CN107868819A - 氟尿嘧啶疗效相关基因基因多态性检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种药物氟尿嘧啶疗效相关基因（OPRT、MTHFR和DPYD）基因多态性检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括PCR缓冲液，特异性ARMS检测引物，质控引物。本发明还提供了一种氟尿嘧啶疗效相关基因（OPRT、MTHFR和DPYD）基因多态性检测方法。本发明方法可以快速准确地检测氟尿嘧啶疗效相关基因（OPRT、MTHFR和DPYD）基因多态性，具有灵敏度高，特异性强，方法简单，结果准确等特点。

Description

氟尿嘧啶疗效相关基因基因多态性检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术及医学领域，特别是涉及药物紫杉醇疗效相关基因OPRT，MTHFR和DPYD基因多态性检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
虽然5-FU的抗肿瘤疗效已得到广泛肯定，但在5-FU临床应用中，时常出现治疗有效率较低和副作用大的问题。科学研究证明氟尿嘧啶类药物的疗效和副作用存在显著的个体差异：患者本身遗传特征的差异是主要的原因之一。
OPRT的主要作用基因定位于人类染色体3q13，主要存在于肝脏中，是一个关于嘌呤、嘧啶和核苷酸合成的酶。OPRT基因的高表达能增加肿瘤组织对5’Fu化疗的敏感性，OPRT的基因表达和酶活性都与基于5’FU的化疗敏感性密切相关。OPRT存在Gly213Ala基因多态性，携带Ala/Ala(C/C)纯合等位基因型的患者比携带Ala/Gly(G/C)和Gly/Gly(G/G)等位基因患者对5-FU的毒性反应更明显，因此不适合进行氟尿嘧啶药物治疗。
二氢嘧啶脱氢酶(DPD)是5-Fu分解代谢和清除的限速酶，DPD活性降低或缺乏时，5-Fu的系统清除率降低。在此状态下用5-Fu治疗，可引发严重的毒性反应；酶活性越低，毒性反应程度愈高。研究发现其药理学基础是-二氢嘧啶脱氢酶基因(DPYD)遗传缺失的不同。在DPYD多态性位点中，有杂合型，野生型和变异型突变；且毒副作用发生率从高到低依次均为突变型、杂合型和野生型。可取上述位点指导应用5-FU个体化治疗。二氢嘧啶脱氢酶基因单核苷酸多态性检测对预测5-FU化疗的毒副反应有一定的指导意义，从而指导个体化用药。
MTHFR(亚甲基四氢叶酸还原酶)是胞内叶酸代谢的关键酶，MTHFR基因存在功能性SNP，即C677T(突变型患者对5-FU敏感性较高)。
关于基因突变检测方法有很多，各国学者对此都进行了大量研究。己经报道的方法包括直接测序法、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP、Scorpions ARMS、TaqMan PCR、ME-PCR等。这些方法各有优缺点，其中在临床和科研中较为常用的方法为直接测序法以及ARMS(Amplification refractory mutation system,扩增阻滞突变系统)法。
直接测序法检测能力有限，其检测灵敏度约20％左右，而且步骤复杂，整个检测过程涉及PCR-电泳-测序-测序结果的解读等一系列的步骤，费吋费力，但是该方法的优点是能够发现一些新的未知突变。
ARMS方法是将分子信标(探针)与特异性的ARMS引物相结合创造出来的，ARMS引物3’端设计在突变位点，最后一个碱基与突变碱基配对，釆用无3’→5’外切酶活性的TaqDNA聚合酶，特异性的识别引物的3’末端，只有引物3’末端完全配对时，才能正常扩增，当引物3’末端发生错配时，不能有效的扩增。当引物与突变模板结合并延伸出相应的产物后，探针两端的荧光基团和淬灭基团分离而产生荧光。目前，市场上相关试剂盒包括QIAGEN公司和厦门艾德公司，价格昂贵。
因此，本研究釆用ARMS技术与SYBR染料相结合的方法，研发出一种拥有完全自主知识产权并且能够快速、敏感而且简便的检测氟尿嘧啶疗效相关基因(OPRT、MTHFR和DPYD)基因多态性的试剂盒。通过自己研发设计ARMS引物以及将Scorpions探针换为SYBR染料以使检测成本大大降低，这样更适合中国患者OPRT、MTHFR和DPYD基因多态性的检测。综上所述，该检测试剂盒及检测方法是一种灵敏度高，特异性强，方法简单，结果准确的氟尿嘧啶疗效相关基因(OPRT、MTHFR和DPYD)基因多态性检测方法。
发明内容：
本发明实施例的目的在于提供一种灵敏度高，特异性强，方法简单，结果准确的氟尿嘧啶疗效相关基因(OPRT、MTHFR和DPYD)基因多态性检测试剂盒及检测方法。本发明实施例是这样实现的，一种氟尿嘧啶疗效相关基因(OPRT、MTHFR和DPYD)基因多态性检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，特异性突变检测引物，质控引物。本发明还提供一种氟尿嘧啶疗效相关基因(OPRT、MTHFR和DPYD)基因多态性检测方法，包括以下步骤：(1)提供如权利要求1中所述的引物；(2)待测样品的处理和模板的提取；(3)配制荧光定量PCR反应体系；(4)利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过SYBR Green染料和扩增产物的杂交，检测反应体系的SYBR强度来判定检测结果。SYBR为检测信号，以SYBR信号达到设定的阈值所需的的循环次数Ct值作为判断标准，Ct值小于32为阳性，Ct值大于35为阴性，Ct值介于32到35之间为弱阳性。
本发明氟尿嘧啶疗效相关基因(OPRT、MTHFR和DPYD)基因多态性检测试剂盒采用SYBR染料法，建立了针对人类OPRT、MTHFR和DPYD基因多态性(如表1)的多重实时PCR检测方法。本发明经过大量试验，研究和分析成功筛选出能够用于快速、灵敏、有效的检测氟尿嘧啶疗效相关基因(OPRT、MTHFR和DPYD)基因多态性的引物组合，并利用这些引物开发出具有这样的优点的用于检测氟尿嘧啶疗效相关基因(OPRT、MTHFR和DPYD)基因多态性的方法和试剂盒。本发明的检测试剂盒及检测方法具有灵敏度高，特异性强，方法简单，结果准确等特点，因此本发明具有实质性的技术效果，便与推广。
表1：OPRT、MTHFR和DPYD基因多态性形式
所述的特异性引物见下表2/3/4。
表2：OPRT基因多态性的检测引物
表3：MTHFR基因多态性的检测引物
表4：DRYD基因多态性的检测引物
本发明涉及的检测人类OPRT、MTHFR和DPYD基因多态性的荧光定量PCR方法不包括对待测样本的处理和模板提取的步骤，但对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品和来自血浆的样品所获得的片段DNA依然具有与新鲜组织样本DNA相同的扩增和检测能力。
本发明的检测试剂盒可在50ng野生型基因组DNA背景下准确检出1％的突变DNA，且针对性设计不同突变位点的特异性引物，使用荧光定量PCR进行检测，检测过程均为闭管反应，大大降低污染。
附图说明：
图1为本发明基因多态性检测试剂盒检测OPRT(638)样品的扩增曲线图。
图2为本发明基因多态性检测试剂盒检测MTHFR(677)样品的扩增曲线图。
图3为本发明基因多态性检测试剂盒检测DPYD(1627)样品的扩增曲线图。
具体实施方式：
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1
1.样本处理和核酸提取
利用商品化的DNA提取试剂盒处理样本，具体操作参见试剂盒说明书，所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其DNA OD260/OD280的值应在1.8～2.0，浓度应在5～50ng/μL之间，样本DNA质量不合格者不得用于检测，建议低于5ng/μL者重新取切片进行核酸提取，高于50ng/μL者予以适当稀释至规定的浓度范围，提取完的DNA建议立即进行检测，否则请于-20℃以下保存，保存时间不要超过6个月。试剂盒质控品使用前室温融化，涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒待用。
2.试剂配置
2.1配置说明：检测反应设置阴性质控品和阳性质控品。
2.2配置过程
提前30分钟将试剂取出，室温融化，涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒待用。确定反应数N，N＝待检样本数(n)+质控品数(2)+1。计算加到反应混合物中的各个试剂的量，计算如下表5：
表5：PCR反应体系配置表。
试剂 PCR反应液P 引物探针混合液 纯化水
反应液A(μL) 12.5*N 6.5*N 4.0*N
外控反应液B(μL) 12.5*N 6.5*N 4.0*N
取2个灭菌离心管配置上述2个反应体系，试剂全部加入后涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒。然后将上述混合液23μL/管分装至PCR反应管中(无菌和RNase-Free)。
3.加样
表6：样品及质控品上样表。
注：STD代表阳性质控品；NTC代表阴性质控品。
根据表5提示的上样比例，将已处理样本、阳性质控品P1和阴性质控品P2加入反应管中，盖紧管盖(避免气泡产生)，2000rpm离心15秒将管壁上的液体全部甩至管底，然后立即进行PCR扩增反应。
4.PCR扩增程序设置
表7：PCR反应程序的设定。
5.检验结果的解读
利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过SYBR Green染料和扩增产物的杂交，检测反应体系的SYBR强度来判定检测结果。SYBR为检测信号，以SYBR信号达到设定的阈值所需的的循环次数Ct值作为判断标准，Ct值小于32为阳性，Ct值大于35为阴性，Ct值介于32到35之间为弱阳性。

