KR20150081774A - 뽕나무 동정방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 19(서열번호 1 및 2), 28(서열번호 3 및 4), B2-3(서열번호 5 및 6), B2-26(서열번호 7 및 8), B2-28(서열번호 9 및 10), B2-42(서열번호 11 및 12), B2-48(서열번호 13 및 14) 및 B2-55(서열번호 15 및 16)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머 쌍을 사용하는 뽕나무 동정방법, 키트 및 프라이머 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 뽕나무 동정기술은 외관상으로는 용이하게 구별되지 않는 뽕나무의 유전형을 보다 정확하고 신속하게 구분할 수 있기 때문에, 뽕나무의 중요한 유전자 개발, 농업적 형질연구와 신규 품종이 육성 등을 포함하는 산업적 유용성을 높이는데 상당히 유용하다.

Description

뽕나무 동정방법{Method for identifying of Mulberry tree}

본 발명은 형광물질을 표식된 프라이머를 사용한 PCR 방법으로 유전자형 분석하여 뽕나무를 동정하는 방법, 및 상기 프라이머를 포함하는 뽕나무 동정용 키트및 프라이머 조성물에 관한 것이다.

종래의 식물 동정은 전통적인 멘델의 법칙을 활용한 표현형 위주의 형태학적 형질 이외에 생화학적 특성 등을 근거로 해 왔으나, 이러한 방식은 변이의 빈도가 낮고, 보편적인 동정방식에 적용하기보다는 종자의 순도 검정, 종자 혼종 구분 등, 제한적으로 이용될 수밖에 없다. 따라서, 품종 식별에 직접 적용이 가능한 효과적인 기법 도입에 대한 필요성이 대두되었으며, 대표적으로 DNA 마커에 대한 특성조사에 대한 관심이 높아지고 있다.

DNA 마커는 품종의 유전적 특성뿐만 아니라, 식물체의 보편적 특징을 반영하기 때문에, 품종간 구별성을 계량화가 우수하여, 이와 관련된 DNA genotyping 기술로는 RFLP(restriction fragment length polymorphism), RAPD(random amplified polymorphism DNA), AFLP(amplified fragment length polymorphism), SSR(simple sequence repeat) 등의 다양한 마커를 이용한 기술이 활용되고 있다.

마이크로새틀라이트 DNA(Microsatellite DNA)는 1~5개의 SSR로서, 대부분 진핵생물의 게놈에 분포되어 있으며, 식물에서는 (AT)n repeat, (GA)n repeat가 주종을 이루는 특징이 있다. 상기 유전자 변이에 의하여 다양성과 연관된 연구에 활용이 가능하여, 유전자원을 평가할 수 있으며, 이러한 결과는 작물의 유전적 다양성을 검토하여 육종 간 계통을 분류할 수 있고, 궁극적으로는 중요한 유전자 개발, 농업적 형질연구와 신규 품종 육성을 위하여 활용될 수 있다.

뽕나무는 열대지방부터 온대지역에 걸쳐 널리 분포하는 뽕나무과(Moracceae), 뽕나무속(Morus)에 속하는 식물(Jeong et al. 2002)로서, 10여종이 있으나, 국내에서는 산뽕나무(Morus bombycis), 돌뽕나무(Morus cathayana) 및 몽고뽕나무(Morus mongolica) 등이 주로 서식하고 있다. 6월에 암꽃과 수꽃이 한 그루에 따로 피거나 따른 그루에 피며, 열매는 6월에 흑자색으로 익는 특징이 있다. 뽕나무 잎은 잠엽이라하여 누에를 기르는데 사용한다.

뽕나무는 한자로 상(桑)이라하며, 어린가지를 상지, 잎을 상엽, 열매를 상감자, 뿌리껍질을 상백피라 하여 모두 약재로 사용되고 있으며, 한방에서 상지는 신경통 치료에, 상엽은 해열제로, 상감자는 강장제, 발모촉진제 및 빈혈 예방에 사용하고, 상백피는 이뇨제와 고혈압 치료제로 쓴다. 또한, 뽕나무의 효능에 대한 활발한 연구가 진행되어, 술독을 제거하는 아스파라긴산과 알라닌, 뇌 속의 피를 잘 돌게 하고 콜레스테롤을 제거하며, 노인성 치매를 예방해주는 세린과 타이로신이 상당량 함유되어 있으며, 칼슘은 양배추의 60배, 철분은 무의 160배 등의 미네랄이 상당히 풍부한 것으로 알려져 있다.

잠상산물을 이용한 생물 신소재 개발에 대한 연구가 활발히 진행됨에 따라 주로 누에 사육용으로만 이용되던 뽕나무가 최근 생약재료로 이용되고, 오디의 과실은 잼과 과실주의 재료로 이용되는 등, 가공분야로 확대되고 있는 추세이다. 또한 뽕잎에 대한 항산화 연구(Part et al ., 2008; Kim HB, 2005; Jeon et al ., 2011), 뽕잎의 혈당강화 효과에 대한 연구(Lee et al ., 1998; Kang et al., 2006) 등이 활발하게 이루어지면서, 뽕잎이 기능성 식품, 화장품, 의약품의 신소재로서 가능성을 인정받고 있다.

따라서, 우수한 뽕나무 품종을 동정하고, 유전적 특성을 평가하여 산업적 가치를 극대화할 필요가 있다.

