CN107653307A - 一种用于快速检测华法林个体化用药相关基因cyp2c9和vkorc1多态性的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测华法林个体化用药相关基因CYP2C9和VKORC1多态性的试剂盒，所述试剂盒包括检测基因CYP2C9*3(1061A/C)和VKORC1(‑1639G/A)遗传多态性的引物及探针。本发明的试剂盒对华法林个体化用药相关基因CYP2C9和VKORC1多态性的检测节省耗材和时间、简单易行、高通量。

Description

一种用于快速检测华法林个体化用药相关基因CYP2C9和 VKORC1多态性的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于快速检测华法林个体化用药相关基因CYP2C9和VKORC1多态性的试剂盒，属于生化检测领域。

背景技术

华法林是一种双香豆衍生物，华法林通过抑制维生素K及其2,3-环氧化物(维生素K环氧化物)的相互转化而发挥抗凝作用。虽为最古老的口服抗凝药物，华法林仍然是目前需要长期抗凝治疗患者的最常用药物。在临床上主要用于防治血栓栓塞性疾病，如治疗血栓栓塞性静脉炎，降低肺栓塞的发病率和死亡率，减少外科大手术，如髄关节固定术、人工置换心脏瓣膜手术等的静脉血栓发生率，以及作为心肌梗塞的辅助用药。但华法林的有效治疗范国较窄且不同个体之间给药剂量存在较大的差异，除了受患者年龄、种族、体重、饮食等临床因素影响外，华法林的靶酶VKORC1和代谢酶CYP2C9的基因遗传多态性是影响华法林用药剂量差异性的主要因素，而当前确定华法林需求剂量时常无法考虑遗传因素的影响，常常造成患者严重的出血并发症。

华法林在体内的代谢主要通过肝脏细胞色素氧化酶P450(CYP)系,华法林含S型和R型2种异构体,S型主要经肝脏CYP2C9代谢，R型由CYP3A4代谢，其中S型华法林的抗凝活性比R型强3～5倍，因此CYP2C9是影响华法林用药剂量的主要酶之一。国外文献报道86％的CYP2C9突变病例仅需要很低的维持剂量(≤1.5mg.d-1)，而需要低维持剂量的普患者为38％，以此具有CYP2C9突变等位基因的个体需要减量给药以较少不良反应的发生。CYP2C9是细胞色素P450酶(CYP)第二亚家族中的重要成员，占肝微粒体P450蛋白总量的20％。CYP2C9参与抗凝血药、抗惊厥药、降糖药、非甾体类解热镇痛抗炎药、抗高血压药以及利尿药等多种药物的羟化代谢，其中华法林、甲苯磺丁脲和苯妥因均为治疗指数较窄的药物。CYP2C9活性变化可导致这些药物体内浓度出现较大变化，甚至导致严重药物不良反应的发生。CYPC2C9*2(rs1799853，C430T，Arg144Cys)和CYP2C9*3(rs1057910，A1075C，Ile359Leu)均导致CYP2C9酶活性降低，CYP2C9*3纯合子个体酶活性仅为该位点野生型纯合子基因型个体(携带CYP2C9*1或Arg144/Ile359等位基因)的4～6％。中国人群中CYPC2C9*2的频率为0％，CYPC2C9*3的频率为3％。CYP2C9*3纯合子华法林需要剂量比野生型纯合子低60％～75％；与野生型比较，CYP2C9*3突变型者的需要剂量明显降低，达到稳态时间延长。在同等剂量时INR值偏高，发生危及生命的严重出血事件的风险增大。因此，用药前进行CYP2C9基因型检测，有助于预测患者的最佳华法林负荷剂量，降低出血事件的发生率。

