CN110218777A - Pcr预混液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种PCR预混液，包括以下终浓度的组分：MgCl2 2～5mM，KCl 50～100mM，pH为8.3的Tris‑HCl 10～30mM，BSA 0.8～4mg/ml，dNTP 150～250nM，热启动Taq酶0.05～0.2u/ul，体积分数为0.25～1％的甘油，体积分数为0.5～1％的PEG20000，体积分数为0.5～1％的PEG5000，体积分数为0.1～0.5％的PEG‑PPG‑PEG，鱼精DNA 0.5～5ng/ul，甜菜碱0.3～2.5M，体积分数为1.5～3％的DMSO。本发明具有微滴均一性好，热稳定性好，扩增准确，Taq酶活性保持好的有益效果。

Description

PCR预混液
技术领域
本发明涉及生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种PCR预混液。
背景技术
基于数字微滴的基因测序与分子检测技术，越来越广泛的应用于临床疾病的早期诊断及精准靶向治疗。其中以微滴式数字PCR为代表的基因检测技术近年来逐渐受到重视。相对传统的定量PCR技术，数字PCR技术具有灵敏度高、特异性强、样本量少、成本低等特点，是一种高灵敏度核酸检测和定量方法。
微滴式数字PCR系统结合了油包水乳化微滴技术与微流体技术，将每个样品生成数万个均一的纳升级微滴，目的片段和背景序列在微滴中随机分布，每个微滴都是一个独立的PCR反应器，完成PCR扩增后，微滴分析仪对微滴逐个进行荧光检测。其中，微滴的均一性、热稳定性、生物相容性等以及高稳定的PCR扩增试剂是保证检测灵敏度和特异性的关键。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种PCR预混液，形成的微滴均一性好，热稳定性好，扩增准确，Taq酶活性保持好，本发明的预混液适用于探针法，为数字PCR仪器提供基础通用型试剂。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种PCR预混液，包括以下终浓度的组分：MgCl2 2～5mM，KCl 50～100mM，pH为8.3的Tris-HCl 10～30mM，BSA 0.8～4mg/ml，dNTP 150～250nM，热启动Taq酶0.05～0.2u/ul，体积分数为0.25～1％的甘油，体积分数为0.5～1％的PEG20000，体积分数为0.5～1％的PEG5000，体积分数为0.1～0.5％的PEG-PPG-PEG，鱼精DNA 0.5～5ng/ul，甜菜碱0.3～2.5M，体积分数为1.5～3％的DMSO，其中，PEG-PPG-PEG的平均分子量为5800。
优选的是，还包括：ω-3脂肪酸0.2ng/ul，大豆甾醇A 0.1ng/ul。
优选的是，还包括ω-3脂肪酸和大豆甾醇A的加入方法，具体为：将MgCl2，KCl，Tris-HCl，BSA，dNTP，热启动Taq酶，甘油，PEG20000，PEG5000，PEG-PPG-PEG，鱼精DNA，甜菜碱，DMSO制得混合液后，置于0～10℃的环境中，静置30min，加入ω-3脂肪酸，第一次超声处理，混合均匀，然后再置于35℃环境中，静置30min，加入大豆甾醇，第二次超声处理，混合均匀，即得所述PCR预混液。
优选的是，第一次超声处理的频率为80kHz，超声时间30min，超声温度为10℃，第二次超声处理的频率为40kHz，超声时间20min超声温度为35℃。
优选的是，还包括：ω-6脂肪酸0.1ng/ul。
优选的是，还包括ω-6脂肪酸的加入方法，具体为：ω-6脂肪酸与ω-3脂肪酸一同加入混合液中。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明为预混试剂形式，微滴PCR反应液配制时，只需加入模板、引物、探针、灭菌ddH2O便可进行微滴PCR反应，操作简单方便。