이에 본 발명자들은, 뽕나무의 산업적 유용성을 높이기 위하여, 뽕나무를 보다 신속하고 용이하게 동정할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 서로 다른 뽕나무 개체로부터 유래된 마이크로새틀라이트 DNA에 대해 특정 서열의 프라이머 조합에 의한 PCR 반응으로 수득한 증폭산물에 의하여 뽕나무 개체의 구분이 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 19(서열번호 1 및 2), 28(서열번호 3 및 4), B2-3(서열번호 5 및 6), B2-26(서열번호 7 및 8), B2-28(서열번호 9 및 10), B2-42(서열번호 11 및 12), B2-48(서열번호 13 및 14) 및 B2-55(서열번호 15 및 16)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머 쌍을 사용하는 뽕나무 동정기술을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 뽕나무로부터 게놈 DNA를 수득하는 단계; (ii) 상기 수득한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 19(서열번호 1 및 2), 28(서열번호 3 및 4), B2-3(서열번호 5 및 6), B2-26(서열번호 7 및 8), B2-28(서열번호 9 및 10), B2-42(서열번호 11 및 12), B2-48(서열번호 13 및 14) 및 B2-55(서열번호 15 및 16)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머 쌍을 사용하여 효소중합반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및, (iii) 상기 반응 산물로부터 대립 유전자를 파악하여 뽕나무를 동정하는 단계를 포함하는 뽕나무의 동정방법을 제공한다.

본 발명은 또한 19(서열번호 1 및 2), 28(서열번호 3 및 4), B2-3(서열번호 5 및 6), B2-26(서열번호 7 및 8), B2-28(서열번호 9 및 10), B2-42(서열번호 11 및 12), B2-48(서열번호 13 및 14) 및 B2-55(서열번호 15 및 16)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머 쌍과, 폴리뉴클레오타이드 주형, DNA 중합효소, dNTPs 및 완충용액을 포함하는 뽕나무 동정용 PCR 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 19(서열번호 1 및 2), 28(서열번호 3 및 4), B2-3(서열번호 5 및 6), B2-26(서열번호 7 및 8), B2-28(서열번호 9 및 10), B2-42(서열번호 11 및 12), B2-48(서열번호 13 및 14) 및 B2-55(서열번호 15 및 16)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머 쌍으로 구성된 뽕나무 동정용 프라이머 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 뽕나무 동정기술은 외관상으로는 용이하게 구별되지 않는 뽕나무의 유전형을 보다 정확하고 신속하게 구분할 수 있기 때문에, 뽕나무의 중요한 유전자 개발, 농업적 형질연구와 신규 품종이 육성 등을 포함하는 산업적 유용성을 높이는데 상당히 유용하다.

도 1은 20종의 뽕나무 유래의 게놈 DNA에 대한 PCR 결과이다.
도 2는 19 프라이머를 이용해 증폭된 시료의 유전자형 분석결과이다.
도 3은 28 프라이머를 이용해 증폭된 시료의 유전자형 분석결과이다.
도 4는 B2-3 프라이머를 이용해 증폭된 시료의 유전자형 분석결과이다.
도 5는 B2-26 프라이머를 이용해 증폭된 시료의 유전자형 분석결과이다.
도 6은 B2-28 프라이머를 이용해 증폭된 시료의 유전자형 분석결과이다.
도 7은 B2-42 프라이머를 이용해 증폭된 시료의 유전자형 분석결과이다.
도 8은 B2-48 프라이머를 이용해 증폭된 시료의 유전자형 분석결과이다.
도 9는 B2-55 프라이머를 이용해 증폭된 시료의 유전자형 분석결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 뽕나무를 신속하게 동정하는 방법을 개발하기 위하여, 특정 서열의 프라이머 쌍을 이용한 PCR법을 활용하고자 하였으며, 동정 타겟으로 마이크로새틀라이트 DNA에 주목하였다. 상기 마이크로새틀라이트 DNA는 유전체 상에 수회에서 수백회에 걸쳐 반복되어 존재하는 작은 DNA 단편으로서, 다양한 대립유전자를 포함하고 있기 때문에 뽕나무 식별 마커로 활용이 가능하다.

뽕나무로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 다양한 마이크로새틀라이트 DNA를 증폭시킬 수 있는 다양한 종류의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 다양한 크기의 PCR 산물을 수득할 수 있었는데, 단일의 PCR 산물만으로는 각 뽕나무를 동정하는데 어려움이 있었다. 그러나, 각 PCR 산물의 크기분석, 대립유전자의 조합분석 또는 대립유전자의 개수 분석을 통해 뽕나무 동정이 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 일 관점에서, (i) 뽕나무로부터 게놈 DNA를 수득하는 단계; (ii) 상기 게놈 DNA를 주형으로 하고, 19(서열번호 1 및 2), 28(서열번호 3 및 4), B2-3(서열번호 5 및 6), B2-26(서열번호 7 및 8), B2-28(서열번호 9 및 10), B2-42(서열번호 11 및 12), B2-48(서열번호 13 및 14) 및 B2-55(서열번호 15 및 16)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머 쌍을 사용하여 효소중합반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및, (iii) 상기 반응 산물로부터 대립 유전자를 파악하여 뽕나무를 동정하는 단계를 포함하는 뽕나무의 동정방법에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, 19(서열번호 1 및 2), 28(서열번호 3 및 4), B2-3(서열번호 5 및 6), B2-26(서열번호 7 및 8), B2-28(서열번호 9 및 10), B2-42(서열번호 11 및 12), B2-48(서열번호 13 및 14) 및 B2-55(서열번호 15 및 16)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머 쌍과, 폴리뉴클레오타이드 주형, DNA 중합효소, dNTPs 및 완충용액을 포함하는 뽕나무 동정용 PCR 키트에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 19(서열번호 1 및 2), 28(서열번호 3 및 4), B2-3(서열번호 5 및 6), B2-26(서열번호 7 및 8), B2-28(서열번호 9 및 10), B2-42(서열번호 11 및 12), B2-48(서열번호 13 및 14) 및 B2-55(서열번호 15 및 16)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머 쌍으로 구성된 뽕나무 동정용 프라이머 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 프라이머 쌍 19(서열번호 1 및 2), 28(서열번호 3 및 4), B2-3(서열번호 5 및 6), B2-26(서열번호 7 및 8), B2-28(서열번호 9 및 10), B2-42(서열번호 11 및 12), B2-48(서열번호 13 및 14) 및 B2-55(서열번호 15 및 16)는 마이크로새틀라이트 DNA의 특정부위에 혼성화되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서의 용어 '프라이머'는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미하는데, 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 효소중합반응(PCR, Polymerase Chain Reaction)에 사용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 수단을 이용하여 서열의 일부 또는 전체를 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, '캡화', 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 가능하다.

