてin si
tuで認められる。ＰＧＥ２は、断片化ＤＮＡを含む陽性染色核数を大幅に低下さ
せる。ＰＧＥ２は、アポトーシスを抑制することでＰＲ−１細胞数を増加させる
ことが認められる。
【００２９】 これまで、成体骨組織におけるアポトーシス発生に関して得られているデータ
は限られていた。本発明では、成体ラット脛骨のパラフィン切片についてＴＵＮ
ＥＬ染色を行うと、骨膜、内骨膜、海綿骨表面および骨髄などの各種骨部位で陽
性染色核が示される。骨細胞におけるアポトーシス発生はこれらの細胞の寿命を
ＰＧＥ２などの骨栄養（osteotrophic）因子によって調節できることを示してい
ることが認められる。
【００３０】 本発明においては、成体ラット脛骨由来の一次骨膜細胞培養物から自然に不死
化したＲＰ−１細胞が初期培養で高レベルのＣＯＬ−１ｍＲＮＡを発現し、次に
ＡＬＰおよびＯＣｍＲＮＡ類を発現し、最後に結節形成および石灰化を起こすこ
とが認められている。ＲＰ−１細胞における骨芽細胞表現型マーカーの順次発現
は、頭蓋冠、骨髄およびヒナ脛骨骨膜由来一次細胞培養物の分化時に認められる
ものと同様である。ＲＰ−１細胞のin vivo接種によって、石灰化基質を含む腫
瘍が生成する。アルカリホスファターゼおよびオステオカルシン染色は、これら
２種類の骨芽細胞マーカーの分布が異なることを示しており、ＯＣは腫瘍の中心
における石灰化病巣の細胞に関連し、ＡＬＰは末梢細胞に局在している。
【００３１】 in vivoでの骨膜骨形成は各種ホルモン刺激および物理的刺激によって調節さ
れるが、その作用機序は未解明である。in vivoでＰＧＥ２は、骨表面での活性
骨芽細胞数を増加させることで骨形成を刺激する。これは、新たな骨芽細胞前駆
体の補充を刺激することで、ないしは骨表面での既存の骨芽細胞の寿命を延長さ
せることで起こり得るものである。本発明においては、増殖に影響することなく
アポトーシスを抑制することで、in vitroでＰＧＥ２がＲＰ−１骨膜細胞数を増
加させることが認められる。同様の効果が、ＰＧＥ１およびフォルスコリンを用
いても認められる。理論に拘束されるものではないが、サイクリックＡＭＰがこ
のプロセスに介在していると考えられている。
【００３２】 プロスタグランジンＥ（特にＰＧＥ２）は、ヒトを含むいくつかの動物で骨吸
収を刺激し、骨量を増加させる。その効果の機序、標的細胞および関与する受容
体については完全にはわかっていない。異なった二次伝達物質系を用いるＥＰ１ −４ などのＰＧＥ２に対する特異的細胞表面受容体がクローニングおよび特性決
定されている。サイクリックＡＭＰがＰＧＥ２誘発骨形成において何らかの役割
を有する可能性があると考えられている。ｃＡＭＰ経路に共役したＥＰ２および
ＥＰ４受容体の発現に関して、若齢成体ラットの骨組織（ＰＧＥ２が顕著に同化
性である）および各種骨芽細胞系で研究が行われている。骨芽細胞系ＲＣＴ−１
、ＲＣＴ−３、ＴＲＡＢ−１１およびＲＰ−１ならびにラット胎仔骨から得られ
る骨芽細胞はＥＰ４ｍＲＮＡを発現するが、ＥＰ２ｍＲＮＡは発現しない。さら
に、ＥＰ４ｍＲＮＡは５週齢ラットの脛骨および頭蓋冠で発現されるが、ＥＰ２ は発現されない。in vitroで１０−６Ｍ ＰＧＥ２によって骨膜細胞を処理する
と、ＥＰ４ｍＲＮＡのレベルが上昇し、２時間後にピークとなる。同様に、若齢
成体ラットに対する同化用量のＰＧＥ２（３〜６ｍｇ／ｋｇ）の全身投与によっ
て脛骨および頭蓋冠でのＥＰ４の発現が上昇し、その効果は１〜２時間後にピー
クとなる。in situでのハイブリダイゼーションを用いると、全身ＰＧＥ２投与
後の脛骨骨幹端におけるＥＰ４ｍＲＮＡの発現上昇が骨髄細胞に局在しているこ
とが認められる。
【００３３】 ＥＰ４はin vitroで骨芽細胞で発現され、in vivoで骨髄の推定骨髄原細胞で
発現され、それのリガンドであるＰＧＥ２によって上昇する。調べた細胞ならび
に骨組織でのＥＰ４発現の存在を考慮して、ＥＰ４がＰＧＥ２の同化効果に介在
する受容体サブタイプであると考えられている。
【００３４】 プロスタグランジン類（特にＰＧＥ２）は、骨吸収および骨形成を刺激して骨
に対して複数の効果を有する。乳児および動物へのＰＧＥ２またはＥ１の全身投
与は骨形成を刺激して明らかに同化性であり、骨量を増加させる。さらに長骨内
へのＰＧＥ２の局所投与は新たな骨形成を刺激し、ＰＧＥ２が骨組織に直接作用
して骨形成を誘発することを示唆している。ＰＧＥ２投与した骨の組織学的分析
は、ＰＧＥ２が骨表面に存在する骨芽細胞数を増加させることを示しており、プ
ロスタグランジン類が骨芽細胞の前駆物質から骨芽細胞を供給することで作用す
ることを示唆している。
【００３５】 ＰＧＥ類は、選択的作働薬および拮抗薬に対する相対的感受性に従って４種類
のサブタイプＥＰ１−４に分けられ細胞表面の特異的な受容体を介して、様々な
細胞に作用する。それらの受容体サブタイプはＧ蛋白共役型受容体ファミリーに
属し、アデニル酸シクラーゼまたはホスホリパーゼＣなどの異なる二次伝達物質
系を活性化する。これら４種類の受容体のうち、ＥＰ４およびＥＰ２はアデニル
酸シクラーゼを活性化し、ＥＰ１はホスホリパーゼＣを活性化し、ＥＰ３は特異
的なスプライス変異体に応じてｃＡＭＰレベルを低下させるかもしくはホスホリ
パーゼＣを活性化する。
【００３６】 in vitroでの骨芽細胞では、ＰＧＥ２はホスファチジルイノシトール伝達経路
およびサイクリックＡＭＰ伝達経路の両方を刺激する。ＥＰ１とＥＰ４はいずれ
も骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞で認められ、骨組織におけるＰＧＥ２の生理作
用において何らかの役割を果たす。さらに、ヒトその他の動物における骨形成の
強力な誘発剤であるＰＧＥ１は、細胞内サイクリックＡＭＰを増加させるが、骨
芽細胞におけるホスファチジルイノシトール代謝には効果がない。理論に拘束さ
れるものではないが、従ってアデニル酸シクラーゼに共役したＰＧＥ受容体であ
るＥＰ２および／またはＥＰ４は骨形成に関与すると考えられている。in situ
ハイブリダイゼーションによるＥＰ受容体のin vivo発現の最初の特性決定から
、マウス胎仔および新生仔において、ＥＰ４が骨組織、特に骨芽前駆細胞で認め
られる主要形態であることが明らかになっている（Ikeda T, Miyaura C, Ichika
wa A, Narumiya S, Yoshiki S and Suda T, 1995, In situ localization of th
ree subtypes (EP1, EP3 and EP4) of prostaglandin E receptors in embryoni
c and newborn mice. J. Bone Miner Res 10 (sup 1): S172およびR. S. Weinst
