CN109486931A - 用于华法林用药相关基因分型检测的试剂盒和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因扩增检测的技术领域，具体涉及华法林用药相关基因分型的检测试剂盒和检测方法，首创性的发现在基因扩增检测中使用纳米二氧化硅，可以显著提高基因扩增的反应效率和反应特异性，为此将其应用到华法林用药相关基因分型的检测中，解决了现有技术中华法林用药基因分型检测特异性差、检测速度慢，不能满足对大量样本的快速的、特异性高的检测的问题。

Description

用于华法林用药相关基因分型检测的试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于基因扩增检测的技术领域，具体涉及华法林用药相关基因分型的检测试剂盒和检测方法。
背景技术
华法林(warfarin)是香豆素口服抗凝药，常用于人工瓣膜置换、血栓栓塞性疾病及房颤的抗凝治疗。由于华法林治疗窗口较窄，在临床使用过程中，稳定治疗剂量在不同个体间不尽相同，若药量不足会导致血栓的形成，若药量过大则会增加出血风险。据估计，服用华法林的患者中，每年有15.2％的人发生出血副作用，其中致命性的大出血占3.5％。不同个体间华法林稳定剂量的差异可达20倍以上。药物基因学研究证明，华法林的靶酶VKORC1和代谢酶CYP2C9的基因遗传多态性是影响华法林用药剂量差异性的重要因素。因此，研究VKORC1和CYP2C9基因的单核苷酸多态性(SNP)对于华法林维持剂量影响的研究十分重要。
随着基因研究的技术手段不断进步，发展出了多种SNP基因分型检测方法。SNP基因分型方法主要有：等位基因特异性杂交、引物延伸、特异性酶切和寡核苷酸连接等。实时荧光定量PCR是目前研究基因最有效、最普及的手段，并且已用于临床诊断。因此，借助实时荧光定量PCR技术实现的Taqman探针法SNP分型检测是临床基因分型诊断的不二之选。
Taqman探针研究SNP分型的试剂已在科研领域广泛应用。ThermoFisher公司已开发出超过700万种SNP检测的试剂盒。然而，目前应用于临床SNP分型检测试剂盒不超过100种，究其原因，发现制约其发展的关键因素是特异性差、操作繁琐、检测速度慢。提高核酸检测特异性的传统方法为引物设计、探针设计或反应物比例优化。如中国专利文献CN108179097A公开的一种实时荧光定量PCR检测EB病毒C/D基因分型试剂盒，采用EB病毒通用引物和C型和D型双特异荧光探针，开发研制出用于EB病毒C/D基因型分型的检测试剂盒。上述方案利用荧光定量PCR技术，设计了C/D基因型分型的特异探针，比传统的巢式PCR结合酶切鉴定的方法更加简便，快速和准确。然而上述方案仅通过实时荧光定量PCR技术结合特异探针，对于提高基因分型特异性、检测速度仍然有限，不能满足对大量样本的快速的、特异性高的检测。
为解决上述问题，本发明在开发一种快速的、特异性高的基因扩增检测方法过程中，首创性的发现在基因扩增检测中使用纳米二氧化硅，可以显著的提高反应效率和反应特异性，基于此，本发明开发了一种用于华法林用药相关基因分型检测的试剂盒和检测方法，提高了华法林相关基因分型检测反应的灵敏度和特异性，缩短了核酸扩增信号放大所需时间，使基因分型检测更方便临床应用。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于现有技术中的华法林用药相关基因分型检测试剂盒检测时间长，特异性低，进而提供一种快速的、特异性高的用于华法林用药相关基因分型检测的试剂盒和检测方法。
为解决上述问题，本发明提出了以下的技术方案：
本发明提供了一种用于华法林用药相关基因分型检测的试剂盒，包括独立包装的核酸扩增试剂、基于华法林用药相关基因设计的引物和基于华法林个体化用药相关基因设计的荧光探针；所述核酸扩增试剂中包括纳米二氧化硅。
所述的试剂盒，所述纳米二氧化硅的粒径为50～500nm。优选的，所述纳米二氧化硅为球状。
优选的，上述的试剂盒，所述纳米二氧化硅的制备方法如下：将溶液I和溶液II混合后在100℃-120℃的温度下反应得到；所述溶液I为氨水、水、无水乙醇按照体积比(10-30)∶(0.5-2)∶(68-89.5)混合的溶液，所述溶液II为正硅酸乙酯(TEOS)与无水乙醇按照体积比(15-30)∶(70-85)混合的溶液。