第二、本发明的预混液，在微滴生成时可保证液滴形态稳定，PCR热循环后依旧保持液滴形态稳定，破裂融合少。
第三、预混液测得的模板浓度具有较好的一致性，无论是投入高、中、低浓度的模板量比值均能保持在90％左右。
第四、预混液对噬菌体DNA模板浓度进行检测的线性范围为15-5000个/ul，可以与Bio-Rad试剂媲美。
第五、反复冷冻解冻后，预混液中热启动Taq酶的活性的稳定性好。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为实施例3制备的预混液与伯乐生成油生成的微滴状态图；
图2为实施例4制备的预混液与伯乐生成油生成的微滴状态图；
图3为实施例3制备的预混液与伯乐生成油生成的微滴经热循环后的状态图；
图4为实施例4制备的预混液与伯乐生成油生成的微滴经热循环后的状态图；
图5为Bio-Rad试剂线性范围检测结果与自制预混液线性范围检测结果对比得到线性回归方程；
图6为Bio-Rad试剂线性范围检测结果图；
图7为实施例3制备的预混液线性范围检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
PCR预混液，将MgCl2，KCl，Tris-HCl，BSA，dNTP，热启动Taq酶，甘油，PEG20000，PEG5000，PEG-PPG-PEG，鱼精DNA，甜菜碱，DMSO制得混合液，使混合液中各组分的的终浓度为：
MgCl2 2mM，KCl 50mM，pH为8.3的Tris-HCl 10mM，BSA 0.8mg/ml，dNTP 150nM，热启动Taq酶0.05u/ul，体积分数为0.25％的甘油，体积分数为0.5％的PEG20000，体积分数为0.5％的PEG5000，体积分数为0.1％的PEG-PPG-PEG，鱼精DNA 0.5ng/ul，甜菜碱0.3M，体积分数为1.5％的DMSO；
其中，PEG-PPG-PEG的平均分子量为5800。
<实施例2>
PCR预混液，将MgCl2，KCl，Tris-HCl，BSA，dNTP，热启动Taq酶，甘油，PEG20000，PEG5000，PEG-PPG-PEG，鱼精DNA，甜菜碱，DMSO制得混合液，使混合液中各组分的的终浓度为：
MgCl2 5mM，KCl 100mM，pH为8.3的Tris-HCl 30mM，BSA 4mg/ml，dNTP 250nM，热启动Taq酶0.2u/ul，体积分数为1％的甘油，体积分数为1％的PEG20000，体积分数为1％的PEG5000，体积分数为0.5％的PEG-PPG-PEG，鱼精DNA 5ng/ul，甜菜碱2.5M，体积分数为3％的DMSO；
其中，PEG-PPG-PEG的平均分子量为5800。
<实施例3>
PCR预混液，将MgCl2，KCl，Tris-HCl，BSA，dNTP，热启动Taq酶，甘油，PEG20000，PEG5000，PEG-PPG-PEG，鱼精DNA，甜菜碱，DMSO制得混合液，使混合液中各组分的的终浓度为：
MgCl2 3.5mM，KCl 75mM，pH为8.3的Tris-HCl 20mM，BSA 2.5mg/ml，dNTP 200nM，热启动Taq酶0.1u/ul，体积分数为0.6％的甘油，体积分数为0.7％的PEG20000，体积分数为0.7％的PEG5000，体积分数为0.3％的PEG-PPG-PEG，鱼精DNA 3ng/ul，甜菜碱1M，体积分数为2％的DMSO；
其中，PEG-PPG-PEG的平均分子量为5800。
<实施例4>
PCR预混液，将MgCl2，KCl，Tris-HCl，BSA，dNTP，热启动Taq酶，甘油，PEG20000，PEG5000，PEG-PPG-PEG，鱼精DNA，甜菜碱，DMSO制得混合液，置于0～10℃的环境中，静置30min，加入ω-3脂肪酸，第一次超声处理，混合均匀，然后再置于35℃环境中，静置30min，加入大豆甾醇，第二次超声处理，混合均匀：