ein et al., Inhibition of osteoblastogenesis and promotion of apoptosis
of osteoblasts and osteocytes by glucocorticoids -- Potential mechanisms
of their deleterious effects on bone, J. of Clinical of Investigation,
102 (2), pp.274-282 (1998)参照；引用によって全内容が本明細書に含まれるも
のとする）。
【００３７】 さらに、ＥＰ４ｍＲＮＡは成体ラット骨組織および骨由来細胞系で発現される
がＥＰ２ｍＲＮＡは発現されず、発現はＰＧＥ２によって刺激されることが認め
られている。
【００３８】 ＰＧＥ受容体のin vivo発現の分析から、ＥＰ４が成体ラット脛骨および頭蓋
冠からの総ＲＮＡで発現されるがＥＰ２は発現されないことが明らかである。Ｅ
Ｐ４は、骨芽細胞および骨組織で発現される主要なアデニル酸シクラーゼ共役型
ＰＧＥ２受容体であると考えられている。さらに、ＥＰ４受容体サブタイプは、
ＰＧＥ２が強力に同化性である若齢成体ラットの骨組織で発現される。
【００３９】 ＥＰ４ｍＲＮＡは骨芽前駆細胞で発現される。それはＲＣＴ−１、ＴＲＡＢ−
１１およびＲＰ−１骨膜細胞などの分化の相対的に低い骨細胞で認められるが、
骨芽細胞では認められない。それは、骨芽前駆細胞を含む骨髄細胞でかなり発現
されるが、骨表面の十分に成熟した骨芽細胞では発現されない。ＰＧＥ２は、既
存の骨芽細胞の活性促進ではなく骨芽前駆細胞の供給によって生じる、骨表面に
存在する活性骨芽細胞数増加を介して骨形成を誘発すると考えられている。
【００４０】 骨芽前駆細胞はＰＧＥ２の同化効果における主要な標的細胞であり、その細胞
におけるＰＧＥ２の作用にはＥＰ４が介在することが認められている。ＥＰ４受
容体サブタイプは、ラット骨組織でのＰＧＥ２の効果に介在する主要な受容体で
あると考えられている。ＰＧＥ２によるＥＰ４の誘発はさらに、それの骨組織に
おける生理的役割を裏付けるものであり、ＰＧＥ作用の自己増幅の機序を示唆す
るものである。
【００４１】 プロスタグランジン類およびプロスタグランジン受容体サブタイプについて知
られている科学データはあっても、これまでに、骨芽細胞系細胞のアポトーシス
阻害薬が骨形成の調節に有用である可能性があることは明記も示唆もされていな
い。
【００４２】 骨形成調節方法 本発明は、哺乳動物における骨形成の調節方法において、処置を必要とする哺
乳動物に対して治療上有効量の骨芽細胞系細胞におけるアポトーシス阻害薬を投
与する段階を有することを特徴とする方法に関するものである。本明細書で使用
される「骨形成を調節」という用語は、骨の形成すなわち骨の構築または骨形成
に関与する生化学的プロセスを、本発明の治療薬を投与することで変化、修正ま
たは実行することを意味する。「骨形成調節」とはまた、骨形成刺激を含むもの
でもある。
【００４３】 本明細書で使用される「骨芽系細胞」という用語は、骨芽細胞、骨細胞および
骨被覆細胞ならびに分化してこれらの細胞を生じることができる他の全ての細胞
を含む細胞を意味するものである。すなわちこの用語は、骨の形成（すなわち骨
形成）に関与するそのような全ての関連細胞を含むものである。「骨芽細胞系細
胞」という用語は、破骨細胞および分化して破骨細胞を発生し得る他の関連する
細胞などの骨吸収細胞を特に除外するものである。骨芽細胞系細胞の例としては
ＲＰ−１細胞があるがこれに限定されるものではない。
【００４４】 本発明の方法および組成物は、骨代謝異常に関連する疾患状態の治療およびそ
れへの罹患のリスク低下において有用である。そのような疾患状態には、骨粗鬆
症、糖質コルチコイド誘発骨粗鬆症、ページェット病、骨代謝異常亢進、歯周病
、歯喪失、骨折、慢性関節リウマチ、補綴具周囲骨溶解、骨形成不全症、転移骨
疾患、悪性腫瘍の高カルシウム血症および多発性骨髄腫などがあるが、これらに
限定されるものではない。
【００４５】 さらに別の実施態様において本発明の方法は、治療上有効量の骨芽細胞系細胞
におけるアポトーシス阻害性化合物およびビスホスホネート活性成分を投与する
段階を含む。前記阻害薬およびビスホスホネートの同時投与および順次投与のい
ずれも本発明の範囲に含まれるものと考えられる。順次投与を行う場合、阻害薬
とビスホスホネートはいずれかの順序で投与することができる。順次投与のある
小群では、同じ２４時間期間内に阻害薬とビスホスホネートを投与するのが代表
的である。さらに別の小群では、阻害薬とビスホスホネートを互いに約４時間以
内に投与するのが代表的である。
【００４６】 本明細書で使用される「治療上有効量」という用語は、所望の投与法に従って
投与した場合に、所望の治療効果もしくは応答を誘発したり、所望の利益を提供
する骨芽細胞系細胞のアポトーシス阻害薬その他の本発明の活性成分の量を意味
する。好ましい治療上有効量は骨形成を調節する量である。
【００４７】 本明細書で使用される「医薬的に許容される」という用語は、毒性上または安
全上の見地から、ヒトなどの哺乳動物への投与に適していることを意味している
。
【００４８】 本発明において阻害薬は代表的には、所望の治療効果が得られるまでの十分な
期間にわたって投与する。本明細書で使用される「所望の治療効果が得られるま
で」という用語は、介在される疾患または状態に関して求めている臨床的もしく
は医学的効果を臨床医または研究者が認める時点まで、選択された投与スケジュ
ールに従って治療薬を連続的に投与することを意味する。本発明の治療方法に関
しては、骨量または骨構造における所望の変化が認められるまで化合物を連続的
に投与する。そのような場合、骨量増加の達成または異常な骨構造の正常な骨構
造への置換が所望の目的である。疾患状態のリスク低減方法に関しては、望まし
くない状態を予防する上で必要な期間にわたって化合物を連続的に投与する。そ
のような場合、骨無機物密度の維持が目的であることが多い。
【００４９】 投与期間の例としては約２週間から哺乳動物の残りの寿命までの範囲があり得
るが、それに限定されるものではない。ヒトの場合、投与期間は約２週間からそ
のヒトの残りの寿命、好ましくは約２週間から約２０年、より好ましくは約１ヶ
月から約２０年間、さらに好ましくは約６ヶ月から約１０年間、最も好ましくは
約１年から約１０年間の範囲を取り得る。
【００５０】 骨芽細胞系細胞のアポトーシス阻害薬の確認方法 本発明はさらに、骨芽細胞系細胞のアポトーシスの阻害薬として有用な化合物
の確認方法に関するものでもある。そのようにして確認される化合物は、骨形成