优选的，所述溶液I为氨水、水、无水乙醇按照体积比20∶1∶70混合的溶液，所述溶液II为正硅酸乙酯(TEOS)与无水乙醇按照体积比15∶85混合的溶液。
进一步可选地，上述的试剂盒，所述氨水是氨含量为25-28wt％的水溶液。
所述的试剂盒，所述核酸扩增试剂中还包括DNA聚合酶、dNTPs、扩增缓冲液和非离子型表面活性剂中的至少一种。
DNA聚合酶包括但不限于常用的DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶等，所述非离子型表面活性剂包括但不限于烷基酚聚氧乙烯醚(APEO)、高碳脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO)、脂肪酸聚氧乙烯酯(AE)、脂肪酸甲酯乙氧基化物(FMEE)。
所述的试剂盒，所述核酸扩增试剂，包括如下浓度的成分：
Taq酶，100～500mg/L；
dNTPs，50～200g/L；
Tris-HCl，0.5～2mL/L；
MgCl2，10～40g/L；
KCl，5～20g/L；
(NH4)2SO4，5～40g/L；
纳米二氧化硅，20～100g/L；
Triton X-100，1～5mL/L。
所述的试剂盒，所述核酸扩增试剂，包括如下浓度的成分：
Taq酶，300mg/L；
dNTPs，100g/L；
Tris-HCl，1mL/L；
MgCl2，20g/L；
KCl，10g/L；
(NH4)2SO4，10g/L；
纳米二氧化硅，50g/L；
Triton X-100，2mL/L。
所述的试剂盒，引物或荧光探针的浓度为100～300mg/L，优选的，引物或荧光探针的浓度为200mg/L。
所述的试剂盒，所述引物或荧光探针是基于VKORC1基因的rs9923231位点和CYP2C9基因的rs1057910位点中的至少一种设计的。
所述的试剂盒，基于VKORC1基因的rs9923231位点设计的引物的核苷酸序列如SEQID NO：1-2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3-4所示；
基于CYP2C9基因的rs1057910位点设计的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5-6所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7-8所示。
所述荧光探针标记的荧光基团为FAM、FITC、HEX、JOE、VIC等中的一种，在荧光探针包括多条时，各个探针上标记的荧光基团不同。
所述的试剂盒，还包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂包括红细胞裂解液，所述细胞裂解液包括溶液A和溶液B，所述溶液A为甲酸浓度为1～5mL/L的水溶液，溶液B为含碳酸钠4～8g/L、氯化钠10～20g/L和硫酸钠25～40g/L的水溶液；
优选的，所述溶液A为甲酸浓度为1.2mL/L的水溶液，溶液B为含碳酸钠6g/L、氯化钠14.5g/L、硫酸钠31.3g/L的水溶液。
所述的试剂盒，还包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂包括核酸释放液，所述核酸释放液包括蛋白酶K浓度为10～40g/L、RNase浓度为A5～20g/L、EDTA浓度为5～20g/L的水溶液；
优选的，所述核酸释放液包括蛋白酶K浓度为20g/L、RNase A浓度为10g/L、EDTA浓度为15g/L的水溶液。
所述的试剂盒用于华法林个体化用药相关基因分型的检测。
本发明提供了一种利用所述的试剂盒进行的华法林个体化用药相关基因分型的检测方法，包括如下步骤：
S1、采用红细胞裂解液将待测外周血中的红细胞进行裂解，离心、弃上清，重悬细胞，重复以上裂解步骤至少一次；
S2、向步骤S1中的重悬的细胞中加入核酸释放液，在63-67℃下处理5-8分钟，然后在100-120℃下处理20-60秒，得到核酸样本；
S3、以步骤S2中获得的核酸样本为模板，加至核酸扩增试剂、引物和荧光探针的预混液中，进行实时荧光定量PCR检测。
