CN116987772A - tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法及试剂盒 - Google Patents

tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法及试剂盒 Download PDF

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程安春
潘秋卫
汪铭书
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Abstract

本发明涉及一种tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法及试剂盒，包括：（1）抽提总RNA,其中tRNA不去氨基酸；（2）总RNA中tRNA去氨基酸，得到含有全部脱酰化tRNA的总RNA；二者分别与相同tRNA接头连接、反转录后进行qPCR检测，其Ct值的差值即指示tRNA的氨酰化水平，通过与内参基因校正和数据标准化处理，即可计算tRNA的氨基酸载量水平。此外，本发明创新性的提出了简易的将细胞核和线粒体转录的全部tRNA和mRNA共反转录方法，克服了tRNA氨酰化检测的技术壁垒，使用常规qPCR技术即可实现tRNA氨酰化水平的定量检测。

Description

tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物化学技术领域，具体涉及一种tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法及试剂盒。
背景技术
tRNA是氨基酸的载体，主要参与遗传密码的识别，是联系mRNA和蛋白表达的重要分子。目前已知人、鸡、鸭细胞核基因组中分别编码有415、271、361个tRNA基因；但其线粒体基因组均编码22种tRNA。由于tRNA分子片段较小，大约在73-96nt左右，常规方法不能检测此类小RNA分子。此外tRNA在细胞内参与mRNA翻译实际是以氨酰化tRNA的形式而发挥功能，目前tRNA主要有如下几个特征导致tRNA检测及其氨酰化水平检测存在困难：
第一、所有成熟tRNA的3’末端的CCA中的腺嘌呤核糖2’羟基和3’羟基是氨基酸分子中氨基连接的实际位置，tRNA 3’末端氨酰化妨碍了tRNA与接头的5’,3’磷酸二酯键的催化。
第二、tRNA含大量的转录后碱基修饰，尤其是反密码子中的第34位，但其反密码子35、36位极少被修饰；
第三、人、鸡、鸭细胞核DNA中编码了冗余的tRNA基因拷贝，高通量检测所有tRNA十分繁杂；
第四、人、鸡、鸭除细胞核DNA编码有大量tRNA基因，其线粒体基因组也编码有tRNA基因，其数量较少，均为22种，其中亮氨酸和丝氨酸有两种，其余均为一种。
第五、tRNA分子短，结构复杂，常规方法获得cDNA步骤冗长，大大限制tRNA检测方法的应用。
第六、细胞内实际参与翻译功能的tRNA是氨酰化形式的tRNA，但细胞内同时存在氨酰化的tRNA和未氨酰化的tRNA，常规手段不能专一检测tRNA的氨酰化水平。
目前虽然tRNA检测和tRNA氨酰化的高通量测序的检测方法已经建立了，但是其试验设备依赖性强、试验周期长、价格昂贵，大大的限制了tRNA生物学功能的研究。
qPCR技术由美国Applied Biosystems公司于1996年推出，其作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。目前尚没有使用常规qPCR技术实现氨酰化水平检测相关方法的报道。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明提供一种tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法，所述方法包括：
（1）抽提总RNA；
（2）所述抽提的总RNA中tRNA去氨基酸，得到含有脱酰化tRNA的总RNA；
（3）将步骤（1）和步骤（2）所得总RNA分别进行如下步骤：
A.与独特接头序列混合、孵育后，得到含有连接tRNA的混合液；所述独特接头序列可与无氨酰基tRNA尾部的ACC结合;