Claims (6)

1.一种氟尿嘧啶疗效相关基因(OPRT、MTHFR和DPYD)基因多态性检测试剂盒，该试剂盒用于检测基因多态性的引物，各引物如下所示：
2.如权利1要求所述的氟尿嘧啶疗效相关基因(OPRT、MTHFR和DPYD)基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液包括3’→5’外切酶活性高保真Taq酶，1.0-5.0mM的MgCl2，1.0-5.0mM的dNTPs，即dATP，dUTP，dGTP，dCTP各1.0-5.0mM，SYBR Green I。
3.一种氟尿嘧啶疗效相关基因(OPRT、MTHFR和DPYD)基因多态性检测方法，包括以下步骤：
(1)提供如权利要求1中所述的引物；
(2)待测样品的处理和模板的提取；
(3)配制荧光定量PCR反应体系；
(4)利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过SYBR Green染料和扩增产物的杂交，检测反应体系的SYBR强度来判定检测结果。SYBR为检测信号，以SYBR信号达到设定的阈值所需的的循环次数Ct值作为判断标准，Ct值小于32为阳性，Ct值大于35为阴性，Ct值介于32到35之间为弱阳性。
4.如权利3所述的一种检测人类OPRT、MTHFR和DPYD基因多态性的方法，其特征在于：步骤(3)所述的待测样品包括手术切除的新鲜病理组织，甲醛固定石蜡包埋的病理组织，石蜡切片，全血，血浆，血清，胸腔积液。
5.如权利3要求所述的一种氟尿嘧啶疗效相关基因(OPRT、MTHFR和DPYD)基因多态性检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中的PCR体系中各组分终浓度及含量如下：
6.如权利3要求所述的一种氟尿嘧啶疗效相关基因(OPRT、MTHFR和DPYD)基因多态性检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中的PCR反应条件为：95℃10分钟，40个循环：95℃10秒，60℃15秒。
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