刺激において有用である。
【００５１】 本発明は、骨芽細胞系細胞のアポトーシスを阻害する化合物の確認方法におい
て、 ａ）骨芽細胞系細胞のアポトーシスの推定阻害薬と細胞培養物とを接触させる
段階；ならびに ｂ）そのように接触した細胞培養物（すなわち、前記推定阻害薬と接触した細
胞培養物）と前記推定阻害薬と接触していない細胞培養物とを比較することで阻
害を求める段階 を有することを特徴とする方法に関するものである。
【００５２】 本発明の組成物 本発明の医薬組成物は、治療上有効量の骨芽細胞系細胞のアポトーシス阻害薬
を含むものである。
【００５３】 これらの組成物はさらに、医薬的に許容される担体を含むことができる。さら
に別の実施態様では、これら組成物はさらにビスホスホネート活性成分を含む。
【００５４】 骨芽細胞系細胞のアポトーシスの阻害薬 本発明の方法および組成物は骨芽細胞系細胞のアポトーシス阻害薬を含むもの
である。
【００５５】 アポトーシスとは、in vitroまたは生物でのプログラムされた細胞死の正常な
プロセスである。
【００５６】 本発明の阻害薬は、骨芽細胞系細胞のアポトーシスを阻害または抑制すること
が認められている。それらの化合物は、約０．１ｎＭ〜約１０μＭのＥＣ５０値
を有する。本発明の別の小群においては、これら化合物は約０．０１μＭ〜約１
μＭのＥＣ５０値を有する。本発明のさらに別の小群では、これら化合物は約０
．１μＭ〜約１μＭのＥＣ５０値を有する。
【００５７】 ＥＣ５０値は当業者であれば熟知しているパラメータであり、最大応答の５０
％低下を得る上で必要な阻害薬の濃度または用量と定義される（Goodman and Gi
lman’s, The Pharmacologic Basis of Therapeutics, 9th edition, 1996, cha
pter 2, E. M. Ross, Pharmacodynamics, Mechanisms of Drug Action and the
Relationship Between Drug Concentration and Effectも参照；引用によって全
体が本明細書に含まれるものとする）。
【００５８】 阻害薬の例としては、プロスタグランジンＥ１、プロスタグランジンＥ２、フ
ォルスコリン（７β−アセトキシ−８，１３−エポキシ−１α，６β，９α−ト
リヒドロキシルアブド−１４−エン−１１−オン）、カスパーゼ（caspase）阻
害薬、ならびにそれらに混合物からなる群から選択されるが、これらに限定され
るものではない。
【００５９】 本発明で有用なカスパーゼ阻害薬は比較的短い含アスパラギン酸ペプチド類で
ある。ただし、非ペプチド系阻害薬も本発明の範囲に含まれるものである。本明
細書で使用される「比較的短い」という用語は、ペプチドが代表的には長さで約
３〜約５アミノ酸を含むことを意味する。「含アスパラギン酸」という用語は、
そのペプチドが好ましくはカルボキシ末端に１以上のアスパラギン酸部分を含む
ことを意味する。このペプチドは好ましくは、封鎖基によってアミノ末端および
カルボキシ末端のいずれも封鎖されている。
【００６０】 本発明で有用なカスパーゼ阻害薬は、下記化学式によって表すことができる。
【００６１】
【化４】 式中、（ＡＴＢＧ）はアミノ末端封鎖基であり、（ＡＡ）はアミノ酸部分であ
り、「Ａｓｐ」はアスパラギン酸部分であり、（ＣＴＢＧ）はカルボキシ末端基
封鎖基であり、ｎは約２〜約４の整数である。カスパーゼ阻害薬においては、ア
ミノ酸（ＡＡ）は天然アミノ酸のいずれか、天然アミノ酸のＤ−エナンチオマー
（例えば、Ｄ−アラニン）、ならびに非天然アミノ酸（例えば、３−アミノプロ
ピオン酸およびＮ−メチルグリシン）から選択することができる。（ＡＴＢＧ）
部分および（ＣＴＢＧ）部分は、当業界で通常の技術を有するペプチド化学者に
は公知の封鎖基から選択される（Greene, T. W. et al., Protecting Groups in
Organic Synthesis, 2nd edition, 1991, John Wiley & Sons, Inc.参照；引用
によってその全内容が本明細書に含まれる）。（ＡＴＢＧ）部分の例としては、
ベンジルオキシカルボニル基（ｃｂｚまたはＺ基とも称される）およびｔ−ブト
キシカルボニル基（ｂｏｃ基とも称される）およびアシル基があるが、これらに
限定されるものではない。（ＣＴＢＧ）部分の例としては、アルキル基（例えば
、メチルエステルおよびエチルエステル）、ベンジル基、ならびにフルオロメチ
ルケト基［（ＯＭｅ）−ＣＨ２ＦまたはＦＭＫと略される］があるが、これらに
限定されるものではない。
【００６２】 本発明で有用なカスパーゼ阻害薬の例は、１９９３年５月１１日にパルマー（
Palmer）らに発行された米国特許５，２１０，２７２号、１９９２年３月３１日
にパルマーらに発行された米国特許５，１０１，０６８号および１９８５年５月
２１日にラスニック（Rasnick）に発行された米国特許４，５１８，５２８号（
これらはいずれも引用によって全内容が本明細書に含まれるものとする）に開示
されているが、これらに限定されるものではない。本発明で好ましいカスパーゼ
阻害薬は、Ｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＦＭＫ（約４６８の分子量を有する）
、Ｚ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＦＭＫ（約６６８の分子量を有する）
およびＺ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＦＭＫ（約６３０の分子量を有す
る）ＭＷ６３０からなる群から選択される。以上の記載においては、標準的な３
文字アミノ酸略称を用いている。
【００６３】 ビスホスホネート類 本発明の方法および組成物はさらに、ビスホスホネート活性成分を含むことが
できる。本発明のビスホスホネート類は下記の化学式に相当するものである。
【００６４】
【化５】 式中、ｎは０〜７の整数であり；ＡおよびＸは独立に、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、
ＮＨ２、ＳＨ、フェニル、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ３〜Ｃ３０分枝もしくはシ
クロアルキル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換ＮＨ２、
Ｃ３〜Ｃ１０分枝もしくはシクロアルキル置換ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ１０ジアルキル
