CN107099620A - 一种人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒 - Google Patents

一种人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种不依赖于高能能量分子的用于检测人类免疫缺陷病毒1型的恒温扩增方法及试剂盒。其试剂盒的组成包括反应液、启动液、反应酶系（干粉反应管）、阴性质控品和阳性质控品。检测方法主要包括如下步骤：将反应液、反应酶系与启动液混合，加入待检样本，在荧光定量PCR仪上进行恒温扩增，得到检测结果。本发明采取的扩增方式是恒温扩增方式，扩增速度快且稳定，可以在30 min以内完成扩增反应，扩增的灵敏度和准确度高，不易出现错配，扩增效果好。且相对于现有的恒温扩增体系，不依赖于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，其组成更简单，成本更低廉，使用更方便，从而便于临床早期诊断及时发现HIV‑1感染。

Description

一种人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种核酸恒温扩增技术，尤其涉及一种不依赖于高能能量分子的用于检测人类免疫缺陷病毒1型的恒温扩增技术及试剂盒。
背景技术
艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)，又称获得性免疫缺陷综合症，是一类世界范围内严重危害人类健康和生命的病毒性传染性疾病。在不到20年中，已使3000万人受到感染，1000万人失去生命。目前，世界上每天有万余人新感染艾滋病病毒。据统计，至2001年底，我国艾滋病的感染人数为100万左右，现进入快速增长期，根据卫生部的资料，2001年上半年报告的艾滋病病毒感染者数量与上一年相比上升了67.4％。全球的研究结果表明HIV患者总数的1/2是通过被污染的血液、血液制品、输血或密切个体间接触而传播传染的，在特殊的人群中甚至出现交叉感染的迹象。不但医学界在竭尽全力研究诊断预防治疗艾滋病，各国政府，社会各阶层都纷纷投入到抗击艾滋的运动。但到目前为止，人类还没有找到一种治疗此病的方法。因而早期诊断及时发现感染病人，控制其进一步传播仍然是艾滋病防治的重要手段之一。
近年来，国内外主要采用酶联免疫吸附法(ELISA)、PCR、细胞培养等方法检测HIV-1抗体或病毒。这些方法都不同程度的存在一些缺点。
如ELISA法操作程序较复杂，易造成假阳性和假阴性，并易造成操作者受害和环境污染， 试验时间较长，需要两个小时以上才能得出检测结果。同时必须具备酶标仪和洗板机，这在基层实验室和小型门诊较难达到，且试验受温度等条件限制，给检测带来不便。
细胞培养是一种无菌操作技术，要求具备很高的实验工作环境和条件(无菌操作间、超净工作台、操作间等)，需要大量的仪器设备(培养箱、离心机、显微镜等)，需要大量的专业实验器材，实验技术复杂，需要有经验的技术人员操作，且实验周期很长，不适宜疾病的快速检测。凝集试验包括明胶颗粒(PA)和乳胶颗粒(LAT)属半定量测定，须多次倍比稀释测定费试剂，且结果重复性差，且灵敏度低。
而普通的PCR技术虽然在灵敏度和特异性方面有优势，但是在技术应用上也有几点限制：第一，PCR技术需要昂贵的实验室仪器，同时仪器要具备精细的温度控制程序和加热模板，从而实现很高的温度下的DNA模板链的变性，较低的温度下引物探针退火延伸模板，这样重复温度变化几十个循环之后实现模板量的放大。由于每一个循环时间都较短，仪器必须能快速准确升降温度，这就需要银制或金制的加热模块，加大仪器研制的成本。第二，PCR扩增体系中有用的聚合酶必须具有耐受高温的能力，否则必须在每一个循环中重新加入新酶，以实现下一循环的扩增，这样极容易造成污染也加大了成本。第三，在PCR循环中，每一个循环引物退火的时间都很短（几秒到十几秒）这就要求引物必须快速找到模板上同源匹配的区段，以实现延伸。这就要求PCR体系必须有过量的PCR引物。而过量的引物会与模板错配，错误引发扩增，引物二聚体等等，进而抑制PCR扩增，特别是在模板量低的情况，会使这种情况加剧。
与传统的PCR技术相比，恒温扩增技术主要利用重组酶的活性，不进行核酸解链和退火即可在恒温条件下（如37℃）进行核酸的扩增，因此不需要昂贵的仪器，也避免了高温对酶的损耗。同时恒温扩增技术在体系中不需要加入过量的引物，降低了引物与模板错配或生成引物二聚体的可能性。恒温扩增技术日益受到重视。