본 발명의 방법, 키트 및 조성물에 포함된 프라이머는 표지용 물질로 표지되어, 효소중합반응에 의한 증폭산물을 보다 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명에서의 용어, '표지용 물질'이란, 상기 증폭산물의 존재여부를 가시적으로 확인하도록 보조하는 물질을 의미하는데, 대체로 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않으며, 당업자에 의하여 용이하게 선택할 수 있다.

본 발명에서 상기 효소는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 될 수 있고, 이용 가능한 형광물로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 될 수 있으며, 이용 가능한 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 될 수 있고, 이용 가능한 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 될 수 있고, 이용 가능한 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 될 수 있고, 이용 가능한 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 될 수 있으며, 이용 가능한 방사선동위원소로는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I , ¹⁸⁶Re 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 '마이크로새틀라이트 DNA(Microsatellite DNA)'란, 유전체 상에 수회에서 수백회에 걸쳐 반복되어 존재하는 작은 DNA 단편으로서, 대체로 염색체의 텔로미어에 대량 분포한다고 알려져 있다.

본 발명의 방법에서 뽕나무를 구별하는 방법은 시료에 대한 PCR 증폭 산물로부터 PCR 산물의 크기, PCR 산물의 조합 및 개수를 파악하여,이로부터 PIC(Polymorphism Information Contents)를 구함으로써 가능하다.

상기 PCR 산물은 대립유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머에 의하여 증폭된 부분이기 때문에, 본 발명에서는 "PCR 산물"과 "대립 유전자"의 용어는 혼용될 수 있다.

본 발명의 용어 'PCR 산물의 크기' 분석은 상기 각 프라이머를 이용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 결과로 나타난 밴드의 크기 범위를 분석하여 수행하는 분석방법을 의미한다.

본 발명의 용어 '대립유전자의 조합' 분석은 상기 각 프라이머를 이용하여 수득한 PCR 산물로부터 시료가 대립유전자를 갖는 것으로 확인된 경우, 상기 프라이머와 대립유전자의 조합의 패턴을 분석하여 수행하는 분석방법을 의미한다.

예를 들어, 뽕나무 10 품종의 경우에는 19 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 265bp이고, 28 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 220과 268bp이며, B2-3 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 123과 135bp이고, B2-26 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 119와 123bp이며, B2-28 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 177bp이며, B2-42 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 178bp이며, B2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 169bp이며, B2-55 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 213과 219bp로 대립유전자를 가지고 있는 것으로 분석 되었다. 이와 같은 방법으로 품종 간에 마이크로새틀라이트 마커별로 대립유전자의 조합 분석을 통하여 품종을 동정할 수 있다.

본 발명의 용어 '대립유전자의 개수' 분석이란, 상기 각 프라이머를 이용하여 수득한 PCR 산물을 전기영동할 경우, 상기 PCR 산물의 밴드 개수의 패턴을 분석하여 수행하는 분석방법을 의미하는데, 구체적으로 상기 각 프라이머를 이용하여 수득한 PCR 산물을 전기영동할 경우, 상기 이형접합체(Heterzygote)의 경우 PCR 산물이 대립유전자를 갖는 경우에는 두 개의 밴드를 나타내고, 상기 동일접합체(Homozygote)의 경우 PCR 산물이 대립유전자를 갖지 않는 경우에는 하나의 밴드를 나타내므로, 상기 각 프라이머와 이에 상응하는 밴드의 개수 변화를 분석하는 방법이 될 수 있다.

상기 PCR 산물의 크기, 대립유전자의 조합 및 개수를 종합하여 PIC를 도출하는 계산공식은 매우 복잡하기 때문에, 통상적으로 컴퓨터 프로그램을 이용하여 계산한다. 본 발명에서는 PowerMaker 프로그램(http://statgen.ncsu.edu/powermarker/analysis.htm)을 사용하여 통계학적 분석을 수행할 수 있으며, PIC 도출이 가능한 프로그램은 어느 것이든 사용할 수 있고, 이러한 선택은 당업자에게 자명하다.

예를 들어, 뽕나무 10 품종의 경우에는 19 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, 28 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이고, B2-3 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이고, B2-26 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이고, B2-28 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, B2-42 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, B2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, B2-55 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개로 분석되었다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

이 때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

실시예 1: 뽕나무로부터 게놈 DNA 의 추출

서로 다른 20종의 뽕나무의 조직을 DNA 추출키트(DNeasy mini-prep kit, QIAGEN)에 적용하여 각각의 게놈 DNA를 수득하고, Nanodrop으로 추출량을 측정하였다(표 1).

상기 뽕나무의 품종은 농촌진흥청에서 보존하고 있는 것으로, 매년 형질특성 조사를 위해 수집된 것을 본 동정기술을 검증하는데 사용하였다.