置換ＮＨ２、Ｃ３〜Ｃ１０分枝もしくはシクロアルキルジ置換ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ １０ アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換チオ、チオフェニル、ハロフェニル
チオ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換フェニル、ピリジル、フラニル、ピロリジニル
、イミダゾリル、イミダゾピリジニルおよびベンジルからなる群から選択され；
ｎが０の場合にはＡおよびＸのいずれもＨおよびＯＨからは選択されず；あるい
はＡおよびＸが、それらが結合している１個もしくは複数の炭素原子と一体とな
ってＣ３〜Ｃ１０環を形成している。
【００６５】 前記化学式において、アルキル基は直鎖、分枝または環状であることができる
。ただし、その化学式には十分な原子が選択される。Ｃ１〜Ｃ３０置換アルキル
は、非常に多様な置換基を含むことができ、その例としてはフェニル、ピリジル
、フラニル、ピロリジニル、イミダゾニル、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルもし
くはジアルキル置換ＮＨ２、ＯＨ、ＳＨおよびＣ１〜Ｃ１０アルコキシからなる
群から選択されるものなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】 前記の化学式はまた、Ａおよび／またはＸ置換基に関して複雑な炭素環構造、
芳香族構造およびヘテロ原子構造を含むものであり、その例としてはナフチル、
キノリル、イソキノリル、アダマンチルおよびクロロフェニルチオなどがあるが
、これらに限定されるものではない。
【００６７】 本発明で有用な構造の群は、ＡがＨ、ＯＨおよびハロゲンからなる群から選択
され、ＸがＣ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルキル、ハロゲンおよび
Ｃ１〜Ｃ１０アルキルもしくはフェニル置換チオからなる群から選択され、ｎが
０であるものであるが、それに限定されるものではない。
【００６８】 本発明で有用な構造の小群は、ＡがＨ、ＯＨおよびＣｌからなる群から選択さ
れ；ＸがＣ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルキル、Ｃｌおよびクロロ
フェニルチオからなる群から選択され；ｎが０であるものであるが、それに限定
されるものではない。
【００６９】 本発明で有用な構造の小群の例としては、ＡがＯＨであり；Ｘが３−アミノプ
ロピル部分であり；ｎが０であって、得られる化合物が４−アミノ−１，−ヒド
ロキシブチリデン−１，１−ビスホスホネートすなわちアレンドロネート（alen
dronate）である場合であるが、それに限定されるものではない。
【００７０】 上記ビスホスホネート類の医薬的に許容される塩および誘導体は本発明におい
ても有用である。塩の例としては、アルカリ金属、アルカリ性金属、アンモニウ
ムならびにモノ−、ジ−、トリもしくはテトラ−Ｃ１〜Ｃ３０アルキル置換アン
モニウムからなる群から選択されるものなどがあるが、これらに限定されるもの
ではない。好ましい塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシ
ウム塩およびアンモニウム塩からなる群から選択されるものである。誘導体の例
としてはエステル類、水和物類およびアミド類からなる群から選択されるものな
どがあるが、これらに限定されるものではない。
【００７１】 留意すべき点として、本発明の治療薬に関して本明細書で使用される「ビスホ
スホネート」および「ビスホスホネート類」という用語は、ジホスホネート類、
ビホスホン酸類およびジホスホン酸類、ならびにこれら材料の塩および誘導体を
も含むことを意味するものである。ビスホスホネートまたはビスホスホネート類
に関する具体的な命名法の使用は、具体的に指示がない限りにおいて、本発明の
範囲を制限するものではない。当業界で通常の技術を有する者は現在のところ混
在した命名法を使用していることから、本発明におけるビスホスホネート化合物
の具体的な重量またはパーセントは、本明細書で別段の断りがない限り酸活性成
分の重量に基づいたものである。例えば、「アレンドロン酸活性成分重量基準で
、アレンドロネート、それの医薬的に許容される塩およびそれらの混合物からな
る群から選択されるビスホスホネート約５ｍｇ」という表現は、選択されるビス
ホスホネート化合物の量がアレンドロン酸５ｍｇに基づいて計算されることを意
味する。他のビスホスホネート類の場合、ビスホスホネートの量は、相当するビ
スホスホン酸に基づいて計算される。
【００７２】 本発明で有用なビスホスホネート類の例としては以下のものなどがあるが、こ
れらに限定されるものではない。
【００７３】 アレンドロン酸すなわち４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビ
スホスホン酸。
【００７４】 アレンドロネート（アレンドロネートナトリウムもしくはアレンドロネート一
ナトリウム・３水和物とも称される）すなわち４−アミノ−１−ヒドロキシブチ
リデン−１，１−ビスホスホン酸一ナトリウム・３水和物。
【００７５】 アレンドロン酸およびアレンドロネートは、各種特許（キエチコウスキー（Ki
eczykowski）らに１９９０年５月１日に発行された米国特許４，９２２，００７
号、キエチコウスキーらに１９９１年５月２８日に発行された米国特許５，０１
９，６５１号、ダウアー（Dauer）らに１９９６年４月２３日に発行された米国
特許５，５１０，５１７号、ダウアーらに１９９７年７月１５日に発行された米
国特許５，６４８，４９１号）に記載されている（これらはその全内容が引用に
よって本明細書に含まれるものとする）。
【００７６】 イソムラ（Isomura）らに１９９０年１１月１３日に発行された米国特許４，
９７０，３３５号（引用によってその全内容が本明細書に含まれるものとする）
に記載のシクロヘプチルアミノメチレン−１，１−ビスホスホン酸ＹＭ１７５（
ヤマノウチ（Yamanouchi）（シマドロネート（cimadronate）））。
【００７７】 １，１−ジクロロメチレン−１，１−ジホスホン酸（クロドロン酸（clodroni
c acid）および二ナトリウム塩（クロドロン酸塩、Procter and Gamble）が、ベ
ルギー特許６７２，２０５号（１９６６）およびJ. Org. Chem. 32, 4111 (1967
)に記載されている（これら文献はいずれも引用によってその全内容が本明細書
に含まれるものとする）。
【００７８】 １−ヒドロキシ−３−（１−ピロリジニル）−プロピリデン−１，１−ビスホ