B.所述混合液加入可结合独特接头的通用特异性下游引物配置成退火溶液，连接tRNA退火化；
C.退火化的连接tRNA与mRNA共反转录得到cDNA；
D.qPCR检测：上游引物为tRNA反密码子特异性的引物，下游引物为所述可结合独特接头的通用特异性下游引物；所述cDNA经qPCR检测得Ct值;
二者Ct值的差值即tRNA的氨酰化水平。
进一步，所述独特接头核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，可通用于人类、鸡或鸭细胞的核或线粒体tRNA氨酰化水平的定量检测。
进一步，可结合独特接头的通用特异性下游引物如SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述上游引物为SEQ ID NO.3所示，可通用于人类、鸡或鸭细胞总tRNA氨酰化水平的定量检测。
进一步，所述人类细胞核中每种tRNA，上游引物分别为SEQ ID NO.4～60所示；所述人类线粒体中每种tRNA，上游引物分别为SEQ ID NO.137～158所示。
进一步，所述鸡细胞核中每种tRNA，上游引物分别为SEQ ID NO.61～103所示；所述鸡线粒体中每种tRNA，上游引物分别为SEQ ID NO.159～180所示。
进一步，所述鸭细胞核中每种tRNA，上游引物分别为SEQ ID NO.61～73和SEQ IDNO.104～136所示；所述鸭线粒体中每种tRNA，上游引物分别为SEQ ID NO.181～202所示。
本发明还提供用于人类、鸡或鸭总tRNA氨酰化水平定量qPCR检测的试剂盒，包括核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示的接头、如SEQ ID NO .2所示的通用特异性下游引物以及如SEQ ID NO .3所述上游引物。
本发明还提供用于人类细胞核中每种tRNA氨酰化水平定量qPCR检测的试剂盒，包括核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示的接头、如SEQ ID NO .2所示的通用特异性下游引物以及如SEQ ID NO.4～60所述上游引物。
本发明还提供用于人类线粒体中每种tRNA氨酰化水平定量qPCR检测的试剂盒，包括核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示的接头、如SEQ ID NO .2所示的通用特异性下游引物以及如SEQ ID NO.137～158所述上游引物。
上述用于tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法其中包含了tRNA含量的检测方法，即：
(1)抽提总RNA的同时，tRNA去氨基酸；
(2)将步骤(1)所得抽提总RNA与独特接头序列混合、孵育后，得到含有连接tRNA的混合液；所述独特接头序列可与无氨酰化tRNA尾部的ACC结合;
（3）所述混合液加入可结合独特接头的通用特异性下游引物，配置成退火溶液，连接tRNA退火化；
（4）退火化的连接tRNA与mRNA共反转录得到cDNA；
（5）qPCR检测：上游引物为总tRNA通用上游引物，下游引物为所述可结合独特接头的通用特异性下游引物；所述cDNA经qPCR检测得总tRNA的Ct值。
上述tRNA含量的检测方法针对每种tRNA检测即可得到tRNA含量谱，详见见图3实例中鸡细胞核和线粒体编码成熟tRNA的含量谱。
通用于人类、鸡和鸭细胞核和线粒体基因组成熟tRNA谱检测的接头，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。5phos/CTATGGTGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCTACTTCGGTAGGCTAAGGGAGAAGCCTTGACGTAATACGACTCACTATAGTGrGrN，SEQ ID NO.1；5phos表示5’端起始碱基有磷酸基团修饰，CTATGGTGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCTAC TTCGGTAGGCTAAGGGAGAAGCCTTGACGTAATACGACTCACTATAGT为脱氧核糖核酸序列，GrGr为核糖核酸序列，N为任意碱基。