使各组分终浓度为：MgCl2 3.5mM，KCl 75mM，pH为8.3的Tris-HCl 20mM，BSA2.5mg/ml，dNTP 200nM，热启动Taq酶0.1u/ul，体积分数为0.6％的甘油，体积分数为0.7％的PEG20000，体积分数为0.7％的PEG5000，体积分数为0.3％的PEG-PPG-PEG，鱼精DNA3ng/ul，甜菜碱1M，体积分数为2％的DMSO，ω-3脂肪酸0.2ng/ul，大豆甾醇A 0.1ng/ul；
其中，PEG-PPG-PEG的平均分子量为5800；
第一次超声处理的频率为80kHz，超声时间30min，超声温度为10℃，第二次超声处理的频率为40kHz，超声时间20min超声温度为35℃。
<实施例5>
PCR预混液，将MgCl2，KCl，Tris-HCl，BSA，dNTP，热启动Taq酶，甘油，PEG20000，PEG5000，PEG-PPG-PEG，鱼精DNA，甜菜碱，DMSO制得混合液，置于0～10℃的环境中，静置30min，加入ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸，第一次超声处理，混合均匀，然后再置于35℃环境中，静置30min，加入大豆甾醇，第二次超声处理，混合均匀：
使各组分终浓度为：MgCl2 3.5mM，KCl 75mM，pH为8.3的Tris-HCl 20mM，BSA2.5mg/ml，dNTP 200nM，热启动Taq酶0.1u/ul，体积分数为0.6％的甘油，体积分数为0.7％的PEG20000，体积分数为0.7％的PEG5000，体积分数为0.3％的PEG-PPG-PEG，鱼精DNA3ng/ul，甜菜碱1M，体积分数为2％的DMSO，ω-3脂肪酸0.2ng/ul，ω-6脂肪酸0.1ng/ul，大豆甾醇A0.1ng/ul；
其中，PEG-PPG-PEG的平均分子量为5800；
第一次超声处理的频率为80kHz，超声时间30min，超声温度为10℃，第二次超声处理的频率为40kHz，超声时间20min超声温度为35℃。
<应用试验>
实验材料：
噬菌体λDNA模板(Fermentas)，引物探针(上海生工)；探针(thermo合成)QX200微滴式数字PCR系统(Bio-Rad)，Master cycler nexus gradient PCR仪(Eppendorf)；实施例1～5制备的预混液，探针法微滴生成油(Bio-Rad)，微滴检测油(Bio-Rad)，微滴生成卡(Bio-Rad)。
引物序列：
λDNA-F：CCCAGCAACAGCACAACCC
λDNA-R：GCCGCAGCGTAACTATTACTAATG
探针序列：6-FAM---ACTGAGCCGTAGCCACTGTCTGTCCT--BHQ1
试验1、微滴数量与形态
将实施例3制备的预混液分别与伯乐生成油加入微滴生成卡，放置在微滴生成仪上自动生成微滴，生成后直接观察微滴形态。或者经PCR扩增后观察微滴的形态并进行记录。其中微滴的数量通过QX200进行自动统计。
图1为实施例3制备的预混液与伯乐生成油生成的微滴，具有良好的均一性；
图2为实施例4制备的预混液与伯乐生成油生成的微滴，具有良好的均一性；
图3为实施例3制备的预混液与伯乐生成油生成的微滴，热循环后，大小均一，热稳定性好；
图4为实施例4制备的预混液与伯乐生成油生成的微滴，热循环后，大小均一，热稳定性好；
由图1～4可知实施例3和4制备的预混液与伯乐生成油生成的微滴均具有良好的均一性，满足数字PCR使用正态分布的原理分析结果的要求。生成的微滴平均每孔为13751个，每个样本生成的微滴数均超过一万个，均满足数字PCR使用正态分布的原理分析结果的要求。
试验2、扩增准确性
使用高、中、低三种浓度的样本，分别采用实施例3制备的预混液和伯乐预混液扩增，热循环结束后使用QX200进行自动统计，对比检测结果的准确性。
本实验重复两次，数据列表如下：
表1
由统计结果可知，本发明预混液检测结果与伯乐预混液测得的模板浓度具有较好的一致性。