スホン酸（ＥＢ−１０５３）。
【００７９】 １−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸（エチドロン酸（etidronic ac
id））。
【００８０】 １−ヒドロキシ−３−（Ｎ−メチル−Ｎ−ペンチルアミノ）プロピリデン−１
，１−ビスホスホン酸（ＢＭ−２１０９５５とも称される；Boehringer-Mannhei
m（イバンドロネート（ibandronate））が、１９９０年５月２２日発行の米国特
許４，９２７，８１４号（引用によってその全内容が本明細書に含まれるものと
する）に記載されている。
【００８１】 ６−アミノ−１−ヒドロキシヘキシリデン−１，１−ビスホスホン酸（ネリド
ロネート（neridronate））。
【００８２】 ３−（ジメチルアミノ）−１−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ビスホスホ
ン酸（オルパドロネート（olpadronate））。
【００８３】 ３−アミノ−１−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ビスホスホン酸（パミド
ロネート（pamidronate））。
【００８４】 ［２−（２−ピリジニル）エチリデン］−１，１−ビスホスホン酸（ピリドロ
ネート（piridronate））が米国特許４，７６１，４０６号（引用によってその
全内容が本明細書に含まれるものとする）に記載されている。
【００８５】 １−ヒドロキシ−２−（３−ピリジニル）−エチリデン−１，１−ビスホスホ
ン酸（リセドロネート（risedronate））。
【００８６】 ブレリエール（Breliere）らへの１９８９年１０月２４日の米国特許４８７６
２４８号（引用によってその全内容が本明細書に含まれるものとする）に記載の
（４−クロロフェニル）チオメタン−１，１−ジホスホン酸（チルドロネート（
tiludrnate））。
【００８７】 １−ヒドロキシ−２−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）エチリデン−１，１
−ビスホスホン酸（ゾレンドロネート（zolendronate））。
【００８８】 本発明で有用なビスホスホネート類の群は、アレンドロネート、シマドロネー
ト、クロドロネート、チルドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、ネ
リドロネート、オルパンドロネート、リセドロネート、ピリドロネート、パミド
ロネート、ゾレンドロネート、それらの医薬的に許容される塩ならびにそれらの
混合物からなる群から選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００８９】 この場合における上記群の小群は、アレンドロネート、それの医薬的に許容さ
れる塩およびそれらの混合物からなる群から選択されるが、それらに限定される
ものではない。
【００９０】 当該小群の例としてはアレンドロネート一ナトリウム・３水和物があるが、そ
れに限定されるものではない。
【００９１】 医薬組成物の他の成分 骨芽細胞系細胞のアポトーシス阻害薬ならびにさらなる実施態様においてビス
ホスホネート活性成分および他の追加活性成分は代表的には、投与形態に関して
好適に選択される本明細書において総称的に「担体材料」と称される、好適な医
薬的に許容される希釈剤、賦形剤または担体との混合物で投与される。製剤の例
としては、錠剤、カプセル、エリキシル剤、シロップ、粉剤、坐剤、鼻噴霧剤、
点眼液、経皮投与用製剤など、従来の医薬上の実務に一致するが、これらに限定
されるものではない。例えば錠剤、カプセルもしくは粉剤の形で経口投与する場
合には有効成分を、乳糖、デンプン、ショ糖、グルコース、メチルセルロース、
ステアリン酸マグネシウム、マニトール、ソルビトール、クロスカルメロースナ
トリウムなどの経口用で無毒性の医薬的に許容される不活性担体と組み合わせる
ことができる。エリキシル剤およびシロップなどの液体の形で経口投与する場合
には経口薬剤成分は、エタノール、グリセリン、水などの経口用で無毒性の医薬
的に許容される不活性担体と組み合わせることができる。さらに所望または必要
に応じて、好適な結合剤、潤滑剤、崩壊剤および着色剤も組み込むことができる
。好適な結合剤には、デンプン；ゼラチン；グルコース、無水乳糖、自由流動乳
糖、β−乳糖およびコーン甘味剤などの天然糖類；アカシア、グアー、トラガカ
ントもしくはアルギン酸ナトリウムなどの天然および合成ガム類；カルボキシメ
チルセルロース、ポリエチレングリコール、ロウなどがあり得る。これら製剤で
使用される潤滑剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステ
アリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム
などがある。錠剤製剤の例としては、ベチャード（Bechard）らに１９９４年１
０月２５日に発行された米国特許５，３５８，９４１号（引用によってその全内
容が本明細書に含まれるものとする）に記載のものがある。本発明で使用される
化合物は、標的指向性薬物剤担体としての可溶性ポリマーと組み合わせることも
できる。そのようなポリマーには、ポリビニルピロリドン、ピラン共重合体、ポ
リヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどがあり得る。
【００９２】 以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するためのものである。
【００９３】 実施例 １．骨膜細胞単離および不死化 ２〜３週齢のスプレーグ・ドーリーラット（Sprague Dawley rat、Taconic, G
ermantown, NY）の脛骨の前内側表面から骨膜を切除する。集めた骨膜を小片に
切り、３７℃で１時間にわたってコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）消化を行って骨
膜細胞を放出させる。一次骨膜細胞を、１０％ＦＢＳを補給したＤＭＥＭ存在下
に培養し、毎週継代培養する。培養６週後に形成する細胞コロニーをクローニン
グシリンダーを用いて単離し、希釈を制限することでサブクローニングを行う。
ＲＰ−１クローナル骨膜細胞系を選択および特性決定する（A. Grigoriadis et
al., In vitro differentiation of bone and hypertrophic cartilage from pe
riosteal-derived cells，Differentiation, 60, 229-307 (1996)およびH. Naka