用于人类、鸡和鸭细胞核编码的成熟tRNA谱检测的下游引物为相同的接头特异引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：CTTCTCCCTTAGCCTACCGAAGT。所用上游引物组序列SEQ ID NO.3～136，其中细胞总tRNA水平检测的上游引物如SEQ ID NO.3所示：CCTTGACGTAATACGACTCACTATAGTGG。SEQ ID NO.4～60为检测人类tRNA反密码子特异的上游引物组；SEQ ID NO.61～103为检测鸡tRNA反密码子特异的上游引物组，其中SEQ ID NO.61～73与检测鸭tRNA反密码子特异的上游引物组相同；SEQ ID NO.104～136为检测鸭tRNA反密码子特异的上游引物组；具体引物序列见表1。
用于人类、鸡和鸭线粒体编码的tRNA组检测的下游引物为相同的接头特异引物（SEQ ID NO.2），所用上游引物组序列SEQ ID NO.137～202，其中SEQ ID NO.137～158为检测人类线粒体tRNA反密码子特异的上游引物组；SEQ ID NO.159～180为检测鸡线粒体tRNA反密码子特异的上游引物组；SEQ ID NO.181～202为检测鸭线粒体tRNA反密码子特异的上游引物组；具体引物序列见表2。
本发明的有益效果在于：
1.本发明tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法及试剂盒，克服了tRNA氨酰化检测的技术壁垒，创新性的提出了细胞核和线粒体tRNA和mRNA共反转录方法，使用常规qPCR技术即可实现tRNA氨酰化水平的检测。
2.本发明利用荧光定量PCR仪检测SYBR荧光染料的特点，将根据GtRNA2.0公布的人类、鸡和鸭（NCBI公布）细胞核基因组编码tRNA基因序列，以及NCBI中人类、鸡和鸭线粒体编码tRNA基因的序列，设计用于荧光定量的PCR引物和独特接头，经反复试验，优化qPCR反应体系和反应参数，建立了检测人类、鸡、及鸭细胞核及线粒体编码的成熟tRNA组及其氨酰化水平检测的试剂盒及方法。
3.本发明在tRNA组定量检测领域克服了上述诸多困难，有显著的技术优势和应用前景。第一，本发明扩大了应用的物种范围，涵盖人、鸡和鸭三个物种。第二，本发明不但可以检测基因组编码tRNA组，还可检测线粒体tRNA组。第三，本发明简化了引物组设计，仅需要tRNA反密码子特异的上游引物和共用的下游引物，同时tRNA反密码子特异的上游引物跨越了高修饰的34位碱基，覆盖了反密码子的34位到36位，能够确保tRNA检测是反密码子特异的，即能满足tRNA isodecoder的特异性。第四，本发明不仅能定量检测成熟tRNA水平，可同时定量检测tRNA的氨酰化水平。
4.本发明克服了tRNA检测步骤冗余、细胞中tRNA编码基因冗余和tRNA表达标准化等困难，只需要使用本发明的独特接头和引物组即可应用常规qPCR完成人类、鸡和鸭中细胞核和线粒体编码的所有成熟tRNA组及其氨酰化水平的检测，实现在三种物种中快速、准确、高通量的定量检测成熟tRNA组水平及其氨酰化的多寡。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为本发明的试验原理图；
图2人、鸡、鸭三种物种细胞核编码全部tRNA的氨酰化水平检测；
图3人、鸡、鸭三种物种线粒体编码全部tRNA的氨酰化水平检测；
图4人、鸡、鸭三种物种总tRNA的氨酰化水平检测；
图5为鸭肝炎病毒（DHAV）感染后细胞核和线粒体部分tRNA的氨酰化水平检测；
图6为鸭肝炎病毒（DHAV）感染后细胞核和线粒体编码tRNA组的变化。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
本发明中用于成熟tRNA含量检测方法，具体步骤如下：
（1）抽提总RNA的同时，tRNA去氨基酸；
（2）将步骤（1）所得抽提总RNA与上述接头混合，孵育，得含有连接tRNA的混合液；
（3）将步骤（2）所得混合液与共用下游引物混合配置成退火溶液，连接tRNA退火化；所述下游引物为针对独特接头特异的共用下游引物；
（4）退火化的连接tRNA与mRNA共反转录；
（5）qPCR检测。