시료	품종	DNA 농도(ng/㎕)
뽕나무 3 뽕나무 4 뽕나무 5 뽕나무 6 뽕나무 7 뽕나무 8 뽕나무 9 뽕나무 10 뽕나무 11 뽕나무 12 뽕나무 13 뽕나무 15 뽕나무 16 뽕나무 17 뽕나무 21 뽕나무 22 뽕나무 23 뽕나무 24 뽕나무 25 뽕나무 28	절곡조생 무자대십 과상2호 대붕뽕 익수뽕 청강상 미국13호 터키D 청일뽕 개량뽕 구곡상 꼬리뽕 수성뽕 BR 60 대성뽕 하수상 대붕뽕(경남) 대축뽕 청수뽕 오끼나와	68.0 89.1 76.6 45.6 67.5 87.2 100.9 59.7 66.1 71.8 23.6 34.3 25.5 62.3 59 48.9 53.2 60.3 70.9 80.5

실시예 2: 효소중합반응에 의한 마이크로새틀라이트 DNA 의 증폭

1. 프라이머의 제작

뽕나무 17(BR 60) 잎에서 추출된 게놈 DNA 유래 마이크로새틀라이트 DNA 라이브러리의 유전자 서열(서열번호 17 ~ 90)을 참고하여, 8종의 프라이머(19, 28, B2-3, B2-26, B2-28, B2-42, B2-48 및 B2-55)를 설계하였다(표 2).

서열번호	프라이머 이름	염기서열 (5'->3')	프라이머 길이(mer)	반복부위	예상 사이즈(bp)	Tm값 (℃)
1	19-F	CCCCACTAAAAGCCATCAAG	20	(CTCA)6	265	54
2	19-R	CCTACCTCTTCCGAAACGTG	20			56
3	28-F	TTGGCGCCCAATGAGAAT	18	(TC)17	244	51
4	28-R	GAGGCTACCCCAATCCTGTT	20			56
5	B2-3-F	CATTGGTCCTATCACTGACACA	22	(GA)27	133	55
6	B2-3-R	CAGGAAGAGATTTTGGCACCT	21			55
7	B2-26-F	GCCCTACTAACTGCACGGATT	21	(CT)17	145	57
8	B2-26-R	CATGCGCAACTTGACCTTTA	20			52
9	B2-28-F	GCTTCAGAAAGCTAGAGAGAGAAA	24	(GA)17	175	56
10	B2-28-R	CATCTCAGAAACCAGCAGCA	20			54
11	B2-42-F	CAACAACCATGGGTCAAACA	20	(CT)15	152	52
12	B2-42-R	CACATGTGTGCCGCTCTACT	20			56
13	B2-48-F	TCTTGACTGCTTGTTCTCTTGG	22	(CT)21	163	55
14	B2-48-R	TTCATCGATGCCATTTTCAA	20			48
15	B2-55-F	CGATCAAGGGCTAAATGGAA	20	(TTC)14	234	52
16	B2-55-R	TATGCCAACCTGACAAGCAC	20			54

이 중에서 정방향 프라이머는 5'-말단을 형광물질인 FAM(SAFC, USA)으로 표지하여 합성하였다. 상기 프라이머의 합성은 Mermade 192(Bio automation corporation/ Sweden) 및 Polygen(Gmbh/ Germany)를 사용하여, 제조사가 권장하는 방법에 따라 detritylation(deblocking) step, activation step, coupling step, oxidation step 및 capping step을 통하여 수행하였는데, Detritylation(deblocking) step에서는 고형지지체(Solid support)에 부착된 단량체(monomer)로부터 DMT를 때어내고, Activation step에서는 Tetrazole을 사용하여 phosphoramidite monomer를 활성화시켰으며, Coupling step에서는 활성화된 phosphoramidite를 solid support에 coupling 시켜 triphosphite ester bond를 형성시키고, Oxidation step에서는 Oxidation 반응을 통해 DNA의 기본 연결 구조인 phosphate bond 형태를 갖추게 하였으며, Capping step에서는 Capping 되지 않은 5'-OH 기를 acetyl로 capping하여 원하지 않는 chain elongation을 방지시켰다.

2. PCR 증폭반응

실시예 1에서 수득한 20종의 뽕나무 유래의 게놈 DNA 50ng, 및 상기 제작한 프라이머 1㎕, 2.5mM의 dNTP 혼합용액 4㎕, 2.5 unit의 Super Taq DNA polymerase(ELPIS, KOREA) 0.5㎕, 5㎕의 10X PCR 완충용액(15mM MgCl₂ 포함), 및 3차 증류수 33.5㎕을 포함하는 PCR 반응용액 50㎕를 ABI 2720 Thermal cycler(Applied Biosystems)에 적용하여 PCR을 수행하였다. 이때, 상기 PCR 반응은 95℃에서 3분간 열변성, 30 사이클의 PCR 반응(94℃ 30초, 57℃ 또는 56℃ 30초 및 72℃ 1분) 및 72℃에서 5분간 최종 신장 반응을 순차적으로 수행하였다. 반응이 종료된 후, 10㎕의 PCR 반응산물과 2㎕의 6X Gel loading buffer(BIONICS, KOREA)를 혼합하고, 이를 Ethidium Bromide가 첨가된 1.0% Agarose 젤에서 전기영동하고 자외선 조사 하에서 PCR 증폭 산물의 크기를 확인하였다(도 1).

그 결과, 19 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기는 245 - 273 bp이고, 28 프라이머는 220 - 268bp; B2-3 프라이머는 103 - 135bp; B2-26 프라이머는 119 - 157bp 이며; B2-28 프라이머는 155-199bp; B2-42 프라이머는 144-198bp; B2-48 프라이머는 143 - 171bp; 및 B2-55 프라이머는 207-330bp인 것으로 확인 되었다.