维生素K氧化还原酶是抗凝药物华法林的作用靶点。维生素K环氧化物还原酶复合物1的编码基因VKORC1的遗传变异可通过影响VKORC1表达，从而影响华法林的敏感性。位于该基因启动子区(-1639G>A)的单核苷酸突变rs9923231可影响VKORC1的表达，是导致华法林用药剂量个体差异的主要原因之一。与该位点AA基因型患者相比，-1639GA和GG基因型患者平均华法林剂量分别增加52％(95％CI：41～64％)和102％(95％CI：85～118％)。VKORC1多态性对华法林剂量影响的比重因种族而异，-1639GA和GG基因型对白种人华法林剂量的影响比对亚洲人的影响分别高10％和50％。总体上，VKORC1多态性在不同种族不同人群中可解释约27％华法林用药剂量的个体差异。VKORC1-1639A等位基因在亚洲人、白种人和黑种人群中的等位基因频率分别为91.17％、38.79％和10.81％(根据千人数据库的结果：在亚洲人、白种人和黑种人群中的等位基因频率分别为92％、40％和7％)，其频率分布的种族差异与华法林用药剂量差异间具有很好的相关性。VKORC多态性同时也影响华法林用药的临床后果。美国FDA于2007年批准修改华法林的产品说明书，推荐在使用华法林前对VKORC1进行基因检测；2010年再次修改说明书，建议结合VKORC1和CYP2C9基因型考虑华法林的初始用药剂量。临床上也可根据考虑了VKORC1和CYP2C9基因型、年龄、身高、体重、种族、是否合用肝药酶诱导剂和是否合用胺碘酮等因素的剂量计算公式确定华法林初始用药剂量。

目前检测CYP2C9*3(1061A/C)和VKORC1(-1639G/A)遗传多态性的最简単的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通过应用特异性限制性内切酶消化PCR扩增产物，并根据消化位点是否消失来判断其变异存在与否。但该方法操作复杂,样本量多时易造成PCR产物的交又污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性结果，可靠性低。荧光定量PCR和多重PCR方法尽管特异性有所提高，但是这两种方法的原理仍然是基于普通PCR的原理，荧光信号的强弱、引物特异性以及低保真Taq酶等这些因素均可造成对结果的影响。DNA测序法操作流程繁琐，在人类后基因组时代突飞猛进的今天，这几种方法均不能满足当前快速准确分析的要求。

Taqman探针的方法采用特异性的荧光标记的探针，特异性强，灵敏度高且操作方便快速。其基本原理是：应用一对双荧光标记的Taqman探针，分别识别等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探针才能扩增出对应的荧光信号，这样就可以在一次PCR反应中完成对单个SNP位点的基因型判定。所以该方法中探针的特异性和长度对检测结果的特异性和敏感性都很重要。

发明内容

本申请针对现有技术检测华法林个体化用药相关基因CYP2C9和VKORC1多态性价格昂贵、周期长、效率低、数据分析繁琐等不足，在已有的实时定量PCR检测CYP2C9和VKORC1多态性的基础上，研发出一种更加简便、快速、高通量、特异性高的可以定性检测CYP2C9和VKORC1多态性的试剂盒。本试剂盒针对临床检测的要求，引入多色荧光通道检测，更易于在临床的推广和应用，能够更好地检测CYP2C9和VKORC1多态性从而有利于临床上华法林的安全用药。

为了实现上述检测目的，本发明采用的技术方案如下。

本发明检测华法林个体化用药相关基因CYP2C9和VKORC1多态性的试剂盒，所述试剂盒包括检测基因CYP2C9*3(1061A/C)和VKORC1(-1639G/A)遗传多态性的引物及探针。

所述试剂盒包括检测基因CYP2C9(1061A/C)的一个正向引物、一个反向引物及两个检测探针的检测引物探针组合1，包括检测基因VKORC1(-1639G/A)的一个正向引物、一个反向引物及两个检测探针的检测引物探针组合2，包括检测内参基因的一个正向引物、一个反向引物及一个内控探针的内控引物探针组合。

所述CYP2C9(1061A/C)基因多态性的检测引物探针组合1，包括：

正向引物：CYP2C9F：5’-CCCTGCATGCAAGACAGGAG-3’(SEQ ID No.1)

反向引物：CYP2C9R：5’-ACTTACCTTGGGAATGAGATAG-3’(SEQ ID No.2)

检测探针：probe1：5’-FAM-TCCAGAGATACATTGACCTTCTCCCC-BHQ2-3’(SEQ ID No.3)

检测探针：probe2：5’-FAM-TCCAGAGATACCTTGACCTTCTCCCC-BHQ2-3’(SEQ ID No.4)

所述VKORC1(-1639G/A)基因多态性的检测引物探针组合2，包括：

正向引物：VKORC1F：5’-GTAAGGGATCCCTCTGGGAAG-3’(SEQ ID No.5)

反向引物：VKORC1R：5’-CACCATGTTGGCCAGGCTTG-3’(SEQ ID No.6)

检测探针：probe3：5’-CY5-CCACCGCCACCCGGCCAATGGTT-BHQ2-3’(SEQ ID No.7)