步骤（1）中，总RNA抽提过程中，洗脱前加入10μl 脱酰基缓冲液在37℃孵育40分钟，然后加入20μl TE缓冲液洗脱，即可在总RNA抽提的同时实现tRNA去氨基酸。
步骤（2）中，孵育的具体方法如下：
（2-1）配置退火溶液，90℃孵育3分钟；
（2-2）加入退火缓冲液，37℃孵育20分钟；
（2-3）配置连接反应体系，37℃孵育60分钟。
步骤（2-1）中，退火溶液的组成如下：接头2 μl（20pm），总RNA 400ng，无RNA酶水补充至9μl。
步骤（2-2）中，加入1μl 10×Tris-HCl (50mM，pH8.0)。
步骤（2-3）中，连接反应体系的组成如下：步骤（2-2）所得溶液10μl，连接酶缓冲液(NEB, M0239L)2μl，T4 RNA连接酶(NEB, M0239L)0.1μl，无RNA酶水7.9μl。
步骤（3）中，退火溶液的组成如下：步骤（2）所得混合液20μl，特异性下游引物混合物3.42μl，无RNA酶水0.58μl。
步骤（3）中，退火化的条件为：65℃孵育5分钟，立即冰上孵育5分钟。
步骤（4）的具体方法：加入共反转录反应液，按照说明书提供的步骤操作，37℃孵育15分钟，85℃孵育5s。
加入6μl 5×Prime Script RT Master Mix（Takara，RR036A）共反转录反应液。
优选的，步骤（5）中，qPCR的反应体系如下：2× SYBRTM Green PCR Master Mix 5μl，cDNA 2μl，上游引物混合物(10 pm) 0.2μl，下游引物混合物(10 pm) 0.2μl，双蒸水 3μl；反应程序如下：95℃预变性30s，95℃变性10s，59℃退火延伸30s，72℃延伸30s，45次循环，95℃、60s，65℃、60s，65-95℃、15s，每个循环增加0.3℃。
本发明基于上述含量检测的tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法，所述方法包括：
（1）抽提总RNA；
（2）所述抽提的总RNA中tRNA去氨基酸，得到含有脱酰化tRNA的总RNA；
（3）将步骤（1）和步骤（2）所得总RNA分别进行如下步骤：
A.与独特接头序列混合、孵育后，得到含有连接tRNA的混合液；所述独特接头序列可与无酰基的tRNA尾部ACC结合;
B.所述混合液加入可结合独特接头的通用特异性下游引物配置成退火溶液，连接tRNA退火化；
C.退火化的连接tRNA与mRNA共反转录得到cDNA；
D.qPCR检测：上游引物为tRNA反密码子特异性的引物，下游引物为所述可结合独特接头的通用特异性下游引物；所述cDNA经qPCR检测得Ct值;二者Ct值的差值即tRNA的氨酰化水平。
实施例1：
qPCR检测人、鸡、鸭细胞核基因组和线粒体编码(总)tRNA氨酰化水平
1.试验材料：
人细胞使用人胚肾细胞系(293T) (JCRB No .： JCRB9068)，按细胞培养常规技术培养；鸡胚、鸭胚成纤维细胞按照常规方法制备。
RNA抽提: EZ-10 DNAaway RNA 小量提取试剂盒，脱酰基缓冲液(50ml):5×Tris-HCl(100mM,pH9.0)，退火缓冲液(50ml):10×Tris-HCl(50mM, PH8.0)，T4 RNA连接酶(dsRNA连接酶)(NEB,M0239L)，5×Prime Script RT Master Mix (Takara, RR036A)，TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme：Q712)。
2.试验方法（参考图1下半部分）
2.1采用试剂盒抽提人、鸡、鸭三种细胞的总RNA。
取4μl RNA（浓度为214ng/μl）加入1μl 5×脱酰基缓冲液在37℃孵育40分钟，然后加入10μl TE缓冲液，即得含脱酰化tRNA的总RNA（7μl含400ng RNA）；而未经处理的RNA，含未氨酰化和氨酰化的tRNA，但仅有未氨酰化的tRNA能与tRNA接头连接。
2.2将抽提的tRNA与独特接头SEQ ID NO.1连接。
具体步骤如下：
1.取2.1中脱酰化处理和未脱酰化的总RNA各400ng，分别加入2μl (20pm) tRNA独特接头SEQ ID NO.1，最后加无RNA酶水补充至9μl，在90℃ 孵育3分钟。