所述的检测方法，在S2步骤中，在65℃处理5分钟，然后100℃处理30秒。
所述的检测方法，在S3步骤中，实时荧光定量PCR的反应程序为：热启动，95℃保持5分钟；热循环，循环40次，每循环为95℃保持15秒；最后58～62℃保持30秒。
所述的检测方法，在S1步骤中，先向待测外周血中加入红细胞裂解液的溶液A，震荡混合，然后再加入红细胞裂解液的溶液B，震荡混合，随后进行离心、弃上清，重悬细胞。
优选的，所述的检测方法，包括如下步骤：
(1)取200-2000体积份的外周血样本，向样本中加入150-15000体积份的红细胞裂解液溶液A，震荡混合20s后，加入150-1000体积份的红细胞裂解液溶液B，继续震荡混合20s，经离心处理后，弃上清，用200-1000体积份的PBS溶液重悬细胞；重复以上操作直至溶液无红色；
(2)取100体积份的细胞悬液溶液，加入100体积份的核酸释放液中，65℃处理5分钟，100℃处理30秒，得到核酸样本模板；
(3)取1-5体积份的核酸样本模板，加入到含核酸扩增试剂10-20体积份、引物2-10体积份和荧光探针1-5体积份的预混液中，混合均匀，在实时荧光定量PCR仪上进行检测。温度循环设置为：热启动，95℃，5分钟；热循环，循环40次，每循环为95℃20秒，58～62℃35秒。
优选的，所述的检测方法，包括如下步骤：
(1)取200体积份的外周血样本，向样本中加入500体积份的红细胞裂解液溶液A，震荡混合20s后，加入500体积份的红细胞裂解液溶液B，继续震荡混合20s，经离心处理后，弃上清，用1000体积份的PBS溶液重悬细胞；重复以上操作直至溶液无红色；
(2)取100体积份的细胞悬液溶液，加入100体积份的核酸释放液中，65℃处理5分钟，100℃处理30秒，得到核酸样本模板；
(3)取3体积份的核酸样本模板，加入到含核酸扩增试剂15体积份、引物4体积份和荧光探针2体积份的预混液中，混合均匀，在实时荧光定量PCR仪上进行检测。温度循环设置为：热启动，95℃，5分钟；热循环，循环40次，每循环为95℃20秒，58～62℃35秒。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的用于华法林用药相关基因分型检测的试剂盒，包括独立包装的核酸扩增试剂、基于华法林个体化用药相关基因设计的引物和荧光探针；所述核酸扩增试剂中包括纳米二氧化硅，首创性的发现在基因扩增检测中使用纳米二氧化硅，可以一方面利用纳米二氧化硅高比表面积的物理吸附能力和纳米聚集效应，将反应液中的反应物质限域在纳米空间中，提高局部反应区域浓度，进而提高了反应效率，另一方面利用二氧化硅表面的硅羟基可以与寡合核苷酸链直接发生非特异性相互作用，为退火配对提供位阻，提高了双链复性的能垒，因此对匹配提出了更高的要求，极大降低了错配链之间的复性，以此来提高反应特异性；综上，利用上述的试剂盒进行华法林用药相关基因分型检测，能够1.5小时内完成，得到检测结果，相比现有的基因分型检测试剂盒的检测结果，本发明的基因分型区分更明显，检测特异性高。
2.本发明提供的用于华法林用药相关基因分型检测的试剂盒，所述纳米二氧化硅的粒径为50～500nm，经过进一步的研究发现，在上述粒径范围内的纳米二氧化硅具有更好的物理吸附能力和纳米聚集效应，所述纳米二氧化硅为球状具有更高的比表面积，有利于将反应液中的反应物质限域在纳米空间中，提高反应效率和反应特异性。
3.本发明提供的用于华法林用药相关基因分型检测的试剂盒，所述核酸扩增试剂中还可以包括非离子型表面活性剂，所述非离子型表面活性剂一方面调节反应体系的黏度(降低)，另一方面与Taq酶作用，提高酶活性，所述非离子型表面活性剂包括但不限于烷基酚聚氧乙烯醚(APEO)、高碳脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO)、脂肪酸聚氧乙烯酯(AE)、脂肪酸甲酯乙氧基化物(FMEE)等，经过进一步研究发现，使用Triton X-100，在降低反应体系粘度和保护酶提高酶作用的方面效果更优。
4.本发明提供的用于华法林用药相关基因分型检测的试剂盒，包括的所述的核酸提取试剂，可以在10分钟内提取获得核酸样本，实现血液样本核酸的快速提取。