检测探针：probe4：5’-CY5-CCACCGCCACCTGGCCAATGGTT-BHQ2-3’(SEQ ID No.8)

所述内控引物探针组合，包括：

正向引物：Cont F：5’-CATTCTAAACTGTACCCTGTTACT-3’(SEQ ID No.9)

反向引物：Cont R：5’-GCCACACTGAGTGAGCTGCACTG-3’(SEQ ID No.10)

检测探针：probe5：5’-ROX-CCTTCCTATGACATGAACTTAACC-BHQ2-3’(SEQ ID No.11)

上述试剂盒中优选的PCR扩增条件为：

温度为95℃，时间为3分钟；再次依照以下程序运行40个循环，变性：温度为95℃，时间为15秒，退火：温度为60℃，时间为20秒，延伸：温度为72℃，时间为30秒(设置荧光信号采集)；

本发明还提供一种利用上述检测CYP2C9和VKORC1多态性多色荧光PCR试剂盒进行CYP2C9和VKORC1多态性检测的方法，步骤包括：

(1)待测样本处理和模板提取

抽取待检测这的血液样本，保存于抗凝采集管中；从血液样本中获取DNA，推荐使用商品化的试剂盒提取；测定DNA的浓度和纯度，要求浓度不小于50ng/μl；OD260nm/OD280nm在1.7～2.0之间。

(2)荧光PCR扩增

将待检测模板DNA加入含有本发明所述CYP2C9和VKORC1多态性特异检测引物探针组合及内控引物探针的多色荧光PCR反应液内，在荧光PCR管内混合均匀离心后，放入荧光定量PCR仪器按照特定的温度循环及信号采集程序进行PCR反应。

上述荧光PCR扩增方案优选采用以下温度循环及信号采集程序进行PCR反应：

温度为95℃，时间为3分钟；再次依照以下程序运行40个循环，变性：温度为95℃，时间为15秒，退火：温度为60℃，时间为20秒，延伸：温度为72℃，时间为30秒(设置荧光信号采集)。

(3)结果分析

在上述PCR反应体系与温度循环程序条件下，观察特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成对数扩增“S”型曲线，如果对应的目的检测荧光信号呈对数扩增“S”型曲线则该待检测DNA样本判定为该信号所对应的基因表型为阳性。

发明的有益效果

(1)节省耗材和时间、简单易行、高通量

基于本设计及PCR反应特点，使得该发明可以很大程度上节省时间和耗材，反应时间短是由于荧光PCR方法技术平台比其他技术平台操作少，耗时短，检测过程只需要1小时～1.5小时，操作简单易行，整个实验可在2.5小时内完成。

(2)结果可靠、灵敏度高

采用本发明方法与普通等位基因分型“金标准”测序以及PCR电泳法进行方法学对比，所有样本结果完全吻合。本发明方法在引入多色荧光方法提高准确度与灵敏度外，同时，使用本发明方法可一次同时高通量进行48例或者192例样本的检测，因此，更适用于临床分子诊断。

(3)成本低、无污染

由于本发明具有高通量的特点，因此使得本发明中每个反应管的成本低；同时，此技术未涉及重复开盖等二次污染的可能，本发明可直接根据探针的荧光曲线判断扩增产物，不涉及任何对人体有毒害作用的化学试剂，安全、无污染。

附图说明

图1为某样本CYP2C9和VKORC1多态性多色荧光PCR试剂盒检测图。

图2为附图1样本CYP2C9基因和VKORC1基因测序图。

具体实施方式

以下本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1.引物探针的设计：

根据美国国立生物技术信息中心NCBI的核酸序列数据库GeneBank公开的CYP2C9基因的参考序列(NC_000010.11)以及VKORC1基因的参考序列(NC_000016.10)的信息，分别设计CYP2C9*3(1061A/C)和VKORC1(-1639G/A)遗传多态性检测引物探针组合。引物探针组合的序列具体如下：

正向引物：CYP2C9F：5’-CCCTGCATGCAAGACAGGAG-3’

反向引物：CYP2C9R：5’-ACTTACCTTGGGAATGAGATAG-3’

检测探针：probe1：5’-FAM-

TCCAGAGATACATTGACCTTCTCCCC-BHQ2-3’，probe1对应CYP2C9的等位基因A；

检测探针：probe2：5’-FAM-TCCAGAGATACCTTGACCTTCTCCCC-BHQ2-3’，probe2对应CYP2C9的等位基因C；

正向引物：VKORC1F：5’-GTAAGGGATCCCTCTGGGAAG-3’