2.在上述反应液体中分别加入1μl 10×Tris-HCl(50mM，pH8.0)，37℃ 孵育20分钟。
3.在上述反应液中分别加入连接酶缓冲液2μl，T4 RNA连接酶0.1μl，无RNA酶水7.9μl，37℃ 孵育60分钟。
2.3 mRNA与tRNA共反转录
具体步骤如下：
1.在2.2的20μl连接产物中，分别加入接头特异性下游引物SEQ ID NO.2 2μl，加入无RNA酶水补充至24μl，在65℃孵育5分钟，立即冰上孵育。
2.在上述体液中分别加入6μl 5×Prime Script RT Master Mix共反转录反应液，在37℃孵育15分钟，85℃孵育5s。
2.4 qPCR反应体系配置及程序
具体步骤如下：
1.利用SYBR®Premix Ex TaqTM II试剂对各tRNA和内参基因GAPDH的转录情况进行检测，tRNA谱检测的引物组序列如表1中所示，qPCR反应体系配置：2×SYBR® Premix ExTaqTM II加入5μl；上下游引物(10pm)各0.2μl；cDNA模板2μl（根据检测tRNA基因数量作适当的稀释）；加入双蒸水补充至10μl。其中人、鸡、鸭共同使用的下游引物为SEQ ID NO.2；人、鸡、鸭分别使用的tRNA反密码子特异性上游引物如下：
人类基因组编码tRNA上游引物见表1(SEQ ID NO.4-60)，线粒体编码tRNA上游引物见表2 （SEQ ID NO.137-158）
鸡基因组编码tRNA上游引物见表1(SEQ ID NO.61-103)，线粒体编码tRNA上游引物见表2 （SEQ ID NO.159-180）
鸭基因组编码tRNA上游引物见表1(SEQ ID NO.61-73和SEQ ID NO.104-136)，线粒体编码tRNA上游引物见表2 （SEQ ID NO.181-202）
需要说明的是，本试验步骤中所用的cDNA也可用于人、鸡、鸭细胞总tRNA氨酰化水平的检测，但所使用的引物组与上述引物组有所不同。对于人、鸡、鸭总tRNA氨酰化水平的检测，其上游引物均使用SEQ ID NO.3,下游均使用SEQ ID NO.2。其中上游引物结合tRNA接头的5’末端，是所有tRNA对应cDNA的共有半接头，即图1中接头绿色所示部分。
2.Real-Time PCR反应条件：
95℃预变性30s，95℃变性10s，59℃退火延伸30s，72℃延伸30s，45次循环，95℃、60s，65℃、60s，65-95℃、15s，每个循环增加0.3℃，绘制溶解曲线。
2.5计算人、鸡、鸭细胞核基因组和线粒体编码tRNA的氨酰化水平
结论：
如图2所示，能够很好的检测人类、鸡、鸭三种物种细胞核编码的全部tRNA的氨酰化水平。如图3所示，能够很好的检测人类、鸡、鸭三种物种线粒体编码的22种tRNA的氨酰化水平。如图4所示，使用SEQ ID NO .2所示的通用特异性下游引物以及如SEQ ID NO .3所述上游引物，也能较好的检测的检测人类、鸡、鸭三种总tRNA的氨酰化水平。以上实例说明三种物种的tRNA的氨酰化水平存在一定的差异，这些数据对定量细胞tRNA的氨酰化水平提供了重要的参考和技术支持。本实例是在上述三种物种的部分细胞类型中实施的，当然也可以广泛的应用于本发明涉及的这三种物种的其它细胞的tRNA氨酰化相关科学研究。
实施例2：
qPCR检测鸭肝炎病毒（DHAV）感染后tRNA-Cys-GCA和tRNA-Ser-GCU氨酰化水平
1.试验材料：
鸡胚成纤维细胞按照常规方法制备，RNA 抽提: EZ-10 DNAaway RNA 小量提取试剂盒，脱酰基缓冲液(50ml):5×Tris-HCl(100mM,pH9.0)，退火缓冲液(50ml):10×Tris-HCl(50mM, PH8.0)，T4 RNA连接酶(dsRNA连接酶)(NEB,M0239L)，5×Prime Script RTMaster Mix (Takara, RR036Q)，Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme：Q712)。
2.试验方法（参考图1下半部分）
2.1采用试剂盒抽提鸡胚成纤维细胞DHAV感染细胞总RNA。
具体步骤与实例1中相同。
2.2将抽提的tRNA与独特接头SEQ ID NO .1连接