실시예3 : PCR 산물의 크기, 조합 및 대립유전자 개수 분석

먼저, 980㎕ Hi-Di formamide(Applied Biosystems)와 40㎕ GeneScanTM 500 LIZ SIZE Standard (Applied Biosystems)를 혼합하여 Genotyping용 gel loading buffer를 제조하였다.

한편, 96 well plate의 각 웰에 도 1로 확인된 PCR 산물 5㎕ 및 상기 genotyping용 gel loading buffer 10㎕를 각각 분주하고, spin-down 시킨 후에 Wisetherm heating block(대한과학)에 적용하여 95℃에서 3분간 열변성시키고, 곧바로 얼음에서 5분간 냉각시켰다. 상기 냉각된 각 시료 15㎕를 Microamp optical 96 well plate(Axygen)의 각 웰로 옮기고, spin-down 시킨 다음, 96-well palte base(Applied Biosystems), septa(Applied Biosystems) 및 96-well plate retainer(Applied Biosystems)와 함께 조립하여 조립체를 완성하고, 상기 조립체를 유전자 분석기(ABI 3730xl Genetic analyzer, Applied Biosystems)로 옮겨, 36cm Capillary 및 standard module을 이용하여 1시간 동안 전기영동하여 유전자형 결과를 얻었다.

상기 전기영동으로 도출된 결과에 의하여 도 2 내지 도 9에서 나타난 바와 같이, 각 프라이머로 증폭된 시료의 대립유전자 개수, 크기 및 조합 상태를 파악하였으며, 이러한 유전자형(Genotyping) 결과를 DS-33 Install Standard을 Matrix로 사용한 GeneMapper 소프트웨어 4.0에 적용하여 분석하였다. 그 결과, 20종의 뽕나무에 대한 각 프라이머별로 각 시료의 대표적인 유전자형을 정리하면 다음과 같다(표 3).

프라이머	대립유전자 개수	대립유전자
19	6	A1, A2, A3, A4, A5, A6
28	12	1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12
B2-3	11	A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11
B2-26	11	A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11
B2-28	12	A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12
B2-42	12	A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12
B2-48	10	A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10
D2-55	10	A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10

또한 표 3의 결과를 PowerMarker 프로그램에 적용하여 통계학적으로 분석하였다. 그 결과, 19 프라이머를 이용하면 변별력에 기준이 되는 PIC(Polymorphic in contents) 값은 0.6648이고, 이용도는 100%를 나타내었으며; 28 프라이머를 이용하면, PIC 값은 0.8495이고, 이용도는 100%를 나타내었으며; B2-3 프라이머를 이용하면, PIC 값은 0.8460이고, 이용도는 100%를 나타내었으며; B2-26 프라이머를 이용하면, PIC 값은 0.7840이고, 이용도는 100%를 나타내었으며; B2-28 프라이머를 이용하면, PIC 값은 0.8739이고, 이용도는 100%를 나타내었으며; B2-42 프라이머를 이용하면, PIC 값은 0.8601이고, 이용도는 100%를 나타내었으며; B2-48 프라이머를 이용하면, PIC 값은 0.7905이고, 이용도는 100%를 나타내었으며; B2-55 프라이머를 이용하면, PIC 값은 0.6050이고, 이용도는 100%를 나타내었다(표 4).

Marker	Major.Allele .Frquency	Genotype No	Sample Size	No. of obs.	AlleleNo	Avail -ability	Gene Diversity	Hetero -zygosity	PIC
19	0.43	7	20	20	6	1	0.7088	0.35	0.6648
28	0.23	16	20	20	12	1	0.8638	1	0.8495
B2-3F	0.20	13	20	20	11	1	0.8613	0.45	0.8460
B2-26	0.38	13	20	20	11	1	0.8025	0.6	0.7840
B2-28F	0.23	15	20	20	15	1	0.8838	0.75	0.8739
B2-42	0.23	13	20	20	13	1	0.8725	0.45	0.8601
B2-48	0.33	12	20	20	10	1	0.8125	0.65	0.7905
B2-55	0.58	8	20	20	7	1	0.6313	0.75	0.6050
Mean	0.32	12.1	20	20	10.6	1	0.8045	0.63	0.7842

결론적으로, 20종의 서로 다른 뽕나무의 유전자형을 분석한 결과, 제조된 프라이머의 이용도(availability)는 1로서, 모두 100% 분석이 가능하며, PIC 값도 유의 검정 수준이 0.5 이상으로 매우 변별력이 높은 것으로 확인되었다.

Major.Allele.Frquency : 가장 빈도수가 높은 대립 유전자형의 비율
Genotype No. : 유전자형의 개수
Sample Size : 분석한 품종의 개수
No. of obs. : Null allele을 제외하고 마커로 분석되어진 품종의 개수
Allele No. : 대립유전자의 개수
Availability: 1-Obs(Obs: 대립유전자 개수; n: 개체수)
Gene diversity: 대립형질을 가질 확률
Heterozygosity: 전체에 대한 대립형질의 개체수 비율
Polymorphism information content(PIC): 다형성과 관련된 근연정도