5.本发明提供的用于华法林用药相关基因分型检测的试剂盒，包括的引物和探针序列，基于VKORC1基因的rs9923231位点和CYP2C9基因的rs1057910位点进行的优化设计，特异性强，基因扩增检测结果准确。
6.本发明提供的一种利用上述的试剂盒进行的华法林用药相关基因分型的检测方法，步骤简单，易操作，利用上述的试剂盒中的核酸扩增试剂，可以显著提高基因扩增检测的反应效率和反应特异性，检测结果精确。
进一步的，在步骤S1中进行红细胞裂解过程中，其他血细胞膜已经发生变化，利于进一步的试剂渗透，提高核酸提取的效率；
进一步的，在步骤S2中，核酸释放过程采用两种酶消化和热裂解两种形式，将细胞核中的核酸释放出来，第一步65℃是利用酶对细胞中蛋白的消化作用，将细胞核内核酸上结合的蛋白消化掉，此温度是蛋白酶K的最适宜工作温度；第二步100℃处理，是将整个细胞样品中的除核酸外的物质(细胞内蛋白、膜材料、添加的酶等)失活处理，降低样品对扩增反应的抑制作用；进而提高核酸样本的提取时间，可以大大缩短至10分钟内，检测效率显著提高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例4中制备的纳米二氧化硅SEM图片(500nm)；
图2是本发明实施例4中制备的纳米二氧化硅SEM图片(100μm)；
图3是本发明实施例10中的实时荧光定量检测图；
图4是本发明实施例11中的实时荧光定量检测图；
图5是本发明实施例12中的实时荧光定量检测图。
具体实施方式
下述实施例中所涉及到的试剂、材料和仪器均为市售产品。
Triton X-100、正硅酸乙酯、甲酸为分析纯。
实时荧光定量PCR仪，型号为ABI 7500，生产商为Applied Biosystems。
HT7700-透射电子显微镜。
引物和荧光探针均为生工生物工程股份有限公司和宝生物工程(大连)有限公司提供。
待测外周血来源于：苏州科技城医院。
实施例1
本实施例提供了一种核酸扩增试剂，包括如下浓度的成分：
高保真DNA聚合酶，550mg/L；
dNTPs，100g/L；
10×PCR扩增缓冲液，10μL；
纳米二氧化硅，110g/L；
烷基酚聚氧乙烯醚(APEO)，1mL/L；
加双蒸水至50μL。
上述的纳米二氧化硅为球状，30nm。
上述的纳米二氧化硅为市售产品，如购自山东省寿光市昌泰微纳化工厂。
实施例2
本实施例提供了一种核酸扩增试剂，包括如下浓度的成分：
Taq酶，100mg/L；
dNTPs，200g/L；
Tris-HCl，0.5mL/L；
MgCl2，40g/L；
KCl，5g/L；
(NH4)2SO4，40g/L；
纳米二氧化硅，20g/L；
Triton X-100，5mL/L。
上述的纳米二氧化硅为球状，50nm。
上述的纳米二氧化硅，制备方法如下：将氨水(浓度为26wt％)、水、无水乙醇按照体积比10∶0.5∶89.5混合置于A瓶，将正硅酸乙酯(TEOS)与无水乙醇按照体积比15∶85混合置于B瓶。将两瓶溶液混合在加热搅拌器上搅拌预热到反应温度100℃后，混合加入到热式恒温加热磁力搅拌器的三口烧瓶中。在搅拌5分钟后，混合液逐渐由无色变成乳白色，2h后反应结束。将反应后得到的液体进行离心，离心结束后，将上层浑浊液倒到废液缸中，再向其中加入无水乙醇，用超声波清洗机将离心后附着在器皿表面的反应物重新溶解，再次进行离心操作(为了除去产物中未反应的原料)，即可得到需要的纳米二氧化硅。
实施例3
本实施例提供了一种核酸扩增试剂，包括如下浓度的成分：
Taq酶，500mg/L；
dNTPs，50g/L；
Tris-HCl，2mL/L；
MgCl2，10g/L；
KCl，20g/L；
(NH4)2SO4，5g/L；
纳米二氧化硅，100g/L；
Triton X-100，1mL/L。
上述的纳米二氧化硅为球状，500nm。
上述的纳米二氧化硅，制备方法如下：将氨水(浓度为28wt％)、水、无水乙醇按照体积比30∶2∶68混合置于A瓶，将正硅酸乙酯(TEOS)与无水乙醇按照体积比30∶70混合置于B瓶。将两瓶溶液混合后在加热搅拌器上搅拌预热到反应温度120℃后，混合加入到热式恒温加热磁力搅拌器的三口烧瓶中。在搅拌5分钟后，混合液逐渐由无色变成乳白色，2h后反应结束。将反应后得到的液体进行离心，离心结束后，将上层浑浊液倒到废液缸中，再向其中加入无水乙醇，用超声波清洗机将离心后附着在器皿表面的反应物重新溶解，再次进行离心操作(为了除去产物中未反应的原料)，即可得到需要的纳米二氧化硅。