具体步骤与实例1中相同。
2.3 mRNA与tRNA共反转录
具体步骤与实例1中相同。
2.4 qPCR反应体系配置及程序
主要步骤与实例1相同，其中tRNA-Cys-GCA和tRNA-Ser-GCU检测使用的上游引物为SEQ ID NO.80 和 SEQ ID NO.95，下游引物均为SEQ ID NO.2。
2.Real-Time PCR反应条件：
具体步骤与实例1中相同。
2.5计算DHAV感染细胞后tRNA-Cys-GCA和tRNA-Ser-GCU的氨酰化水平。
结论：
如图5所示，能够很好的检测tRNA-Cys-GCA和tRNA-Ser-GCU的氨酰化水平。ΔCt为tRNA检测Ct与GAPDH内参基因检测Ct的差值。在DHAV感染细胞的RNA中，脱酰化后的tRNAΔCt比未脱酰化的tRNAΔCt较低，经数据归一计算后，tRNA-Cys-GCA的氨酰化水平为96.61%，而tRNA-Ser-GCU的氨酰化水平为80.90%。以上实例说明病毒感染细胞中的tRNA氨酰化水平存在一定的差异，这些数据对于揭示病毒调节细胞tRNA的氨酰化提供了重要的参考和技术支持。
实施例3：
qPCR检测鸭肝炎病毒（DHAV）感染后细胞核和线粒体编码tRNA组的动态变化
1.试验材料
鸡胚成纤维细胞按照常规方法制备，RNA 抽提: EZ-10 DNAaway RNA 小量提取试剂盒，脱酰基缓冲液(50ml):5×Tris-HCl(100mM,pH9.0)，退火缓冲液(50ml):10×Tris-HCl(50mM, PH8.0)，T4 RNA连接酶(dsRNA连接酶)(NEB,M0239L)，5×Prime Script RTMaster Mix (Takara, RR036Q)，Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme：Q712)。
2.试验方法（参考图1）
2.1采用试剂盒抽提鸡胚成纤维细胞DHAV感染细胞和非感染细胞。
具体步骤与试剂盒说明书相同，本发明将去氨基酸步骤和RNA抽提合并以简化步骤，即在洗脱前加入10μl 脱酰基缓冲液在37℃孵育40分钟，然后加入20μl TE 缓冲液洗脱。
2.2将抽提的tRNA与独特接头SEQ ID NO .1连接
具体步骤如下：
1.取400ng总RNA，加入2μl (20pm) tRNA独特接头SEQ ID NO .1，最后加无RNA酶水补充至9μl，在90℃ 孵育3分钟。
2.在上述反应液体中加入1μl 10×Tris-HCl(50mM，pH8.0)，37℃ 孵育20分钟。
3.在上述反应液中加入连接酶缓冲液2μl，T4 RNA连接酶0.1μl，无RNA酶水7.9μl，37℃ 孵育60分钟。
2.3 mRNA与tRNA共反转录
具体步骤如下：
1.在2.2中连接产物20μl，加入接头特异性下游引物2μl，加入无RNA酶水2μl补充至24μl，在65℃孵育5分钟，立即冰上孵育。
2.在上述体液中加入6μl 5×Prime Script RT Master Mix共反转录反应液，在37℃孵育15分钟，85℃孵育5s。
2.4 qPCR反应体系配置及程序
具体步骤如下：
1.利用SYBR®Premix Ex TaqTM II试剂对各tRNA和内参基因GAPDH的转录情况进行检测，tRNA谱检测的引物组序列如表1中所示，qPCR反应体系配置：2×SYBR® Premix ExTaqTM II加入5μl；上下游引物(10pm)各0.2μl，其中鸭基因组编码tRNA反密码子特异性上游引物见表1(SEQ ID NO.61-73和SEQ ID NO.104-136)，线粒体编码tRNA反密码子特异性上游引物见表2 （SEQ ID NO.181-202），下游引物均为SEQ ID NO.2；cDNA模板2μl；加入双蒸水补充至10μl。 2.Real-Time PCR反应条件：
95℃预变性30s，95℃变性10s，59℃退火延伸30s，72℃延伸30s，45次循环，95℃、60s，65℃、60s，65-95℃、15s，每个循环增加0.3℃，绘制溶解曲线。
2.5采用2-ΔΔCt法计算DHAV感染细胞后细胞核和线粒体编码tRNA组的变化。
结论：