hara et al., Bone and cartilage formation in diffusion chambers by subcu
ltured cells derived from the periosteum, Bone, 11, 181-188 (1990)参照；
これらはいずれも引用によってその全内容が本明細書に含まれる）。
【００９４】 ２．細胞培養および染色 １０％ウシ胎仔血清を補給したＤＭＥＭ中でＲＰ−１細胞を培養する。細胞数
に対するＰＧＥ２効果を測定するには、ＲＰ−１細胞を２４ウェルプレート（Co
star, Cambridge, MA）に細胞１０００００個／ウェルで播種し、２４時間培養
する。細胞を２％血清を補給した培地でＰＧＥ２（１０−７〜１０−８Ｍ）の存
在下または非存在下に培養する。５日後、細胞をトリプシン処理し、コールター
カウンター（Coulter Electronics LTD, Lutton, England）を用いてカウントす
る。
【００９５】 ＡＬＰ染色では、ＲＰ−１細胞を２４ウェルプレートに細胞約２００００個／
ウェルで播種し、６日間にわたって１０％血清を補給したＤＭＥＭ中で培養する
。細胞をカルシウムを含まないＰＢＳで洗浄し、固定し、基質としてナフトール
ＡＳＢＩを用いてＡＬＰについて染色する。
【００９６】 結節形成については、ＲＰ−１細胞を２４ウェルプレートに細胞約５０００個
／ウェルで播種し、１０％血清を補給したＤＭＥＭ中で２週間にわたって培養す
る。培養終了２日前に１０ｍＭのβ−グリセロホスフェートを加える。細胞をカ
ルシウムを含まないＰＢＳで洗浄し、固定し、フォン・コッサ（Von Kossa）で
染色する。
【００９７】 ３．ヌードマウスへのＲＰ−１の皮下注射 血清を含まないＤＭＥＭ１００ｍＬに懸濁した約５００万個のＲＰ−１細胞を
、無菌条件下に維持した８週齢雄ヌードマウス（Taconic, Germantown, NY）に
皮下注射する。マウス５匹中３匹が６〜８週後に注射部位で腫瘍を形成している
。腫瘍を回収し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン薄切処理する
。パラフィン除去した切片をトルイジンブルー、ＡＬＰおよびフォン・コッサで
染色する。
【００９８】 ４．ＲＮＡ単離およびノーザンブロット分析 ＲＰ−１骨膜細胞を１００ｍｍ培養プレート（Costar, Cambridge, MA）に約
細胞１００００個／ｃｍ２にて播種し、３日間、６日間および１０日間培養する
。総ＲＮＡを抽出する（P. Chomczynski et al., Single step method of RNA i
solation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction, Ana
l. Biochem., 162, 156-159 (1987)参照；引用によって本明細書に全内容が含ま
れるものとする）。ＲＮＡ（１５μｇ）を１％アガロース−ホルムアルデヒドで
電気泳動し、ナイロン膜（Hybond N, Amersham）にブロットする。フィルターを
５０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣｌ／０．
０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、５×デンハルト液（Denhardt’s solution）お
よびサケ精子ＤＮＡ（１００ｍｇ／ｍＬ）を含む緩衝液中で前ハイブリダイズし
、ランダムプライマーＤＮＡ標識キットを用いる［ａ−３２Ｐ］デオキシ−ＣＴ
Ｐで標識したマウスＩ型コラーゲン（ＣＯＬ−１）ａｌ、ラットアルカリホスフ
ァターゼ（ＡＬＰ）またはラットオステオカルシン（ＯＣ）ｃＤＮＡプローブを
含む新鮮な緩衝液中４２℃でハイブリダイズする。
【００９９】 ５．免疫組織化学試験 ＲＰ−１腫瘍および固定ＲＰ−１細胞のパラフィン除去切片を、最初に０．１
％Ｔｒｉｔｏｎ×１００（ＰＢＳ中）で約３０分間透過性化する。次にスライド
グラスを２％ＢＳＡで約３０分間処理して非特異的結合を遮断し、０．５％過酸
化水素で約３０分間処理して内因性ペルオキシダーゼを失活させる。スライドグ
ラスを０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００（ＰＢＳ中）で各約１０分間にわたって３
回洗浄する。この段階をその後の各段階後に繰り返す。切片を、０．１％ＢＳＡ
および０．１％ｔｒｉｔｏｎＸ１００を含む溶液で１〜２００に希釈したウサギ
抗ラットＯＣ抗血清に曝露する。非免疫ウサギ血清を陰性対照として用いる。サ
ンプルを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体（Amersham, Arli
ngton Heights, IL）に曝露し、ジアミノベンジジンで発生させる。切片をメチ
ルグリーンで対比染色し、光学顕微鏡下に肉眼観察する。
【０１００】 ６．［３Ｈ］チミジン取り込み ＲＰ−１細胞をウェル当たり細胞約５００００個で２４ウェルプレート（Cost
ar, Cambridge, MA）に播種する。細胞をさらに２４時間にわたって血清なしで
培養し、２％ＦＢＳ存在下に２０時間にわたってＰＧＥ２（１ｍＭ）で処理する
。［３Ｈ］チミジン（０．１ｍｃｉ／ｍＬ）を培養停止２時間前に加え、取り込
まれたチミジンを既報の方法に従って測定する（S. Rodan et al., Growth stim
ulation of rat calvaria osteoblastic cells by acidic fibroblast growth f
actor, Endocrinology, 121, 1917-1923 (1987)参照；引用によって全内容が本
明細書に含まれるものとする）。
【０１０１】 ７．フローサイトメトリー ＲＰ−１細胞を２４ウェルプレート（Costar, Cambridge, MA）に細胞５００
００個／ｃｍ２で播種し、１０％ＦＢＳを補給したＤＭＥＭ中で２日間にわたっ
て培養する。細胞を、２％ＦＢＳを補給したＤＭＥＭ中４８時間にわたってＰＧ
Ｅ２（１ｍＭ）で処理する。フローサイトメトリーによるＤＮＡ含有量の分析の
ため、細胞をトリプシン処理し、単一細胞懸濁液を調製する。細胞をＣａ２＋Ｍ
ｇ２＋を含まないＰＢＳで２回洗浄し、エタノール／ＰＢＳ（３：１容量基準）
で３０分間固定する。遠心後、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５ｍｇ／ｍＬＲＮａ
ｓｅＡでインキュベートし、最終濃度５０ｍｇ／ｍＬでヨウ化プロピジウムで染