由图5可知伯乐试剂线性范围检测结果与自制预混液线性范围检测结果对比得到线性回归方程，斜率为0.9877，接近1说明两种试剂测得结果具有良好一致性，且R2值为0.9991，有良好的统计意义。在此说明的是图中伯乐试剂为采用Bio-Rad预混液制备的，自制试剂为采用实施例3制备的预混液制备的。
试验3、线性范围
使用固定模板浓度，进行2、5、10、25、50、125、250、625倍稀释后，分别使用实施例3制备的预混液和Bio-Rad预混液对模板浓度进行检测。探查自制预混液的线性范围。
图6为Bio-Rad试剂线性范围检测结果，图7为实施例3制备的预混液线性范围检测结果，由检测结果可知实施例3制备的预混液对梯度稀释模板进行检测，所得到的结果具有良好的线性，R2均大于或很接近0.99。
试验5、将实施例1～4制备的预混液和伯乐预混液置于-20℃下冷冻1h，置于25℃下静置3h，然后置于-20℃下冷冻1h，置于25℃下静置3h，然后置于-20℃下冷冻1h，置于25℃下静置3h，一共冷冻解冻3次，检测热启动Taq酶的活性，结果如下表所示：
表2
组别 酶活性比(％)
实施例1 80.8
实施例2 82.3
实施例3 83.2
实施例4 91.5
伯乐 76.4
由上表可知，在实施例1～4制备的预混液和伯乐预混液经反复冷冻解冻处理后，会对热启动Taq酶的活性造成影响，均显著下降，但是实施例4制备的预混液中热启动Taq酶的活性下降量显著低于实施例1～3制备的预混液和伯乐预混液，说明ω-3脂肪酸和大豆甾醇A相结合可以缓冲反复冷冻解冻对热启动Taq酶活性的破坏，从而保持较高的活性。
试验7、将实施例1～3和实施例5制备的预混液、伯乐预混液置于25℃下保存，检测热启动Taq酶的活性，结果如下表所示：
表3
由上表可知，在实施例1～3和实施例5制备的预混液、伯乐预混液置于25℃下保存20天，热启动Taq酶的活性都会显著下降，但是实施例5制备的预混液中热启动Taq酶的活性下降量显著低于实施例3制备的预混液和伯乐预混液，说明ω-6脂肪酸、ω-3脂肪酸、大豆甾醇A相结合可以减缓热启动Taq酶活性下降的速度。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (6)

1.PCR预混液，其特征在于，包括以下终浓度的组分：MgCl2 2～5mM，KCl 50～100mM，pH为8.3的Tris-HCl 10～30mM，BSA 0.8～4mg/ml，dNTP 150～250nM，热启动Taq酶0.05～0.2u/ul，体积分数为0.25～1％的甘油，体积分数为0.5～1％的PEG20000，体积分数为0.5～1％的PEG5000，体积分数为0.1～0.5％的PEG-PPG-PEG，鱼精DNA 0.5～5ng/ul，甜菜碱0.3～2.5M，体积分数为1.5～3％的DMSO，其中，PEG-PPG-PEG的平均分子量为5800。
2.如权利要求1所述的PCR预混液，其特征在于，还包括：ω-3脂肪酸0.2ng/ul，大豆甾醇A 0.1ng/ul。
3.如权利要求2所述的PCR预混液，其特征在于，还包括ω-3脂肪酸和大豆甾醇A的加入方法，具体为：将MgCl2，KCl，Tris-HCl，BSA，dNTP，热启动Taq酶，甘油，PEG20000，PEG5000，PEG-PPG-PEG，鱼精DNA，甜菜碱，DMSO制得混合液后，置于0～10℃的环境中，静置30min，加入ω-3脂肪酸，第一次超声处理，混合均匀，然后再置于35℃环境中，静置30min，加入大豆甾醇，第二次超声处理，混合均匀，即得所述PCR预混液。
4.如权利要求3所述的PCR预混液，其特征在于，第一次超声处理的频率为80kHz，超声时间30min，超声温度为10℃，第二次超声处理的频率为40kHz，超声时间20min超声温度为35℃。
5.如权利要求3所述的PCR预混液，其特征在于，还包括：ω-6脂肪酸0.1ng/ul。
6.如权利要求5所述的PCR预混液，其特征在于，还包括ω-6脂肪酸的加入方法，具体为：ω-6脂肪酸与ω-3脂肪酸一同加入混合液中。
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