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Method for identifying of Mulberry tree <130> P2013-0147 <160> 90 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 1 ccccactaaa agccatcaag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 2 cctacctctt ccgaaacgtg 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 3 ttggcgccca atgagaat 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 4 gaggctaccc caatcctgtt 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 5 cattggtcct atcactgaca ca 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 6 caggaagaga ttttggcacc t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 7 gccctactaa ctgcacggat t 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 8 catgcgcaac ttgaccttta 20 <210> 9 <211> 24 <212> DNA 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gtctgatgct 120 tcaaccggcc aaagagaaca ccaagagttt gtggcatcca atggtgtgta tctctctcac 180 acacaaacac acacacacac acacacacac acggtatctc tatcgaaata tgacttgtgt 240 attcatgtta ataattagca ggcggtgaag acacaagctg gcagagaaca aatgacaaca 300 aacatgacgc ccatactaaa tatagtgatg gtatttgagt ttttctctct tcttctattt 360 gtggattttt tctttctttc gtttttggat aagctttttc tctaatcatt tttctcaaat 420 ttgacttttc tgcaactcgt agagagaaat gattactctg gacaatcaat gggtctgaag 480 gttggaagta tcaagttggg aaaaattagg actgcggttt ctgattataa tcccaaattt 540 ggccaaggga gtggtgcaga tcgatatgaa actgctaccc cagaacaaac tcatacattg 600 ttggggaggg ctgttcctac ttcaggaagt gagagggtat attcgaggaa gcattcagaa 660 agacgggctg ttacatacaa tgagaacaat ggtgattatg gtcaaacacc cgtttcacat 720 tctttgccta aagatccaaa gcctctgctg aagttcaaat ttaaaaagcc cagtgattct 780 gctagctagg ccttaaac 798 <210> 18 <211> 305 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 18 caatgctggg attagtgggc aaaccttcag gtttggtcct cagatcagca gtgttttaaa 60 cgcaggatgt tatcacaggt ttgacttctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc 120 tctctctctc kctstctctc cctctcataa gtttgttttt ctcatacaat ttattattag 180 ttgaataatg acatgtgaat tatwtatctt gttaagwaaa tttttttaaa tcagaacaaa 240 caaacaaaag atacacatat ataacamacc gataaatccc tcattttttt tttcttttat 300 tgaat 305 <210> 19 <211> 288 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 19 tgacgttgga gtccacattc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca 60 accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt 120 taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaatt cagggccaag 180 ggctgctaaa ggaagcggaa cacgtaaaag ccattccgca aacggtgctg accccggatg 240 attgtcagct actgggctat ctgggaaagg gaaaacgcaa gcgcaaaa 288 <210> 20 <211> 374 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 20 ctctagatgc atgctcgagc ggccgccagt gtgatggata tctgagaatc gcccttgttt 60 aaggcctaat agcagaatcc attggtccta tcactgacac ataagtgaga gagagagaga 120 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga ttgtaggaat tacctggata 180 cacagaagaa taggtgccaa aatctcttcc tgctaaacac aagattcaat gtggtcaaca 240 cttccaatat ctttggttca attcttctcc actgagaatc ataattaacc aagtccattc 300 atcaagaaaa ttaaaggtaa gggaatgaga taaagtgatt ctgctagcta ggccttaaac 360 gggggcgaat tcca 374 <210> 21 <211> 509 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 21 tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca 60 accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt 120 taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaatt cagggcgcaa 180 gggctgctaa aggaagcgga acacgtagaa agccagtccg cagaaacggt gctgaccccg 240 gatgaatgtc agctactggg ctatctggac aagggaaaac gcaagcgcaa agagaaagca 300 cgtagcttgc agtgggctta catggcgata gctagactgg gcggtttatg gacagcaagc 360 ggaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc tggtaaggtt gggatgccct gcaaagtaaa 420 ctggatggct ttcttgccgc caaggatctg atggcgcagg ggatcaagat ctgatcagag 480 aaggatgaag gatcgttccc atgattgaa 509 <210> 22 <211> 959 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 22 tatttggaac actaaaggga gcccccgttt agagctgatg ggcaaatctg gtaacgtgcg 60 gaataagaag ggaagaaaca gaaagagcgg gcgctaggcg ctggcaagtg tagcggtcac 120 gatggggcgt accaccacac acgtcgcgtt taatgggccg ctacagggcg cgtccatttg 180 ccattcacga tgcgcaactg ttgcaaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattaccc 240 cagctggcga aagggggatg tgctccaagg cgattaagtt gggtaacttc agggttttcc 300 cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gaattgtact acgactcact ataggttgaa 360 ttgggccctc tagatgcatg cttgagcggc cgccagtgtg atggatatct gyagaattcg 420 yccttgttta aggcctagct agcagaatcc gttcacaaat atgagtttat gtgctcatty 480 gtgaatgtgt gttgggattg ggggagaagt gaaaggaaga gagagagaga gagagagaga 540 gagagagaga gagagagtaa attaaacaca gaggaatggc atgatgtttc tatatatgca 600 tttgaatcaa atgatcaata atcatcatga agattacaaa aaaaaaaaaa aaaaaacccg 660 gaaaaaagtc atttggacaa cagtttttta tttgcatgca ctaatttgta tatgtataaa 720 aacatatttg aaagtttatt ctagttttac tttcaaaaca caagagaaga tataacatga 780 acctgaataa ttgatcktgg gttcaaaaga acttaagaga taatgttaag caattaaaat 840 caagcatata cattaagcta ttaaatattt atgttgacag taacatccca cataacatgc 900 gaattagtgg ggaagagtta ggcatatgtt ggagtgattm kgckagctmk sccttaaac 959 <210> 23 <211> 564 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 23 tagccaccaa tcggcaaaat ccttaattaa atcaaacaaa taggcgtcca atagccattc 60 aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctcca cgccaaaggc 120 gaaaggggga tgtatcacaa ggagattacg ttgggtgacc cctcgccttt cccagtcttg 180 ttgttgtaaa gggacggcca gtgaataaaa ataagactca atatagggcg aattgggccc 240 tctagatgca aaaggagcgg ccgccagtgk rawggatats wgyagaatyv acccttgttt 300 aaggmmtarm tagmagrwtc wgvwadcgat gkrtggaacg tacagagaga aagagtgagt 360 cacgatgtac agagagagaa agagagagag agagagagak agtraygats gakgactcga 420 gggaacgtgt ttcaccatct gttaaaaccc acatgtacct actacccggt cggtgtggat 480 tgagtgtaac tgtgcgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg ttattcaagt gtgtgtgtgt 540 gattctgcta actatgtctt aaac 564 <210> 24 <211> 546 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 24 gtttaaggcc tagctagcag aatcctttca tttctgactg attttattct ctggctgcta 60 cagcttacgg agttgatatg ctgaatacaa ttggttatat 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360 ttccaatggt tgcttaattt gaaaccatcc tctcggttga agttatgtct atgtttgtat 420 atctgaatgg cttcgtggac aaatctctgg tggtaacctg