色する。ＤＮＡ含有量および細胞周期プロファイルをＦＡＣＳｃａｎフローサイ
トメトリー（Becton Dickinson, San Francisco, CA）で分析する。アルゴンレ
ーザ光の４８８ｎｍ波長で赤色蛍光を励起する。ｃｅｌｌＱｕｅｓｔおよびＭｏ
ｄＦｉｔソフトウェア（Becton Dickinson, San Francisco, CA）をそれぞれ用
いて、データ取得およびデータ解析を行う。
【０１０２】 ８．ＴＵＮＥＬアッセイ アポトーシスのin situでの確認には、製造者の指示（Oncor, Gaithersburg,
MD）に従ってＴＵＮＥＬアッセイを用いる。４週齢ラット脛骨のパラフィン切片
をパラフィン除去し、プロテイナーゼＫ（ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍＬ）に１５分間
曝露する。ＲＰ−１細胞および脛骨切片を０．５％Ｈ２Ｏ２のＰＢＳ溶液で１５
分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼを失活させる。ＰＢＳで洗浄
後、サンプルをジオキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ存在下にヌクレオチドターミナ
ルトランスフェラーゼとともにインキュベートする。抗ジオキシゲニンＨＲＰ−
結合抗体を用いて、標識された細胞を確認する。対照として、ターミナルトラン
スフェラーゼ以外は同じ混合物にサンプルを曝露させる。サンプルをメチルグリ
ーンで対比染色し、光学顕微鏡下に肉眼観察する。
【０１０３】 ９．ＲＰ−１細胞アポトーシスの他の阻害薬 実施例１〜８に記載の本発明の方法を用いて、プロスタグランジンＥ２以外に
、プロスタグランジンＥ１、フォルスコリンおよびカスパーゼ阻害薬が骨芽細胞
系細胞のアポトーシスを阻害する上で有効であることが認められる。
【０１０４】 １０．医薬錠剤 標準的な混合および成型法を用いて医薬錠剤を調製する。
【０１０５】 骨芽細胞系細胞阻害薬約１〜１００ｍｇを含む錠剤を、以下のような相対成分
重量を用いて調製する。
【０１０６】
【表１】 得られる錠剤は、骨芽細胞系細胞のアポトーシス阻害ならびに骨吸収調節ため
の本発明の方法に従った投与に有用である。
【０１０７】 さらに別の実施態様では、アレンドロネート、シマドロネート、クロドロネー
ト、チルドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、ネリドロネート、オ
ルパンドロネート、リセドロネート、ピリドロネート、パミドロネート、ゾレン
ドロネートおよびそれらの医薬的に許容される塩からなる群から選択されるビス
ホスホネートのビスホスホネート活性成分を、ビスホスホン酸活性成分基準で５
ｍｇもしくは１０ｍｇも含む錠剤を製造する。
【０１０８】 １０．液体製剤 液体製剤は、標準的な混合法を用いて製造する。
【０１０９】 骨芽細胞系細胞阻害薬約１〜約１００ｍｇを含む液体製剤を、以下の相対成分
重量を用いて製造する。
【０１１０】
【表２】 得られる液体製剤は、骨芽細胞系細胞のアポトーシス阻害ならびに骨形成調節
のための投与に有用である。
【０１１１】 さらに別の実施態様では、アレンドロネート、シマドロネート、クロドロネー
ト、チルドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、ネリドロネート、オ
ルパンドロネート、リセドロネート、ピリドロネート、パミドロネート、ゾレン
ドロネートおよびそれらの医薬的に許容される塩からなる群から選択されるビス
ホスホネートのビスホスホネート活性成分を、ビスホスホン酸活性成分基準で５
ｍｇもしくは１０ｍｇも含む液剤が製造される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/00 Ａ６１Ｐ 19/00 19/08 19/08 19/10 19/10 29/00 １０１ 29/00 １０１ 35/02 35/02 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マハワーテ，モハメド アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ロダン，ギデオン・エイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ロダン，セブギ・ビイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA18 QR72 4C084 AA17 AA19 MA01 MA02 NA05 NA14 ZA672 ZA962 ZA972 ZB152 ZB212 ZB262 ZB272 ZC202 ZC752 4C086 AA01 BA08 DA03 DA34 MA01 MA02 MA04 NA05 NA14 ZA67 ZA96 ZA97 ZB15 ZB21 ZB26 ZB27 ZC20 ZC75

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 処置を必要とする哺乳動物における骨形成の調節方法であっ
    て、該哺乳動物に対して、治療上有効量の骨芽細胞系細胞のアポトーシス阻害薬
    を投与する段階を有することを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 治療またはリスク低下を必要とする哺乳動物における疾患状
    態の治療または罹患リスク低下方法であって、該哺乳動物に対して治療上有効量
    の骨芽細胞系細胞のアポトーシス阻害薬を投与する段階を有することを特徴とす
    る方法。
  4. 【請求項４】 前記哺乳動物がヒトである、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記疾患状態が、骨粗鬆症、糖質コルチコイド誘発骨粗鬆症
    、ページェット病、骨代謝異常亢進、歯周病、歯喪失、骨折、慢性関節リウマチ
    、補綴具周囲骨溶解、骨形成不全症、転移骨疾患、悪性腫瘍の高カルシウム血症
    および多発性骨髄腫からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記疾患状態が骨粗鬆症、糖質コルチコイド誘発骨粗鬆症お
    よびページェット病からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記阻害薬が、ＰＧＥ１、ＰＧＥ２、フォルスコリン、カス
    パーゼ阻害薬類およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記
    載の方法。
