CN103898057B - 一种顺铂耐药骨肉瘤u2os细胞系及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种顺铂耐药骨肉瘤U2OS细胞系及其制备方法，所述顺铂耐药骨肉瘤U2OS细胞系为U2OS/CDP3×10‑8M、U2OS/CDP10‑7M、U2OS/CDP3×10‑7M、U2OS/CDP10‑6M，其微生物保藏号分别为CGMCC No.8004、CGMCC No.8005、CGMCC No.8006、CGMCC No.8007。另外，不耐药的U2OS敏感细胞系微生物保藏号为CGMCC No.8008，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明通过构建顺铂耐药骨肉瘤U2OS细胞系建立了体外骨肉瘤细胞耐顺铂的模型，为骨肉瘤的临床治疗提供很好的基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种顺铂耐药骨肉瘤U2OS细胞系及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
骨肉瘤是骨骼系统常见的恶性肿瘤之一，好发于青少年。早期即可发生远处转移，预后差，表现为高度的基因组不稳定性、非整倍性、复杂的结构重组不平衡性和基因扩增。目前，临床上治疗骨肉瘤主要以手术和化疗为主。顺铂是常用的治疗骨肉瘤的一线用药之一。然而肿瘤细胞耐药性的产生限制了化疗药物的临床效果，给治疗带来了障碍。
顺铂属于DNA交联剂类抗肿瘤化疗药，使DNA链间共价交联，阻断DNA复制、转录和重组，从而杀伤肿瘤细胞。其耐药性的产生机制主要包括以下几个方面：减少药物在细胞内的积累(包括减少药物摄入和增加药物外排)；细胞内代谢降低药物毒性；增强对药物所致损伤的修复能力等。
人体细胞摄取顺铂等铂类化合物依赖于细胞上的铜离子转运体hCTR1。被摄入细胞的顺铂，部分进入细胞核与DNA形成铂-DNA加合物，发挥抗肿瘤作用。部分顺铂一方面与谷胱甘肽(glutathione，GSH)作用，形成Pt(GS)2复合物，通过ATP依赖的多药耐药蛋白MRP2(属于ABC-转运蛋白，由ABCC2基因编码)，将此共价化合物排出细胞外；另一方面与细胞中的两种P型-ATP酶依赖的铜外排泵ATP7A和ATP7B上的铂结合位点结合，介导顺铂等铂类化合物在细胞内的转运和外排。所以在此过程中hCTR1、ATP7A和ATP7B的表达，MRP2、GSH或与其代谢有关酶活性增高均有可能参与顺铂耐药的产生。在对顺铂耐药的研究中发现，许多耐药细胞表现出hCTR1mRNA表达降低；多种肿瘤细胞中MRP2的过表达使其对顺铂的耐受增加；而反义干扰MRP2后，则可以逆转肿瘤细胞对顺铂的耐受性。此外，将表达ATP7A的载体转染到人卵巢癌细胞后，细胞获得了对顺铂、卡铂和奥沙利铂的耐受能力。人ATP7B，与ATP7A约含有65％的共同氨基酸序列，在多种顺铂耐药的肿瘤细胞(卵巢癌，胃癌、肺癌、口腔鳞状细胞癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌等)中发现其过表达，是顺铂耐药性检测常用的分析指标之一。最新研究发现ATP7A和ATP7B蛋白受铜诱导人体转铜伴侣Atox1的调节，顺铂在胞浆可以与Atox1结合，这阻止了顺铂进入细胞核与DNA的作用，进而增加细胞对顺铂的耐受。