实施例4
本实施例提供了一种核酸扩增试剂，包括如下浓度的成分：
Taq酶，300mg/L；
dNTPs，100g/L；
Tris-HCl，1mL/L；
MgCl2，20g/L；
KCl，10g/L；
(NH4)2SO4，10g/L；
纳米二氧化硅，50g/L；
Triton X-100，2mL/L。
上述的纳米二氧化硅为球状，300nm。
上述的纳米二氧化硅，制备方法如下：将氨水(浓度为25wt％)、水、无水乙醇按照体积比20∶1∶79混合置于A瓶，将正硅酸乙酯(TEOS)与无水乙醇按照体积比1∶4混合置于B瓶。将两瓶溶液混合后在加热搅拌器上搅拌预热到反应温度110℃后，混合加入到热式恒温加热磁力搅拌器的三口烧瓶中。在搅拌5分钟后，混合液逐渐由无色变成乳白色，2h后反应结束。将反应后得到的液体进行离心，离心结束后，将上层浑浊液倒到废液缸中，再向其中加入无水乙醇，用超声波清洗机将离心后附着在器皿表面的反应物重新溶解，再次进行离心操作(为了除去产物中未反应的原料)，即可得到需要的纳米二氧化硅，制得的纳米二氧化硅通过透射电子显微镜(TEM)来表征纳米二氧化硅的形貌，结果如图1-2所示：纳米二氧化硅外形趋近于球形，通过Nano Measurer软件对TEM图中的颗粒粒径进行统计，纳米二氧化硅的粒径介于50nm-500nm的范围内。
实施例5
本实施例提供了一种用于华法林用药相关基因分型检测的试剂盒，包括独立包装的：
实施例1制备的核酸扩增试剂；
细胞裂解液溶液A，为甲酸水溶液，浓度为1mL/L；
细胞裂解液溶液B，为含碳酸钠8g/L，氯化钠10g/L，硫酸钠40g/L的水溶液；
核酸释放液，为含蛋白酶K浓度为40g/L，RNase A浓度为5g/L，EDTA浓度为20g/L的水溶液，所使用的水为灭菌水；
引物，是基于华法林用药相关基因VKORC1基因的rs9923231位点设计的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示；
荧光探针，是基于华法林用药相关基因VKORC1基因的rs9923231位点设计的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3-4所示。
上述的荧光探针包括两条，探针1标记的荧光基团为FAM、FITC等中的一种，探针2标记的荧光基团为HEX、JOE、VIC等中的一种。
实施例6
本实施例提供了一种用于华法林用药相关基因分型检测的试剂盒，包括独立包装的：
实施例2制备的核酸扩增试剂；
细胞裂解液溶液A，甲酸水溶液，浓度为1mL/L；
细胞裂解液溶液B，为含碳酸钠8g/L，氯化钠10g/L，硫酸钠40g/L的水溶液；
核酸释放液，为含蛋白酶K浓度为10g/L，RNase A浓度为20g/L，EDTA浓度为5g/L的水溶液，所使用的水为灭菌水；
引物，是基于华法林用药相关基因VKORC1基因的rs9923231位点设计的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示；
荧光探针，是基于华法林用药相关基因VKORC1基因的rs9923231位点设计的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3-4所示。
上述的荧光探针包括两条，探针1标记的荧光基团为FAM、FITC等中的一种，在本实施例中选择FAM，探针2标记的荧光基团为HEX、JOE、VIC等中的一种，在本实施例中选择VIC。
实施例7
本实施例提供了一种用于华法林用药相关基因分型检测的试剂盒，包括独立包装的：
实施例3制备的核酸扩增试剂；
细胞裂解液溶液A，甲酸水溶液，浓度为5mL/L；
细胞裂解液溶液B，为含碳酸钠4g/L，氯化钠20g/L，硫酸钠25g/L的水溶液；
核酸释放液，为含蛋白酶K浓度为40g/L，RNase A浓度为5g/L，EDTA浓度为20g/L的水溶液，所使用的水为灭菌水；
引物，是基于华法林用药相关基因CYP2C9基因的rs1057910位点设计的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5-6所示；