taggtttgca gagcactttg 480 gtatcggaga agacaatatc atggtcacct acagcawwgt aacaatgatc cgctacagct 540 gaagaattga ttcggctttc tagccttaaa c 571 <210> 78 <211> 878 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 78 gtttaaggcc takmkagcwg aatcgaggga cagagaggga gagtcagaga gagagagtat 60 gaagactccc tgtactcccc catctccctt tctctctgca atgagtgagg tgatgaatat 120 gtgtgtctgt ttcagttcct attaatagta tggagcaggg atggaggtgc tgaagckgcs 180 tagaaaacag aggtcacact gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtrygygygt gtggtycwct 240 cctgttgact ccgccctakc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg 300 ttcgccggct ttccccgtca agctctaagt cgggggctcc ctttagggtt cctatttatt 360 gctttacggc cctcgacccc aaaaaatttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat 420 cgccctgata gacggatttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac 480 tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag 540 ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa 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tctgctagct aggccttaaa c 761 <210> 82 <211> 563 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 82 gtttaaggcc tagctagcag aatcrctagt aagtgtttaa aaaattatga cattaactca 60 cattaaaaaa ttagagaact cagttgtaaa atataaaaga aatcctacaa aaagaacgtc 120 catatattac taattattaa actttttggc gcccaatgag aattcactta ttaagctagt 180 taataaaaaa aataaataat aattaagatc cccaacatat tcatgaatta agcacaaagg 240 tattgtctct ctctctctct ctctctctct ctctctctcg tcgacgaacg catgccacaa 300 ggcattgacg cataaaagtc agcgatatac ccttgcccct tgactcccac gtgacgtcaa 360 cctttctaca acaggattgg ggtagcctcg taatttcaac tcaattatta tttaataatc 420 caaaatcaca aaaataaaca aagaaaccaa aaaactcagc atcttttcca tattttaaaa 480 gcaaaaaaaa aaatctcagc atcttcagtt cagagccgca ctcacctgag cgtcgaacag 540 attctgctag ctaggcctta aac 563 <210> 83 <211> 554 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 83 gtttaaggcc tagctagcag aatcacctga ataacaatta cagcgtgcag ctgatttcac 60 agcctcagtc ttccaagaag atttgtgtgt gtatgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 120 gtaagcatta ttgagattag cttgaagaac tgaaaagggc aatggaagtc atgaatctaa 180 cacaaaagaa aaaaaaatct gtaattaaaa cagttaataa ataaaaaaag aagttaaaat 240 taaatgatca agaaaaaaaa gaactgtaat tttgtttatt tattctgtta agaaaataag 300 aagtgtatga ctttgattac attcaactaa gttccgaaaa agcatatcct gaaaaataaa 360 ggtcggttag gatgatgttg gcaacggact cagatactac aggtaggggt caaatgttta 420 ttatcttcag acacgtgtgt ggagtgcggt gtttcagcga attagcttaa ttagaatata 480 ttatgtgtcg aaggatatat cataaaactg cagtcaaaga gaagaatagt gattctgcta 540 gctaggcctt aaac 554 <210> 84 <211> 286 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 84 gtttaagggt asgagcaaat caccgcattt actctcattt atttccccct ttgcctctct 60 cactctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctttag 120 agmwwtkams amwmrcaaca gcagtggaac agcaacaact aaagrscaag mawmgctkta 180 mkgccagcaa attccatgcr tggtaatatt tckatcaaat ccacatattt cttcttcttc 240 tctactttct ttatttttcc gtgattctgc tagctaggct ttaaac 286 <210> 85 <211> 563 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 85 gtttaaggcc tagctagcag aatctgttcg acgctcaggt gagtgcggct ctgaactgaa 60 gatgctgaga tttttttttt tgcttttaaa atatggaaaa gatgctgagt tttttggttt 120 ctttgtttat ttttgtgatt ttggattatt aaataataat tgagttgaaa ttacgaggct 180 accccaatcc tgttgtagaa aggttgacgt cacgtgggag tcaaggggca agggtatatc 240 gctgactttt atgcgtcaat gccttgtggc atgcgttcgt cgacgagaga gagagagaga 300 gagagagaga gagagagaca atacctttgt gcttaattca tgaatatgtt ggggatctta 360 attattattt atttttttta ttaactagct taataagtga attctcattg ggcgccaaaa 420 agtttaataa ttagtaatat atggacgttc tttttgtagg atttctttta tattttacaa 480 ctgagttctc taatttttta atgtgagtta atgtcataat tttttaaaca cttactagtg 540 attctgctag ctaggcctta aac 563 <210> 86 <211> 302 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 86 gtttaaggcc tagctagcag aatcgcaaga atggaaaagc agtggcgcat tcatatatat 60 ctacacacac acacacacac acaaagacat gaggtgtggg tctataatta ctaaaaatct 120 agggaaatct aaatctaaat atttgcaaag agcaaccaaa acttctggtc tgtttatatt 180 cgaccacaag ctacttggta tgttgagcca gtgacaaagg agctttcatt tacacaatgc 240 attcttaaaa atagagtgag agtagttcgc agggaactga ttctgctagc taggccttaa 300 ac 302 <210> 87 <211> 721 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 87 gtttaaggcc tagctagcag aatcgcttct ccaatttccc ttcaccccta gacaatgaac 60 aacataacat aagtgatcat catataagct actcgtatga caattctgtt aagaatctat 120 tttcttttcc tgaacttttt tatcccagaa ttttatcaca atatctaaca aacataaaca 180 aacacactga atatgaaaag atgagtggta ttaccgcttc agaagaacct ttccagcctc 240 agcaatgttc aatcgtgcaa gatgtttatt cttgtccaaa acatatgctt tgtcagtctt 300 cctttttggc attttctgca actgggtatc ttataacaac aacatttcag tctcgaaaat 360 ggaaattatt gcagaagaac gaaatgagac aaaagtatag gaaacgacct ttaccgatta 420 gaatttgtgt tttcaggaaa atttcaattt tcaatataaa aagcggaaaa aaaattcctg 480 ggtttcttct gaataagtta tatagcagct aaaaaagtga aattgcttat tcaaacaaag 540 aaaggggcaa ttcggaggga ttttagagag agagagagag agagagagag agagagagag 600 agagaaccag taatgaggac gtgagatcca cagtgcttgc agtaataaac gaagaggtca 660 gaatcgggac cgtcgggagc tgcgtcttcg ctagagtgat tctgctagct aggccttaaa 720 c 721 <210> 88 <211> 356 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 88 gtttraggcs takctagcak aatcgcaact ttgttgcatt gcaaacaaca aagttacaga 60 aggtcacatc aagaagaaac aaattgaggt agtcacaaag aaaacatgag agagagagag 120 agagagagag agagagagag agcgagagag agagagagag agagagagag agagagagag 180 agagagaaga aaagttgcct gtaagtaggt ttcctgctta gctgaaactt ataagaagat 240 agttcaagct gtttccaaat tcaataaatg aatcaattaa cacatggtag cattaatata 300 ggagaacatt tatacaggga ctgtttggaa ccgattctgc takctaggcc ttaaac 356 <210> 89 <211> 252 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 89 gtttaaggcc tagctagcag aatcgcttgt tgcaatagaa tcgtcactga ttatatttct 60 gtcacgtcca ctataattta ttattattat catcatcatc atcattatca tcattattag 120 tattcttatg ttctttcagt aggatgagga ttcaaagaaa ctaattaaca atatagcgaa 180 gagtataata ctaaatagta gaaaggaact gtaaacttac ctagaagtga ttctgctagc 240 taggccttaa ac 252 <210> 90 <211> 765 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Mulberry tree <400> 90 gtttaaggcc tayaagcata atcgcttcta ggtaagttta 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Claims (10)