顺铂作为DNA损伤剂，癌细胞对其所致损伤的修复能力的提高也是其产生抗药性的重要原因之一。核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)是DNA链间交联修复的主要机制。DNA链间交联修复始动于交联位点两侧复制叉在交联位点的汇聚。复制叉无法通过交联位点，故在损伤位点两侧切割一条母链DNA，复制后产生双链断裂的DNA，最终通过同源重组或非同源末端连接方式完成修复。而另一条模板链跨越交联位点继续完成复制，最终保留交联损伤点。NER修复包括转录耦联核苷酸切除修复(transcription-coupled NER,TC-NER)和全基因组核苷酸切除修复(global genome NER,GG-NER)。研究发现，ERCC1、XPD是介导多种肿瘤细胞顺铂耐药的关键因子。ERCC2、ERCC5、XPA、XPC、XPF、CSB也与铂类药物的敏感性相关。另外有研究报道，MMR修复系统，也是涉及顺铂耐药性维持的一个重要因子。虽然MMR不修复顺铂所致的DNA交联，但该系统帮助检出顺铂-DNA加合物，并且MMR蛋白产生相关信号诱导细胞凋亡发生。因此，MMR的功能缺陷，使本该发生凋亡的复制损伤DNA存在，导致了顺铂耐药能力的增加。
多途径涉及顺铂耐药性的产生，不同的肿瘤细胞介导细胞耐药的形成机制也不尽相同。为了更好地分析骨肉瘤对顺铂的耐药机制，我们拟在体外建立骨肉瘤的顺铂耐药模型。
发明内容
本发明针对目前骨肉瘤治疗药物-顺铂耐药性的存在，给骨肉瘤的治疗带来的障碍，提供了一种顺铂耐药骨肉瘤U2OS细胞系及其制备方法，本发明建立体外骨肉瘤细胞耐顺铂的模型，分析骨肉瘤细胞顺铂耐药后的形态学变化，染色体水平变化，生长性状改变，并对肿瘤细胞对顺铂药物耐受的分子机制进行初步分析，以期为骨肉瘤的临床治疗提供新的策略。
本发明采用药物逐步递增法诱导产生不同浓度的骨肉瘤细胞U2OS耐顺铂的细胞系，所述顺铂耐药骨肉瘤U2OS细胞系为U2OS/CDP 3×10-8M、U2OS/CDP 10-7M、U2OS/CDP 3×10-7M、U2OS/CDP 10-6M，其微生物保藏号分别为CGMCC No.8004、CGMCC No.8005、CGMCC No.8006、CGMCC No.8007。另外，不耐药的U2OS敏感细胞微生物保藏号为CGMCC No.8008，保藏日期均为2013年7月18日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明对各浓度耐药细胞的细胞形态学、耐药指数以及增殖能力的分析表明耐药模型成功建立。
制备上述本发明顺铂耐药骨肉瘤U2OS细胞系的方法：
(1)细胞培养
以人骨肉瘤U2OS细胞系为研究对象，细胞培养用含10％胎牛血清的IMDM培养基，不含青霉素、链霉素的环境下，于体积分数为5％的CO2、37℃条件下常规培养，耐药细胞连续培养5个月后进行实验指标分析。
(2)细胞耐药浓度的确定
取生长状态良好的细胞，用0.01M的PBS缓冲液冲洗，用质量分数为0.25％的胰酶消化之后进行稀释，计数，将稀释的细胞悬液以2000细胞/孔的细胞密度种入各孔中，细胞贴壁后加入设置浓度梯度的CDP，此后再培养72h，之后经换液，读数，计算后得出细胞系对CDP的IC50值，以低于此值的8～10倍浓度的CDP对细胞进行耐药，观察细胞的生长速度及状态，待其生长稳定后进行下一数量级浓度的耐药培养。
确定人骨肉瘤U2OS敏感细胞系对CDP的耐药起始浓度为3×10-8M，以3倍递增为一个浓度梯度，确定的耐药细胞系为U2OS/CDP 3×10-8M、U2OS/CDP 10-7M、U2OS/CDP 3×10-7M、U2OS/CDP 10-6M。
(3)细胞形态学分析
U2OS敏感细胞置显微镜下观察到细胞贴壁生长，体积中等，大小均匀，细胞呈椭圆形或不规则形，胞质较少，细胞核较大，核仁清晰；U2OS/CDP耐药细胞在光镜下观察，细胞贴壁生长，与敏感细胞比，耐药细胞变得更加细长，细胞呈椭圆形、梭形或不规则形，细胞核、胞质增大，多核仁现象增多，并且随耐药浓度增加细胞内空泡量增加，高浓度耐药细胞不规则形状程度严重，细胞相互交织形成网状。
(4)耐药细胞系耐药指数分析
采用MTT比色法检测人骨肉瘤U2OS耐药细胞系对CDP的IC50值。
(5)耐药细胞系细胞中期染色体标本制备