  8. 【請求項８】 処置を必要とする哺乳動物における骨形成の調節方法であっ
    て、該哺乳動物に対して治療上有効量の骨芽細胞系細胞のアポトーシス阻害薬お
    よびビスホスホネート活性成分を投与する段階を有することを特徴とする方法。
  9. 【請求項９】 前記ビスホスホネート活性成分が下記化学構造およびそれの
    医薬的に許容される塩に相当する請求項８に記載の方法。 【化１】 ［式中、ｎは０〜７の整数であり；ＡおよびＸは独立に、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン
    、ＮＨ２、ＳＨ、フェニル、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ３〜Ｃ３０分枝もしくは
    シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換ＮＨ２ 、Ｃ３〜Ｃ１０分枝もしくはシクロアルキル置換ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ１０ジアルキ
    ル置換ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換チオ、チオ
    フェニル、ハロフェニルチオ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換フェニル、ピリジル、
    フラニル、ピロリジニル、イミダゾリル、イミダゾピリジニルおよびベンジルか
    らなる群から選択され；あるいはＡおよびＸが、それらが結合している１個もし
    くは複数の炭素原子と一体となってＣ３〜Ｃ１０環を形成しており；ただし、ｎ
    が０の場合にはＡおよびＸのいずれもＨおよびＯＨからなる群からは選択されな
    い。］
  10. 【請求項１０】 前記ビスホスホネート活性成分が、アレンドロネート、シ
    マドロネート、クロドロネート、チルドロネート、エチドロネート、イバンドロ
    ネート、ネリドロネート、オルパンドロネート、リセドロネート、ピリドロネー
    ト、パミドロネート、ゾレンドロネート、それらの医薬的に許容される塩ならび
    にそれらの混合物からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記ビスホスホネート活性成分が、アレンドロネート、そ
    れの医薬的に許容される塩ならびにそれらの混合物からなる群から選択される、
    請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記ビスホスホネート活性成分が、アレンドロネート一ナ
    トリウム・３水和物である、請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 治療上有効量の骨芽細胞系細胞のアポトーシス阻害薬を含
    む医薬組成物。
  14. 【請求項１４】 さらに医薬的に許容される担体を含む、請求項１３に記載
    の医薬組成物。
  15. 【請求項１５】 前記阻害薬が約０．１ｎＭ〜約１０μＭのＥＣ５０値を有
    する、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 【請求項１６】 さらに治療上有効量のビスホスホネート活性成分を含む、
    請求項１３に記載の医薬組成物。
  17. 【請求項１７】 前記ビスホスホネート活性成分が下記化学構造およびそれ
    の医薬的に許容される塩に相当する請求項１６に記載の医薬組成物。 【化２】 ［式中、ｎは０〜７の整数であり；ＡおよびＸは独立に、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン
    、ＮＨ２、ＳＨ、フェニル、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ３〜Ｃ３０分枝もしくは
    シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ３０置換アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換ＮＨ２ 、Ｃ３〜Ｃ１０分枝もしくはシクロアルキル置換ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ１０ジアルキ
    ル置換ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換チオ、チオ
    フェニル、ハロフェニルチオ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換フェニル、ピリジル、
    フラニル、ピロリジニル、イミダゾリル、イミダゾピリジニルおよびベンジルか
    らなる群から選択され；あるいはＡおよびＸが、それらが結合している１個もし
    くは複数の炭素原子と一体となってＣ３〜Ｃ１０環を形成しており；ただし、ｎ
    が０の場合にはＡおよびＸのいずれもＨおよびＯＨからなる群からは選択されな
    い。］
  18. 【請求項１８】 前記ビスホスホネート活性成分が、アレンドロネート、シ
    マドロネート、クロドロネート、チルドロネート、エチドロネート、イバンドロ
    ネート、ネリドロネート、オルパンドロネート、リセドロネート、ピリドロネー
    ト、パミドロネート、ゾレンドロネート、それらの医薬的に許容される塩ならび
    にそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１６に記載の医薬組成物。
  19. 【請求項１９】 前記ビスホスホネート活性成分が、アレンドロネート、そ
    れの医薬的に許容される塩ならびにそれらの混合物からなる群から選択される、
    請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 【請求項２０】 前記ビスホスホネート活性成分が、アレンドロネート一ナ
    トリウム・３水和物である、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 【請求項２１】 骨芽細胞系細胞のアポトーシスを阻害する化合物の確認方
    法であって、 ａ）骨芽細胞系細胞の推定アポトーシス阻害薬と細胞培養物とを接触させる段
    階；ならびに ｂ）前記推定阻害薬と接触していない細胞培養物と比較することで阻害を求め
    る段階 を有することを特徴とする方法。
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