如图6所示，细胞核基因组编码的成熟tRNA均可被检测到。在DHAV感染细胞中，与非感染细胞相比大部分的细胞核基因组编码的tRNA表达下调，仅有tRNA-Arg-UCG、tRNA-Arg-ACG和tRNA-Gln-UUG上调。线粒体编码的22种tRNA中仅有tRNA-Asn-GTT上调，其余tRNA均出现不同程度的下调。这些数据对于揭示病毒调节细胞tRNA组变化提供了重要的参考和技术支持。本发明可以广泛的应用于tRNA生物学的科学研究，以及相关的分子生物学研究领域。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）抽提总RNA；
（2）所述抽提的总RNA中tRNA去氨基酸，得到含有全部脱酰化的tRNA；
（3）将步骤（1）和步骤（2）所得总RNA分别进行如下步骤：
A.与独特接头序列混合、孵育后，得到含有接头连接的tRNA混合液；所述独特接头序列与去氨酰化tRNA尾部的ACC连接;
B.所述混合液加入可结合独特接头的通用特异性下游引物配置成退火溶液，连接tRNA退火化；
C.退火化的连接tRNA与mRNA共反转录得到cDNA；
D.qPCR检测：上游引物为tRNA反密码子特异性的引物，下游引物为所述可结合独特接头的通用特异性下游引物；所述cDNA经qPCR检测得Ct值；二者Ct值的差值即tRNA的氨酰化水平。
2.按照权利要求1所述tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法，其特征在于，所述独特接头核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，可通用于人类、鸡或鸭细胞的核或线粒体tRNA氨酰化水平的定量检测。
3.按照权利要求2所述tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法，其特征在于，可结合独特接头的通用特异性下游引物如SEQ ID NO.2所示。
4.按照权利要求1所述tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法，其特征在于，所述上游引物为SEQ ID NO.3所示，可通用于人类、鸡或鸭细胞总tRNA氨酰化水平的定量检测。
5.按照权利要求2所述tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法，其特征在于，所述人类细胞核中每种tRNA，上游引物分别为SEQ ID NO.4～60所示；所述人类线粒体中每种tRNA，上游引物分别为SEQ ID NO.137～158所示。
6.按照权利要求2所述tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法，其特征在于，所述鸡细胞核中每种tRNA，上游引物分别为SEQ ID NO.61～103所示；所述鸡线粒体中每种tRNA，上游引物分别为SEQ ID NO.159～180所示。
7.按照权利要求3所述tRNA氨酰化水平定量qPCR检测方法，其特征在于，所述鸭细胞核中每种tRNA，上游引物分别为SEQ ID NO.61～73和SEQ ID NO.104～136所示；所述鸭线粒体中每种tRNA，上游引物分别为SEQ ID NO.181～202所示。
8.用于人类、鸡或鸭总tRNA氨酰化水平定量qPCR检测的试剂盒，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示的接头、如SEQ ID NO .2所示的通用特异性下游引物和如SEQID NO .3所述上游引物。
9.用于人类细胞核中每种tRNA氨酰化水平定量qPCR检测的试剂盒，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示的接头、如SEQ ID NO .2所示的通用特异性下游引物和如SEQ ID NO.4～60所述上游引物。
10.用于人类线粒体中每种tRNA氨酰化水平定量qPCR检测的试剂盒，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示的接头、如SEQ ID NO .2所示的通用特异性下游引物和如SEQ ID NO.137～158所述上游引物。
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