将处于对数生长期的细胞加入终浓度为0.01μg/mL的秋水仙素，37℃继续培养1-2h，将细胞用吸管吹打下来，细胞悬液转入离心管中1 000r/min离心8min，PBS冲洗两次，加入37℃预热的0.075mol/L的KCL，在37℃水浴中低渗作用11-15min，逐滴加入1mL新鲜固定液进行预固定，其中，新鲜固定液为甲醇与冰醋酸的体积比为3:1，1 500r/min离心5min，弃上清加入10mL固定液，轻轻混匀，室温固定30min，1 500r/min离心5min，重复一次，弃上清，视沉淀细胞量加入1～1.5mL固定液混匀，将细胞悬液以30cm高度滴于预冷的载玻片上，室温晾干，Giemsa染液染色5min，流水冲洗，晾干，置于显微镜下观察。
(6)耐药细胞系增殖能力的变化
选取生长至70％～80％的U2OS敏感细胞及耐药细胞系细胞，每种细胞分别接种到7个96孔板中，每种细胞设置6个复孔，在每个孔中加入相应细胞所需的不含药物的培养基，在接种后的第1天，用MTT法计算第一块板子的每种细胞的细胞数目，第2天计算第二块板子中的各种细胞数目，以此类推直至完成每种细胞的7天生长情况检测，绘制成图，即为相应各个敏感及耐药水平细胞的生长曲线。
(7)Real-time PCR检测可能参与U2OS对顺铂耐药基因的表达情况
①细胞总RNA的提取
采用TRIzol Reagent(Invitrogen Cat.No.15596-018)总RNA提取试剂，按说明书提供方法分别提取U2OS敏感及耐药细胞系的总RNA，分别取上述几种细胞，用浓度为0.01M的PBS冲洗3次，加入适量TRIzol Reagent，室温放置5min裂解细胞，吹打均匀后以1mL/管分装至1.5mL Eppendorf管中。每管加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2～3min，4℃、12000r/min离心15min，将上层水相移至干净Eppendorf管中，加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min，4℃、7500r/min离心10min。弃上清，75％乙醇洗涤RNA沉淀，7500r/min离心5min，室温干燥RNA沉淀，5～10min后溶于适量DEPC水。质量分数为1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA样本的完整性，应用Bio-Photometer对提取的RNA进行定量测定。
②RNA逆转录为cDNA
利用Transcriptor Eirst strand cDNA Synthesis Kit(Roche)试剂盒将提取的细胞mRNA逆转录为cDNA。
③Real-time PCR
应用Primer3.0 software设计并合成基因特异性引物，将qPCR反应体系加入96孔板中，在Roche LightCycler480型荧光定量PCR仪SYBR Green I/HRM Dye(465-510)系统下运行，每一样本测量3次，94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共45个循环；基因扩增水平以β-actin为内参进行比较，计算不同实验的数据平均值±标准差，应用SPSS软件进行统计学分析。
制备顺铂耐药骨肉瘤U2OS细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)耐药浓度设定
①细胞培养；
②测定敏感的肿瘤细胞对药物的IC50值；
耐药起始的最低浓度从低于IC50一个数量级开始，递增的梯度依次是前一个浓度的3倍。
(2)耐药细胞的培养
从耐药起始的最低浓度开始，维持培养细胞，如果细胞形态、生长速度、细胞对CDP的IC50值等方面无明显变化，提高药物浓度，进行下一药物浓度耐药细胞的培养，如此进行不同浓度耐药细胞系的建立，此过程中观察加药初始阶段细胞的变化，如果细胞大量死亡到无法耐受的程度，说明设定的浓度过高，需要适当降低药物浓度。
(3)耐药细胞的检测
①细胞形态学分析