荧光探针，是基于华法林用药相关基因CYP2C9基因的rs1057910位点设计的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7-8所示。
上述的荧光探针包括两条，探针1标记的荧光基团为FAM、FITC等中的一种，在本实施例中选择FAM，探针2标记的荧光基团为HEX、JOE、VIC等中的一种，在本实施例中选择VIC。
实施例8
本实施例提供了一种用于华法林用药相关基因分型检测的试剂盒，包括独立包装的：
实施例4制备的核酸扩增试剂；
细胞裂解液溶液A，甲酸水溶液，浓度为1.2mL/L；
细胞裂解液溶液B，为含碳酸钠6g/L，氯化钠14.5g/L，硫酸钠31.3g/L的水溶液；
核酸释放液，为含蛋白酶K浓度为20g/L，RNase A浓度为10g/L，EDTA浓度为15g/L的水溶液，所使用的水为灭菌水；
引物，是基于华法林用药相关基因CYP2C9基因的rs1057910位点设计的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5-6所示；
荧光探针，是基于华法林用药相关基因CYP2C9基因的rs1057910位点设计的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7-8所示。
上述的荧光探针包括两条，探针1标记的荧光基团为FAM、FITC等中的一种，在本实施例中选择FAM，探针2标记的荧光基团为HEX、JOE、VIC等中的一种，在本实施例中选择VIC。
实施例9
本实施例利用实施例5的试剂盒提供了一种华法林用药相关基因VKORC1基因的rs9923231位点(其基因型可能为CC、CT、TT)基因分型的检测方法，包括如下步骤：
1、采集服用华法林的患者外周血用于检测。
2、取200微升全血，不足的用PBS补足，向样本中加入150微升红细胞裂解液溶液A，震荡混合20s后，加入150微升红细胞裂解液溶液B，继续震荡混合10s，经离心处理后，弃上清，用200微升PBS溶液重悬细胞；重复以上操作直至溶液无明显红色。
3、取100微升裂解后的溶液，加入100微升核酸释放液中，65℃处理5分钟，100℃处理30秒，得到核酸样本模板。
4、取2微升的核酸样本模板，加入到核酸扩增试剂、引物和荧光探针的预混液中，在EP管中混合均匀，在实时荧光定量PCR仪上进行检测。温度循环设置为：热启动，95℃，5分钟；热循环，循环40次，每循环为95℃15秒，58～62℃30秒。
5、获取双通道实时荧光曲线，通过通道对应荧光基团，通过荧光基团对应探针所检测的碱基，结合曲线形状，给出患者基因型类型：纯合型or杂合型。
实施例10
本实施例利用实施例6的试剂盒提供了一种华法林个体化用药相关基因VKORC1基因的rs9923231位点(其基因型可能为CC、CT、TT)的基因分型检测方法，包括如下步骤：
1、采集服用华法林的患者外周血用于检测。
2、取200微升全血，不足的用PBS补足，向样本中加入150微升红细胞裂解液溶液A，震荡混合20s后，加入150微升红细胞裂解液溶液B，继续震荡混合10s，经离心处理后，弃上清，用200微升PBS溶液重悬细胞；重复以上操作直至溶液无明显红色。
3、取100微升裂解后的溶液，加入100微升核酸释放液中，63℃处理8分钟，120℃处理20秒，得到核酸样本模板。
4、取2微升的核酸样本模板，加入到核酸扩增试剂20微升、引物液2微升和荧光探针液5微升的预混液中，在EP管中混合均匀，在实时荧光定量PCR仪上进行检测，温度循环设置为：热启动，95℃，5分钟；热循环，循环40次，每循环为95℃15秒，58～62℃30秒。
5、获取双通道实时荧光曲线，通过通道对应荧光基团，通过荧光基团对应探针所检测的碱基，结合曲线形状，给出患者基因型类型：纯合型or杂合型。检测结果见附图3。
实施例11
本实施例利用实施例7的试剂盒提供了一种华法林个体化用药相关基因CYP2C9基因的rs1057910位点(其基因型可能为AA、AC、CC)的基因分型检测方法，包括如下步骤：
1、采集服用华法林的患者外周血用于检测。
2、取2毫升全血，不足的用PBS补足，向样本中加入15毫升红细胞裂解液溶液A，震荡混合20s后，加入1毫升红细胞裂解液溶液B，继续震荡混合20s，经离心处理后，弃上清，用1毫升PBS溶液重悬细胞；重复以上操作直至溶液无明显红色。