常见的等温扩增技术有以下几种：滚环恒温扩增（RCA)，环介导恒温扩增(LAMP)，依赖解旋酶恒温扩增（HDA)等。现有的恒温扩增技术，其反应体系比较复杂，同时绝大部分恒温扩增体系要么依赖于ATP，要么依赖于肌酸激酶和磷酸肌酸，或其他高能能量分子，所需的试剂种类繁多，扩增速度受限于能量的供给，这导致恒温扩增技术成本比较高，限制了其应用。
发明内容
针对常规的荧光检测试剂需要配套的昂贵的仪器设备，现有的恒温扩增检测试剂需依赖于ATP等高能量分子导致所需的试剂种类繁多、扩增速度受限等问题，本发明提供了一种不依赖于高能能量分子的用于检测人类免疫缺陷病毒1型的恒温检测试剂盒，仅需常规的荧光PCR仪即可完成快速检测。
本发明所采取的技术方案是：一种人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，包括反应液、启动液、反应酶系、阴性质控品和阳性质控品，其中，反应酶系的成分包括单链结合蛋白、重组酶、HIV特异性引物（正向引物和反向引物）和荧光探针等，其中，重组酶为不依赖于能量分子的重组酶。
一种人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，其反应液成分包括：
Tris-缓冲液 10mM--150mM
硫酸铵 0mM--150mM
二硫苏糖醇 0mM--10mM
甜菜碱 0M-2M
Tween20 0%-1%（质量百分比）
PEG 1%--20%（质量百分比）
BSA 0mg/mL--1mg/mL
优选的，Tris-缓冲液可选自Tris-H2SO4、Tris-乙酸、Tris-HCl中的任意一种或多种，Tris-缓冲液的pH为7.0～9.0。
一种人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，其启动液成分包括：
Mg2+ 5mM--20mM
优选的，Mg2+来自于硫酸镁、乙酸镁、氯化镁中的任意一种或多种。
一种人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，其反应酶系（干粉反应管）成分包括：
dNTPs 200μM-500μM
聚合酶Bsu 10-100U
单链结合蛋白 1-10μg
重组酶（E.coli RecT） 1-10μg
逆转录酶 10-100U
正向引物 10-40pM
反向引物 10-40pM
荧光探针 10-30pM
聚合酶、单链结合蛋白、重组酶和逆转录酶的用量可以根据需要调整其添加量，或通过预实验确定其用量。
优选的，其反应液具体组成成分如下：
Tris-H2SO4 （pH8.0） 70mM
硫酸铵 100mM
二硫苏糖醇 3mM
甜菜碱 1M
PEG 5%
BSA 1mg/mL
一种人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，其启动液具体组成成分如下：
硫酸镁 10mM
一种人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，其反应酶系（干粉反应管）具体组成成分如下：
dNTPs 200μM
聚合酶Bsu 50U
单链结合蛋白 6μg
重组酶（E.coli RecT） 2.5μg
逆转录酶 20U
正向引物 20pM
反向引物 20pM
荧光探针 15pM
重组酶为不依赖于能量分子的重组酶。
人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒其特异性引物序列如下：
正向引物：CCCTCAGATGCTGCATATAAGCAGCTGCTTT
反向引物：CCCTGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGATTTT
荧光探针：
FAM-CACTG-dR-[T(BHQ-1)]TTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTG-SpacerC3 。
优选的，荧光探针5’端标记的FAM荧光基团可被常用的其他荧光基团（如HEX、VIC、CY5等）替换。
优选的，人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒采用的重组酶选自E.coli RecT蛋白；λ噬菌体β蛋白；啤酒酵母SepΙ/STPβ；啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STPα蛋白；粟酒裂殖酵母p140/Exoǁ蛋白以及RrpΙ、HPP-Ι、v-SEP、ICP8蛋白。