②耐药细胞耐药指数测定
采用MTT比色法检测人骨肉瘤U2OS耐药细胞系对顺铂的IC50值，所得各耐药细胞系的IC50值与敏感细胞系的IC50值的比值即为耐药指数。
③细胞中期染色体标本制备
双微体是细胞中位于染色体外、小的、成对存在的无着丝粒、无端粒的染色质小体，是癌基因和耐药基因重要载体，收集不同程度的耐药细胞的染色体标本，分析顺铂耐药是否引起细胞遗传学水平的改变。
④细胞生长曲线，分析各耐药细胞增殖的变化
⑤耐药基因检测
收集稳定耐药五个月后的细胞，提取细胞的RNA，应用Real-time PCR，对参与细胞摄入与排出顺铂、顺铂在细胞内的代谢、细胞对顺铂所致损伤的应答等主要通路的关键基因进行检测。
本发明的有益效果：
本发明建立了耐受不同浓度顺铂的骨肉瘤U-2OS耐药细胞系，为后期顺铂耐药机制的研究提供了良好的体外模型。
附图说明
图1为U2OS敏感细胞和不同浓度顺铂耐药细胞形态图；其中，A：U2OS；B：U2OS/CDP 3×10-8M；C：U2OS/CDP 10-7M；D：U2OS/CDP 3×10-7M；E：U2OS/CDP10-6M；F：U2OS/CDP 3×10-6M；
图2为U2OS敏感和不同浓度顺铂耐药细胞的细胞遗传学水平改变的中期染色体标本图，其中，A：U2OS；B：U2OS/CDP 3×10-8M；C：U2OS/CDP 10-7M；D：U2OS/CDP 3×10-7M；E：U2OS/CDP 10-6M；
图3是U2OS敏感和不同浓度顺铂耐药细胞的增殖能力改变的细胞生长曲线图；
图4是U2OS敏感和不同浓度顺铂耐药细胞可能涉及的耐药基因表达变化Real-time PCR柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1制备一种顺铂耐药骨肉瘤U2OS细胞系
1、细胞培养
以人骨肉瘤U2OS细胞系为研究对象，人骨肉瘤U2OS细胞系购自上海细胞库，顺铂购自Hospira Australia Pty Ltd。细胞培养用含10％胎牛血清的IMDM培养基，不含青霉素、链霉素的环境下，于体积分数为5％的CO2、37℃条件下常规培养。耐药细胞至少连续培养5个月后进行实验指标分析。顺铂原液分装-80℃保存，使用时用质量分数为0.9％的生理盐水稀释至相应的浓度。
2、细胞耐药浓度的确定
用MTT比色法检测，对初始耐药浓度进行确定。具体方法如下：取生长状态良好的细胞，用0.01M的PBS缓冲液冲洗，用质量分数为0.25％胰酶消化之后进行稀释，计数，将稀释的细胞悬液以2000细胞/孔的细胞密度种入各孔中，细胞贴壁后加入设置浓度梯度的CDP，此后再培养72h，之后经换液，读数，计算后得出细胞系对CDP的IC50值。以低于此值的8～10倍浓度的CDP对细胞进行耐药。观察细胞的生长速度及状态，待其生长稳定后(一个月左右)进行下一数量级浓度的耐药培养。
实验测得人骨肉瘤U2OS敏感细胞系对CDP的IC50值为3.819×10-7M，故耐药起始浓度为3×10-8M。以3倍递增为一个浓度梯度。最终确定的耐药细胞系为U2OS/CDP 3×10-8M、U2OS/CDP 10-7M、U2OS/CDP 3×10-7M、U2OS/CDP 10-6M等。
3、细胞形态学分析
在细胞培养的过程中，应用光学倒置显微镜密切观察并记录耐药过程中细胞形态学的改变。
U2OS敏感细胞置显微镜下观察到细胞贴壁生长，体积中等，大小均匀，细胞呈椭圆形或不规则形，胞质较少，细胞核较大，核仁清晰。U2OS/CDP耐药细胞在光镜下观察，细胞贴壁生长，与敏感细胞相比，耐药细胞变得更加细长，细胞呈椭圆形、梭形或不规则形，细胞核、胞质增大，多核仁现象增多，并且随耐药浓度增加细胞内空泡量增加。高浓度耐药细胞不规则形状程度严重，细胞将相互交织形成网状(如图1所示，×150倍镜下图片)。
4、细胞耐药指数分析
采用MTT比色法检测人骨肉瘤U2OS耐药细胞系对CDP的IC50值。所得各耐药细胞系的IC50值与敏感细胞系的IC50值的比值即为耐药指数(Resistance Index,RI)。