3、取100微升裂解后的溶液，加入100微升核酸释放液中，67℃处理5分钟，100℃处理60秒，得到核酸样本模板。
4、取3微升的核酸样本模板，加入到核酸扩增试剂10微升、引物液10微升和荧光探针液1微升的预混液中，在EP管中混合均匀，在实时荧光定量PCR仪上进行检测。温度循环设置为：热启动，95℃，5分钟；热循环，循环40次，每循环为95℃20秒，58～62℃35秒。
5、获取双通道实时荧光曲线，通过通道对应荧光基团，通过荧光基团对应探针所检测的碱基，结合曲线形状，给出患者基因型类型：纯合型or杂合型。检测结果见附图4。
实施例12
本实施例利用实施例8的试剂盒提供了一种华法林个体化用药相关基因CYP2C9基因的rs1057910位点(其基因型可能为AA、AC、CC)基因分型的检测方法，包括如下步骤：
1、采集服用华法林的患者外周血用于检测。
2、取200微升全血，不足的用PBS补足，向样本中加入500微升红细胞裂解液溶液A，震荡混合20s后，加入500微升红细胞裂解液溶液B，继续震荡混合10s，经离心处理后，弃上清，用1000微升PBS溶液重悬细胞；重复以上操作直至溶液无明显红色。
3、取100微升裂解后的溶液，加入100微升核酸释放液中，65℃处理5分钟，100℃处理30秒，得到核酸样本模板。
4、取3微升的核酸样本模板，加入到核酸扩增试剂15微升、引物液4微升和荧光探针液2微升的预混液中，在EP管中混合均匀，在实时荧光定量PCR仪上进行检测。温度循环设置为：热启动，95℃，5分钟；热循环，循环40次，每循环为95℃15秒，58～62℃30秒。
5、获取双通道实时荧光曲线，通过通道对应荧光基团，通过荧光基团对应探针所检测的碱基，结合曲线形状，给出患者基因型类型：纯合型or杂合型。检测结果见附图5。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
<120> 用于华法林用药相关基因分型检测的试剂盒和检测方法
<130> SHA201800441-G
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成（VKO-F）
<400> 1
agacagggtt tcaccatgtt gg 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(VKO-R)
<400> 2
acgccagagg aagagagttc c 21
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成（VKO-P1）
<400> 3
tgagccaccg cacccggcca atggttg 27
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成（VKO-P2）
<400> 4
tgagccaccg cacctggcca atggttg 27
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成（CYP-F）
<400> 5
gatgctgtgg tgcacgagg 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成（CYP-R）
<400> 6
ctggtgggga gaaggtcaat 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(CYP-P1)
<400> 7
ccagagatac attgacctt 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成（CYP-P2）
<400> 8
ccagagatac attgccctt 19

Claims (10)