反向引物：VKORC1R：5’-CACCATGTTGGCCAGGCTTG-3’

检测探针：probe3：5’-CY5-CCACCGCCACCCGGCCAATGGTT-BHQ2-3’，probe3对应VKORC1的等位基因G；

检测探针：probe4：5’-CY5-CCACCGCCACCTGGCCAATGGTT-BHQ2-3’，probe4对应VKORC1的等位基因A；

为了监测DNA模板及反应体系的有效性，在检测体系内加入内控引物与探针，本发明选取人类保守基因Globin的一段序列(NC_000011.10：5226478-5226633段156个碱基)，设计内控引物探针，具体序列如下所示：

正向引物：Cont F：5’-CATTCTAAACTGTACCCTGTTACT-3’

反向引物：Cont R：5’-GCCACACTGAGTGAGCTGCACTG-3’

检测探针：probe5：5’-ROX-CCTTCCTATGACATGAACTTAACC-BHQ2-3’

实施例2.引物的制备

将设计好的引物及探针序列交给合成公司合成，一般采用仪器自动化学合成，需提供合成检验合格报告。

实施例3.多色荧光PCR检测CYP2C9和VKORC1多态性试剂盒的准备

制备CYP2C9和VKORC1多态性检测反应液1和反应液2，其中PCR反应液包含了PCR反应必须的缓冲液、镁离子、dNTP、核酸聚合酶等物质外，还包含了检测引物探针组合和内控引物探针。上述特异性检测的PCR反应液组份信息如下：

反应液1：缓冲液，10X；镁离子，15mM；dNTP(A/T/C/G)，各20mM；CYP2C9F，200nM；CYP2C9R，200nM；VKORC1F，200nM；VKORC1R，200nM；probe1，2μM；probe3，2μM；Cont F，200nM；Cont R，200nM；probe5，2μM；核酸聚合酶5U；

反应液2：缓冲液，10X；镁离子，15mM；dNTP(A/T/C/G)，各20mM；CYP2C9F，200nM；CYP2C9R，200nM；VKORC1F，200nM；VKORC1R，200nM；probe2，2μM；probe4，2μM；Cont F，200nM；Cont R，200nM；probe5，2μM；核酸聚合酶5U；

实施例4.多色荧光PCR检测CYP2C9和VKORC1等位基因多态性的方法

第一步：准备待检测DNA

抽取待检测这的血液样本，保存于抗凝采集管中；从血液样本中获取DNA，推荐使用商品化的试剂盒提取(如上海生工的血液基因组DNA快速提取试剂盒)；测定DNA的浓度和纯度，要求浓度不小于50ng/μl；OD260nm/OD280nm在1.7～2.0之间。

第二步：PCR反应体系配制

在荧光PCR专用管内按照下列配方配制PCR反应体系：

PCR反应液，25μl；基因组DNA，约100ng；ddH₂O，加至50μl；

上述PCR反应液1和反应液2采用实施列3制备的试剂盒中的CYP2C9和VKORC1多态性检测反应液，也可以按照实施例3提供的配方制备含有CYP2C9和VKORC1多态性特异引物探针组合并含有内控引物探针的PCR反应液。

第三步：上机检测

按照下列步骤设置温度循环及信号采集程序：

温度为95℃，时间为3分钟；再次依照以下程序运行40个循环，变性：温度为95℃，时间为15秒，退火：温度为60℃，时间为20秒，延伸：温度为72℃，时间为30秒(设置荧光信号采集)。

第四步：分析结果

在上述PCR反应体系及温度循环条件下，在内控信号形成正常对数扩增“S”型曲线的前提下，观察反应体系内特异性检测荧光信号是否都形成对数扩增“S”型曲线，如果对应的目的检测荧光信号呈对数扩增“S”型曲线则该待检测DNA样本判定为该信号所对应的基因表型为阳性。例如：某待检样本在反应体系内控荧光信号(ROX通道)形成对数扩增“S”型曲线的条件下，反应液1特异性检测荧光信号FAM形成“S”型曲线，则提示该样本为CYP2C9等位基因“A”阳性，反应液1特异性检测荧光信号CY5形成“S”型曲线，则提示该样本为VKORC1等位基因“G”阳性；反应液2特异性检测荧光信号FAM形成“S”型曲线，则提示该样本为CYP2C9等位基因“C”阳性，反应液2特异性检测荧光信号CY5形成“S”型曲线，则提示该样本为VKORC1等位基因“A”阳性。