与敏感细胞相比，耐药细胞对顺铂敏感性的改变及耐药指数分析，如表1所示。与敏感细胞相比，耐药细胞系对CDP的IC50值增高，并且随着药物浓度的升高，细胞对CDP的敏感性下降，对药物的耐受能力增强。说明耐药细胞系已经稳定建成。
表1 U2OS敏感和耐药细胞系的IC50值以及耐药细胞系的耐药指数
a:耐药指数＝耐药细胞的IC50值/敏感细胞的IC50值
5、本发明耐药细胞系细胞中期染色体标本制备
为了解耐药细胞遗传学水平的改变，制备各细胞的中期染色体标本。将处于对数生长期的细胞加入终浓度为0.01μg/mL的秋水仙素，37℃继续培养1-2h，将细胞用吸管吹打下来，将细胞悬液转入离心管中1 000r/min离心8min，PBS冲洗两次，加入37℃预热的0.075mol/L的KCL，在37℃水浴中低渗作用11-15min，逐滴加入1mL新鲜固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1)进行预固定，1 500r/min离心5min，弃上清加入10mL固定液，轻轻混匀，室温固定30min，1 500r/min离心5min，重复一次，弃上清，加入适当固定液混匀，将细胞悬液以一定高度滴于预冷的载玻片上，室温晾干。Giemsa染液染色5min，流水冲洗，晾干。置于显微镜下观察，拍照，如图2所示，可观察到骨肉瘤U2OS敏感和耐药细胞系的染色体高度不稳定。
6、本发明耐药细胞系增殖能力的变化
绘制本发明耐药细胞系细胞生长曲线。选取生长至70％～80％的敏感及各个耐药梯度的细胞，每种细胞分别接种到7个96孔板中，每种细胞设置6个复孔。在每个孔中加入相应细胞所需的培养基(不含药物)。在接种后的第1天，用MTT法计算第一块板子的每种细胞的细胞数目。第2天计算第二块板子中的各种细胞数目，以此类推直至完成每种细胞的7天生长情况，绘制成图，即为相应敏感及各个耐药水平细胞的生长曲线。
如图3所示，以培养时间为横坐标，细胞培养1～7天的吸光度值为纵坐标，绘制生长曲线，可见耐药细胞的增殖能力随着耐药浓度的增加而逐渐降低。
7、Real-time PCR检测可能参与U2OS对顺铂耐药产生基因的表达
(1)细胞总RNA的提取
采用TRIzol Reagent(Invitrogen Cat.No.15596-018)总RNA提取试剂，按说明书提供方法分别提取U2OS敏感及耐药细胞系的总RNA。分别取上述几种细胞，0.01M PBS冲洗3次，加入适量TRIzol Reagent，室温放置5min裂解细胞，吹打均匀后以1mL/管分装至1.5mL Eppendorf管中。每管加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2～3min，4℃、12000r/min离心15min。将上层水相移至干净Eppendorf管中，加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min，4℃、7500r/min离心10min。弃上清，75％乙醇洗涤RNA沉淀，7500r/min离心5min。室温干燥RNA沉淀，5～10min后溶于适量DEPC水。质量分数为1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA样本的完整性，应用Bio-Photometer对提取的RNA进行定量测定。
(2)RNA逆转录为cDNA
利用Transcriptor Eirst strand cDNA Synthesis Kit(Roche)试剂盒将提取的细胞mRNA逆转录为cDNA。
(3)Real-time PCR