1. (i) 뽕나무로부터 게놈 DNA를 수득하는 단계;
   (ii) 상기 수득한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 19(서열번호 1 및 2), 28(서열번호 3 및 4), B2-3(서열번호 5 및 6), B2-26(서열번호 7 및 8), B2-28(서열번호 9 및 10), B2-42(서열번호 11 및 12), B2-48(서열번호 13 및 14) 및 B2-55(서열번호 15 및 16)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머 쌍을 사용하여 효소중합반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및,
   (iii) 상기 반응 산물로부터 대립 유전자를 파악하여 뽕나무를 동정하는 단계를 포함하는 뽕나무의 동정방법.
   
2. 제1항에 있어서, 단계 (iii)은 반응 산물의 크기, 대립 유전자의 조합 및 개수를 파악함으로써, 뽕나무를 동정하는 것을 특징으로 하는 뽕나무 동정방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 게놈 DNA에 존재하는 마이크로새틀라이트 DNA(Microsatellite DNA)에 혼성화되어 증폭되는 것을 특징으로 하는 뽕나무 동정방법.
   
4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 프라이머는 효소, 형광물질, 리간드(ligand), 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스(Redox) 분자 및 방사선 동위원소로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 표지용 물질로 표지되어 있는 것을 특징으로 하는 뽕나무 동정방법.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 효소는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제 및 β-라타마제로 구성된 군으로부터 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 뽕나무 동정방법.
   
6. 제4항에 있어서, 상기 형광물질은 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드 및 플루오레스카민으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 뽕나무 동정방법.
   
7. 제4항에 있어서, 상기 레독스 분자는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논 및 하이드로퀴논로 구성된 군으로부터 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 뽕나무 동정방법.
   
8. 제4항에 있어서, 상기 방사선 동위원소는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I 및 ¹⁸⁶Re으로 구성된 군으로부터 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 뽕나무 동정방법.
   
9. 19(서열번호 1 및 2), 28(서열번호 3 및 4), B2-3(서열번호 5 및 6), B2-26(서열번호 7 및 8), B2-28(서열번호 9 및 10), B2-42(서열번호 11 및 12), B2-48(서열번호 13 및 14) 및 B2-55(서열번호 15 및 16)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머 쌍과, 폴리뉴클레오타이드 주형, DNA 중합효소, dNTPs 및 완충용액을 포함하는 뽕나무 동정용 PCR 키트.
   
10. 19(서열번호 1 및 2), 28(서열번호 3 및 4), B2-3(서열번호 5 및 6), B2-26(서열번호 7 및 8), B2-28(서열번호 9 및 10), B2-42(서열번호 11 및 12), B2-48(서열번호 13 및 14) 및 B2-55(서열번호 15 및 16)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머 쌍으로 구성된 뽕나무 동정용 프라이머 조성물.

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