1.一种用于华法林用药相关基因分型检测的试剂盒，其特征在于，包括独立包装的核酸扩增试剂、基于华法林用药相关基因设计的引物和荧光探针；所述核酸扩增试剂中包括纳米二氧化硅。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述纳米二氧化硅的粒径为50～500nm。优选的，所述纳米二氧化硅为球状。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂中还包括DNA聚合酶、dNTPs、扩增缓冲液和非离子型表面活性剂中的至少一种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂，包括如下浓度的成分：
Taq酶，100～500mg/L；
dNTPs，50～200g/L；
Tris-HCl，0.5～2mL/L；
MgCl2，10～40g/L；
KCl，5～20g/L；
(NH4)2SO4，5～40g/L；
纳米二氧化硅，20～100g/L；
Triton X-100，1～5mL/L；
优选的，所述核酸扩增试剂，包括如下浓度的成分：
Taq酶，300mg/L；
dNTPs，100g/L；
Tris-HCl，1mL/L；
MgCl2，20g/L；
KCl，10g/L；
(NH4)2SO4，10g/L；
纳米二氧化硅，50g/L；
Triton X-100，2mL/L。
5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述引物或荧光探针的浓度为100～300mg/L。优选的，所述引物或荧光探针的浓度为200mg/L。
6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述引物或荧光探针是基于VKORC1基因的rs9923231位点和CYP2C9基因的rs1057910位点中的至少一种设计的；优选的，基于VKORC1基因的rs9923231位点设计的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示，荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3-4所示；
基于CYP2C9基因的rs1057910位点设计的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5-6所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7-8所示。
7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂包括红细胞裂解液，所述细胞裂解液包括溶液A和溶液B，所述溶液A为甲酸浓度为1～5mL/L的水溶液，溶液B为含碳酸钠4～8g/L、氯化钠10～20g/L和硫酸钠25～40g/L的水溶液；优选的，所述溶液A为甲酸浓度为1.2mL/L的水溶液，溶液B为含碳酸钠6g/L、氯化钠14.5g/L、硫酸钠31.3g/L的水溶液；优选的，还包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂包括核酸释放液，所述核酸释放液包括蛋白酶K浓度为10～40g/L、RNase浓度为A5～20g/L、EDTA浓度为5～20g/L的水溶液；优选的，所述核酸释放液包括蛋白酶K浓度为20g/L、RNase A浓度为10g/L、EDTA浓度为15g/L的水溶液。
8.根据权利要求1-7任一项所述的试剂盒用于华法林个体化用药相关基因分型的检测。
9.一种利用权利要求1-7任一项所述的试剂盒进行的华法林用药相关基因分型的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、采用红细胞裂解液将待测外周血中的红细胞进行裂解，离心、弃上清，重悬细胞，重复以上裂解步骤至少一次；
S2、向步骤S1中的重悬的细胞中加入核酸释放液，在63-67℃下处理5-8分钟，然后在100-120℃下处理20-60秒，得到核酸样本；
S3、以步骤S2中获得的核酸样本为模板，加至核酸扩增试剂、引物和荧光探针的预混液中，进行实时荧光定量PCR检测。
10.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，在S2步骤中，在65℃处理5分钟，然后100℃处理30秒。
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