应用Primer3.0 software设计并合成基因特异性引物。所有引物由Invitrogen公司合成。将qPCR反应体系加入96孔板中，在Roche LightCycler480型荧光定量PCR仪SYBR Green I/HRM Dye(465-510)系统下运行。每一样本测量3次，按照说明书提供的最佳反应条件，94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共45个循环；基因扩增水平以β-actin为内参进行比较，计算不同实验的数据平均值±标准差，应用SPSS软件进行统计学分析。结果如图4所示。
结果显示(1)与药物在细胞内的积累相关的基因hCTR1，ATP7A与顺铂各浓度耐药细胞都有明显的相关性，而ATP7B仅在U2OS/CDP 10-7M、和U2OS/CDP10-6M细胞中略微升高(p值分别为0.037和0.035)；ABCC2基因仅在U2OS/CDP3×10-7M耐药细胞中表现出统计学意义(p＝0.018)，这表明耐药细胞对顺铂摄入是主要通过hCTR1，而介导耐药细胞外排顺铂的主要是ATP7A基因的表达产物。(2)顺铂代谢相关基因：γ-GSH是谷胱甘肽合成的限速酶，检测结果发现其表达与各浓度耐药细胞明显相关，表明耐药细胞对顺铂的解毒能力增强。(3)与顺铂所致损伤修复相关的基因：损伤修复通路基因检测分析发现非同源末端连接通路的关键基因XRCC4的表达与耐药细胞呈高度相关性；MSH3基因的表达也表现出明显的差异，表明非同源末端连接和错配修复在U2OS对顺铂的耐药中发挥重要作用。然而，对核酸切除修复基因的检测发现，该修复通路的基因XPA、XPF在敏感和耐药细胞间表达存在差异，XPD基因仅在U2OS/CDP 3×10-7M耐药细胞中存在差异表达；对该通路关键基因ERCC1的表达分析未检测到敏感和耐药细胞表达的差异，究其原因还要进一步研究分析。另外，PDZK1是文献中报道的顺铂耐药标志，在我们的耐药细胞中也检测到该基因与各浓度耐药细胞之间表达的明显差异，这也进一步表明我们耐药细胞已成功建立。
Claims (2)
1.一种顺铂耐药骨肉瘤U2OS细胞系，其特征在于，所述顺铂耐药骨肉瘤U2OS细胞系为U2OS/CDP 3×10-8M、U2OS/CDP 10-7M、U2OS/CDP 3×10-7M、U2OS/CDP10-6M，其微生物保藏号分别为CGMCC No.8004、CGMCC No.8005、CGMCCNo.8006、CGMCC No.8007，保藏日期均为2013年7月18日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.权利要求1所述的顺铂耐药骨肉瘤U2OS细胞系在制备治疗骨肉瘤药物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Meng Xiangning Inventor after: Dong Kexian Inventor after: Pang Bo Inventor after: Liu Chang Inventor after: Guan Rongwei Inventor after: Liu Peng Inventor after: Cai Mengdi Inventor after: Gao Wei Inventor after: Song Ying Inventor after: Ma Jinfa Inventor after: Ji Guohua Inventor after: Wang Xu Inventor before: Fu Songbin Inventor before: Meng Xiangning Inventor before: Jia Xueyuan Inventor before: Liu Peng Inventor before: Sun Wenjing Inventor before: Jin Yan Inventor before: Zhang Chunyu |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |