CN105274097A

CN105274097A - 一种cyp2c192和cyp2c193检测引物及其检测体系

Info

Publication number: CN105274097A
Application number: CN201510661485.3A
Authority: CN
Inventors: 汪大为
Original assignee: Beijing Jinqi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Jinqi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-10-14
Filing date: 2015-10-14
Publication date: 2016-01-27

Abstract

本发明提供一种CYP2C19*2和CYP2C19*3检测引物及其检测体系，属于分子生物学及核酸检测技术领域。本发明在ARMS-PCR的基础上采用双向扩增阻滞突变系统PCR(Bi-Amplification？Refractory？Mutation？System？PCR，BI-ARMS-PCR)技术，设计出CYP2C19*2和CYP2C19*3检测引物及其检测体系。通过读取电泳的条带个数及大小来判定待测样本中的rs4244285和rs4986893位点的碱基，从而判断被测试者是否携带CYP3A5*2和/或CYP3A5*2，指导被测试者用药。

Description

一种CYP2C19*2和CYP2C19*3检测引物及其检测体系

技术领域

本发明涉及分子生物学及核酸检测技术领域，尤其涉及一种CYP2C19*2和CYP2C19*3检测引物及其检测体系。

背景技术

在人体中，CYP2C19参与氯吡格雷、S-美芬妥英、奥美拉唑、伏立康唑、安定、去甲安定等药物的代谢。CYP2C19遗传变异可导致酶活性的个体差异，使人群出现超快代谢者(ultrarapidmetabolizer，UM)、快代谢者(extensivemetabolizer，EM)、中间代谢者(intermediatemetabolizer，IM)和慢代谢者(poormetabolizer，PM)4种表型。CYP2C19*2(rs4244285，c.681G>A)和CYP2C19*3(rs4986893，c.636G>A)是中国人群中存在的2种导致CYP2C19酶缺陷的主要等位基因。EM个体只携带CYP2C19*1等位基因，IM个体携带CYP2C19*2或CYP2C19*3杂合子基因型；PM个体携带CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3和CYP2C19*3/*3基因型。

氯吡格雷是一种抗血小板药物，广泛用于急性冠脉综合征、缺血性脑血栓、闭塞性脉管炎和动脉硬化及血栓栓塞引起的并发症。心脏支架手术后的患者需长期服用氯吡格雷以防止支架内再梗。氯吡格雷主要经CYP2C19代谢活化后发挥抗血小板效应。CYP2C19PM患者应用常规剂量的氯吡格雷后体内活性代谢物生产减少，对血小板的抑制作用下降。美国FDA和美国心脏病学会建议，对于CYP2C19PM患者需考虑改变治疗方案。

阿米替林为三环类抗抑郁药，主要用于焦虑性或激动性抑郁症的治疗。阿米替林在体内主要经CYP2C19代谢为活性代谢产物去甲替林。CYP2C19活性的高低可通过影响血液中阿米替林与去甲替林的浓度比，影响阿米替林的疗效和不良反应的产生。

伏立康唑是一种广谱三唑类抗真菌药，CYP2C19是其主要代谢酶之一。CYP2C19EM与PM个体间伏立康唑的血液浓度存在显著差异，PM个体在应用常规剂量药物时可能出现毒副反应，建议减少用药剂量；EM和IM个体可给予常规剂量。在常规剂量治疗时，若EM个体出现毒副反应或PM疗效不佳，均应考虑更换药物。FDA批准的药物说明书中指出应用伏立康唑前需检测CYP2C19基因型，以确保用药安全。

由上述可见，CYP2C19的活性在在临床指导用药上具有非常广泛的作用，因此，CYP2C19*2和CYP2C19*3的检测也是非常重要。目前用于检测这两种亚型的方法主要是直接测序法、Taqman荧光PCR法以及芯片法等等，这些方法均在不同方面展现出了自己的优势，但是也都普遍存在检测仪器及配套试剂耗材购买成本高昂，检测周期长、操作繁琐且假阳性率时有出现的问题。因此，发明并构建一套价格低廉，使用操作简便且利于临床检验大范围普及的检测引物及检测体系就显得十分重要。

突变扩增系统(amplificationrefractorymutationsystem,ARMS)又称等位基因特异性扩增法(allelespecificamplification,ASA)，是Newton等首先建立用来检测已知突变的方法。其基本原理是，如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计2条引物，其3′端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。此法已用于多种疾病的点突变的检测。因此，使用ARMS技术与PCR技术相配合，利用二者的优势检测CYP2C19基因型、指导临床用药很有必要。

发明内容

本发明要解决的问题是现有的检测CYP2C19基因型的方法成本较高，操作复杂，需要的测试时间长。

本发明的第一个目的在于提供一种CYP2C19*2和CYP2C19*3检测引物，其特征在于：包括以下引物：

5′-ATTACAACCAGAGCTTGGCA-3′(SEQIDNo.1，以下简称P2)

5′-ACTGGAAGCTGCAGAACAGA-3′(SEQIDNo.2，以下简称Q2)

5′-CCCACTATCATTGATTATTTCACG-3′(SEQIDNo.3，以下简称F2)

5′-TTAAGTAATTTGTTATGGGTTACT-3′(SEQIDNo.4，以下简称R2)

5′-ACCAGCTAGGCTGTAATTGTTA-3′(SEQIDNo.5，以下简称P3)

5′-TGGGCTTAGAAGCCTGATCTAT-3′(SEQIDNo.6，以下简称Q3)

5′-GATTGTAAGCACCCCCGGA-3′(SEQIDNo.7，以下简称F3)

5′-ACTTGGCCTTACCTGGCTC-3′(SEQIDNo.8，以下简称R3)。

进一步地，所述P2、Q2、F2和R2为检测CYP2C19*2的引物，P3、Q3、F3和R3为检测CYP2C19*3的引物。

其中，引物P2和Q2是针对CYP2C19设计的特异引物，P2、Q2的产物为一长度为537bp的核酸片段。引物F和R是针对rs4244285位点的等位基因设计的特异性引物，F2对应G等位基因，R2对应A等位基因。P3和Q3是针对CYP2C19设计的特异引物，P3Q3的产物为一长度为578bp的核酸片段。引物F和R是针对rs4986893位点的等位基因设计的特异性引物，F3对应A等位基因，R3对应G等位基因。为进一步降低可能的非特异性扩增，本发明又人为地在F2和R2引物3′端倒数第三位引进入一个突变碱基，在F3和R3引物3′端倒数第三位引进入一个突变碱基。

本发明的第二个目的在于提供一种CYP2C19*2和CYP2C19*3的检测体系，包括上述的引物，还包括PCR缓冲液，Taq酶和dNTP。

进一步地，所述检测体系包括检验CYP2C19*2的体系A和检验CYP2C19*3的体系B。所述体系A包括P2、Q2、F2、R2、缓冲液，Taq酶和dNTP。所述体系B包括P3、Q3、F3、R3、缓冲液，Taq酶和dNTP。

优选地，所述体系A与体系B中各引物的浓度相同，均为200μM。

优选地，所述体系A与体系B中dNTP浓度相同，为100μM。

优选地，所述体系A与体系B中Taq酶的浓度相同，为50U/mL。

本发明的第三个目的在于提供一种CYP2C19*2和CYP2C19*3的检测方法，其使用上述的检测体系，包括以下步骤：

(1)PCR反应

以待检测的核酸为模板，分别加入到体系A和体系B中，对CYP2C19位点进行PCR处理，得到的产物分别记为PA和PB；

(2)电泳

将步骤(1)中得到的PA和PB分别进行凝胶电泳，将得到的电泳图与相应的标准进行对照。

优选地，所述步骤(1)中体系A和体系B进行PCR处理的条件相同，为：(a)95℃下3min；

(b)95℃下15s，55℃下15s，72℃下20s，循环35次。

优选地，所述步骤(1)中，模板在体系A和体系B中的浓度相同，为0.8～4ng/μL。

优选地，步骤(2)中PA和PB进行电泳的条件相同，为：取步骤(1)中得到PA和PB各5μL，分别用2％的琼脂糖凝胶经染色后在6v/cm电压下电泳30min。

本发明在ARMS-PCR的基础上采用双向扩增阻滞突变系统PCR(Bi-AmplificationRefractoryMutationSystemPCR，BI-ARMS-PCR)技术，设计出检验CYP2C19*2和CYP2C19*3的引物及体系。分别针对rs4244285的两个等位基因和rs4986893的两个等位基因设计特异性引物，通过读取电泳的条带个数及大小来判定待测样本中的rs4244285和rs4986893位点的碱基，从而判断被测试者是否携带CYP3A5*2和/或CYP3A5*2，指导被测试者用药。

本发明具有的优点和积极效果是：

(1)本发明提供的试剂盒检测成本低：无需DNA测序仪，仅需普通热循环仪和普通的琼脂糖凝胶电泳设备即可开展检测，有利于推广至地方医院检测或者普通实验室进行科研工作。

(2)本试剂盒操作简便、测试时间短无需PCR产物纯化、测序引物设计、测序反应PCR的纯化、测序反应化学类型选择等步骤，只需要PCR和电泳的这两个操作步骤，简便易行。现有的基因测序法最快也要八个小时，而本发明从DNA提取到基因分型完成，仅需2个小时的时间，较好地缩短了检测时间。

附图说明

图1是检测样本1-4经检测体系APCR得到的产物(PA₁-PA₄)的电泳图。

图2为检测样本1-4经检测体系BPCR得到的产物(PB₁-PB₄)的电泳图。

图3-图6分别是检测样本1-4rs4244285位点的DNA测序图。

图7是检测样本1-3rs4986893位点的DNA测序图(由上至下依次为1、2、3)。

图8是检测样本4rs4986893位点的DNA测序图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的描述。

一种CYP2C19*2和CYP2C19*3检测引物，其特征在于：包括以下引物：

5′-ATTACAACCAGAGCTTGGCA-3′(SEQIDNo.1，以下简称P2)

5′-ACTGGAAGCTGCAGAACAGA-3′(SEQIDNo.2，以下简称Q2)

5′-CCCACTATCATTGATTATTTCACG-3′(SEQIDNo.3，以下简称F2)

5′-TTAAGTAATTTGTTATGGGTTACT-3′(SEQIDNo.4，以下简称R2)

5′-ACCAGCTAGGCTGTAATTGTTA-3′(SEQIDNo.5，以下简称P3)

5′-TGGGCTTAGAAGCCTGATCTAT-3′(SEQIDNo.6，以下简称Q3)

5′-GATTGTAAGCACCCCCGGA-3′(SEQIDNo.7，以下简称F3)

5′-ACTTGGCCTTACCTGGCTC-3′(SEQIDNo.8，以下简称R3)。

其中P2、Q2、F2和R2为检测CYP2C19*2的引物，P3、Q3、F3和R3为检测CYP2C19*3的引物。

一种CYP2C19*2和CYP2C19*3的检测体系，包括上述的引物，还包括缓冲液，Taq酶和dNTP。所述检测体系包括检验CYP2C19*2的体系A和检验CYP2C19*3的体系B。体系A包括P2、Q2、F2、R2、缓冲液，Taq酶和dNTP。体系B包括P3、Q3、F3、R3、缓冲液，Taq酶和dNTP。

体系A和体系B中各组分的浓度可按现有的进行PCR所需的浓度进行。作为一种优选方案，本实施例中，体系A和体系B中：各引物的浓度相同，均为200uM；dNTP的浓度相同为100uM；Taq酶的浓度相同，为50U/mL。缓冲液可使用常用的与Taq酶配合使用的缓冲液。

使用本检测体系，使用本发明提供的CYP2C19*2和CYP2C19*3的检测方法检测时，包括以下步骤：

1核酸提取：

抽取4个人1ml静脉血后，以EDTA抗凝管保存，每管取200ul血液，用全式金或者其它公司的DNA提取试剂盒，参照试剂盒说明书提取全基因组DNA作为检测的模板，记为T，依次编号为T₁、T₂、T₃、T₄。

2.PCR反应

以T_n为模板，分别加入体系A和体系B中作为模板，进行PCR反应，得到产物分别为PA_n和PB_n。PCR反应的条件可按照现有的常用条件进行。作为一种优选方案，本实施例中，采用以下条件：

(1)预变性：温度95℃时间3min。

(2)扩增循环：(2-1)变性：温度95℃，时间15s；

(2-2)退火：温度55℃，时间15s；

(2-3)延伸：温度72℃，时间20s；

循环35次。

进行PCR反应时，检测体系中各组分的浓度和检测体系的总量可按常规PCR反应所需进行。本实施例中，体系A和体系B均为25μL，成分和含量分别如表1和表2所示：

表1体系A

成分	规格或含量
		T_n	20-100ng
P2	200μM
		Q2	200μM
F2	200μM
		R2	200μM
dNTP	100μM
		Taq酶	1.25U
缓冲液	1X
		超纯水	余量

表2体系B

成分	规格或含量
		T_n	20-100ng
P3	200μM
		Q3	200μM
F3	200μM
		R3	200μM
dNTP	100μM
		Taq酶	1.25U
缓冲液	1X
		超纯水	余量

3.凝胶电泳

将步骤2得到的PA_n和PB_n，分别取5μl，用2％的琼脂糖凝胶(GOODVIEW染色)在6v/cm电压下电泳30min，观察结果。图1为检测样本1-4经体系APCR产物的的电泳图，图2为检测样本中1-4经体系BPCR产物的的电泳图。图1和图2中最左为DNAladderMarker，从上致下依次为2400bp、2200bp、2000bp、1800bp、1600bp、1400bp、1200bp、1000bp、800bp、600bp、400bp和200bp。

已知的标准电泳结果分析如表3所示：

表3

将图1得到的电泳图与表2中的标准对比，检测的5个样本CYP2C19基因型的结果如表4所示：

表4

为了验证本试剂盒和检测方法的准确性，将检测样本1-4进行基因测序，其结果如图3-图8所示。

将表4中得到的结果与图3-图8的DNA测序结果对比可知，本检测体系测试的结果与DNA测序结果吻合率100％。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。

Claims

1.一种CYP2C19*2和CYP2C19*3检测引物，其特征在于：包括以下引物：

5′-ATTACAACCAGAGCTTGGCA-3′(SEQIDNo.1，以下简称P2)

5′-ACTGGAAGCTGCAGAACAGA-3′(SEQIDNo.2，以下简称Q2)

5′-CCCACTATCATTGATTATTTCACG-3′(SEQIDNo.3，以下简称F2)

5′-TTAAGTAATTTGTTATGGGTTACT-3′(SEQIDNo.4，以下简称R2)

5′-ACCAGCTAGGCTGTAATTGTTA-3′(SEQIDNo.5，以下简称P3)

5′-TGGGCTTAGAAGCCTGATCTAT-3′(SEQIDNo.6，以下简称Q3)

5′-GATTGTAAGCACCCCCGGA-3′(SEQIDNo.7，以下简称F3)

5′-ACTTGGCCTTACCTGGCTC-3′(SEQIDNo.8，以下简称R3)。

2.根据权利要求1所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3检测引物，其特征在于：所述P2、Q2、F2和R2为检测CYP2C19*2的引物，P3、Q3、F3和R3为检测CYP2C19*3的引物。

3.一种CYP2C19*2和CYP2C19*3的检测体系，包括权利要求1或2所述的引物，其特征在于：还包括缓冲液，Taq酶和dNTP。

4.根据权利要求3所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3的检测体系，其特征在于：所述检测体系包括检验CYP2C19*2的体系A和检验CYP2C19*3的体系B；

所述体系A包括P2、Q2、F2、R2、缓冲液，Taq酶和dNTP；

所述体系B包括P3、Q3、F3、R3、缓冲液，Taq酶和dNTP。

5.根据权利要求4所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3的检测体系，其特征在于：所述体系A与体系B中各引物的浓度相同，均为200μM。

6.根据权利要求4所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3的检测体系，其特征在于：所述体系A与体系B中dNTP的浓度相同，均为为100μM。

7.根据权利要求4所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3的检测体系，其特征在于：所述体系A与体系B中Taq酶的浓度相同，均为50U/mL。

8.一种CYP2C19*2和CYP2C19*3的检测方法，其特征在于：使用权利要求4-7任一所述的检测体系，包括以下步骤：

(1)PCR反应

(2)电泳

9.根据权利要求6所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中体系A和体系B进行PCR处理的条件相同，为：

(a)95℃下3min；

(b)95℃下15s，55℃下15s，72℃下20s，循环35次。

10.根据权利要求8或9所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中，模板在体系A和体系B中的浓度相同，为0.8～4ng/μL。

11.根据权利要求8或9所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3的检测方法，其特征在于：步骤(2)中PA和PB进行电泳的条件相同，为：取步骤(1)中得到PA和PB各5μL，分别用2％的琼脂糖凝胶经染色后在6v/cm电压下电泳30min。