附图1为某样本CYP2C9和VKORC1多态性多色荧光PCR试剂盒检测图，检测图反应体系内控荧光信号合格，反应液1显示出FAM信号和CY5信号，反应液2显示出CY5信号；则判断该样本CYP2C91061位点为A/A型，VKORC1-1639位点为G/A型。

图2为附图1样本CYP2C9基因和VKORC1基因测序图。经过比对，试剂盒检测结果与测序结果一致。

Claims (8)

1.一种检测华法林个体化用药相关基因CYP2C9和VKORC1多态性的试剂盒，其特征在于：包括检测基因CYP2C9*3(1061A/C)和VKORC1(-1639G/A)遗传多态性的引物及探针。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：

其中，所述试剂盒包括检测基因CYP2C9(1061A/C)的一个正向引物、一个反向引物及两个检测探针的检测引物探针组合1；检测基因VKORC1(-1639G/A)的一个正向引物、一个反向引物及两个检测探针的检测引物探针组合2；以及检测内参基因的一个正向引物、一个反向引物及一个内控探针的内控引物探针组合。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：

其中，所述CYP2C9(1061A/C)基因多态性的检测引物探针组合1，包括：

正向引物：CYP2C9F：5’-CCCTGCATGCAAGACAGGAG-3’

反向引物：CYP2C9R：5’-ACTTACCTTGGGAATGAGATAG-3’

检测探针：probe1：5’-FAM-TCCAGAGATACATTGACCTTCTCCCC-BHQ2-3’

检测探针：probe2：5’-FAM-TCCAGAGATACCTTGACCTTCTCCCC-BHQ2-3’。

4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：

其中，所述VKORC1(-1639G/A)基因多态性的检测引物探针组合2，包括：

正向引物：VKORC1F：5’-GTAAGGGATCCCTCTGGGAAG-3’

反向引物：VKORC1R：5’-CACCATGTTGGCCAGGCTTG-3’

检测探针：probe3：5’-CY5-CCACCGCCACCCGGCCAATGGTT-BHQ2-3’

检测探针：probe4：5’-CY5-CCACCGCCACCTGGCCAATGGTT-BHQ2-3’。

5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：

所述内控引物探针组合，包括：

正向引物：Cont F：5’-CATTCTAAACTGTACCCTGTTACT-3’

反向引物：Cont R：5’-GCCACACTGAGTGAGCTGCACTG-3’

检测探针：probe5：5’-ROX-CCTTCCTATGACATGAACTTAACC-BHQ2-3’。

6.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：

其中，使用引物进行PCR扩增的条件为：温度为95℃，时间为3分钟；再次依照以下程序运行40个循环，变性：温度为95℃，时间为15秒，退火：温度为60℃，时间为20秒，延伸：温度为72℃，时间为30秒。

7.一种利用如权利要求1-6中任意一项所述的检测华法林个体化用药相关基因CYP2C9和VKORC1多态性的试剂盒进行CYP2C9和VKORC1多态性检测的方法，包括步骤：

(1)待测样本处理和模板提取

抽取待检测者的血液样本，保存于抗凝采集管中；从血液样本中获取DNA；测定DNA的浓度和纯度，要求浓度不小于50ng/μl；OD260nm/OD280nm在1.7～2.0之间；

(2)荧光PCR扩增

将待检测模板DNA加入含有本发明所述CYP2C9和VKORC1多态性特异检测引物探针组合及内控引物探针的多色荧光PCR反应液内，在荧光PCR管内混合均匀离心后，放入荧光定量PCR仪器进行PCR反应；

(3)结果分析

在上述PCR反应体系与温度循环程序条件下，判断实验结果的特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成对数扩增“S”型曲线，如果对应的目的检测荧光信号呈对数扩增“S”型曲线则该待检测DNA样本判定为该信号所对应的基因表型为阳性。

8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于：

其中，荧光PCR扩增步骤中采用以下温度循环及信号采集程序进行PCR反应：

温度为95℃，时间为3分钟；再次依照以下程序运行40个循环， 变性：温度为95℃，时间为15秒，退火：温度为60℃，时间为20秒，延伸：温度为72℃，时间为30秒。