一种人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，包括将反应液、反应酶系与启动液混合，加入待检样本，在荧光定量PCR仪上进行恒温扩增，得到检测结果。
优选的，恒温扩增的温度为35～42℃，优选扩增温度为37℃。
本发明的有益效果是：
①本发明采取的扩增方式是恒温扩增方式，相对于传统的检测方法具有快速、高效、特异等优点。
②本发明的恒温扩增体系，不依赖于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，相对现有的恒温扩增体系，其组成更为简单，成本更为低廉，使用更为方便。
③本发明的恒温扩增体系可以对人类免疫缺陷病毒1型核酸序列实现扩增，扩增速度快且稳定，可以在30 min以内完成扩增反应，扩增的灵敏度和准确度高，不易出现错配，扩增效果好。
附图说明
图1是实施例1的恒温扩增结果图。
具体实施方式
一种人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，其反应液具体组成成分如下：
Tris-H2SO4 （pH8.0） 70mM
硫酸铵 100mM
二硫苏糖醇 3mM
甜菜碱 1M
PEG 5%
BSA 1mg/mL
一种人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，其启动液具体组成成分如下：
硫酸镁 10mM
一种人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，其反应酶系（干粉反应管）具体组成成分如下：
dNTPs 200μM
聚合酶Bsu 50U
单链结合蛋白 6μg
重组酶（E.coli RecT） 2.5μg
逆转录酶 20U
正向引物 20pM
反向引物 20pM
荧光探针 15pM
重组酶为不依赖于能量分子的重组酶。
作为上述反应试剂的进一步改进，所使用的Tris-H2SO4的pH为8.0。
聚合酶为恒温扩增反应中常用的聚合酶，优选为Bsu或klenow；逆转录酶为逆转录反应中常用的逆转录酶，优选为常温条件下反应的逆转录酶如AMV或者MMLV。重组酶选自E.coli RecT蛋白；λ噬菌体β蛋白；啤酒酵母SepΙ/STPβ；啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STPα蛋白；粟酒裂殖酵母p140/Exoǁ蛋白以及RrpΙ、HPP-Ι、v-SEP、ICP8蛋白。
作为上述方法的进一步改进，恒温扩增的温度为37℃。
下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。
实施例1：试剂盒构成
一种人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，其反应液具体组成成分如下：
Tris-H2SO4 （pH8.0） 70mM
硫酸铵 100mM
二硫苏糖醇 3mM
甜菜碱 1M
PEG 5%
BSA 1mg/mL
一种人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，其启动液具体组成成分如下：
硫酸镁 10mM
一种人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，其反应酶系（干粉反应管）具体组成成分如下：
dNTPs 200μM
聚合酶Bsu 50U
单链结合蛋白 6μg
重组酶（E.coli RecT） 2.5μg
逆转录酶 20U
正向引物 20pM
反向引物 20pM
荧光探针 15pM
人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒其特异性引物序列如下：
正向引物：CCCTCAGATGCTGCATATAAGCAGCTGCTTT
反向引物：CCCTGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGATTTT
荧光探针：
FAM-CACTG-dR-[T(BHQ-1)]TTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTG-SpacerC3
实施例2：本发明试剂盒检测HIV-1阳性样本与阴性对照的实验对比
本实施例用HIV-1核酸作为样本，用人基因组DNA作为阴性对照。取两个干粉反应管，分别标记为反应管1和反应管2。在两个干粉反应管分别加入反应液 25μl，盖上反应管管盖，上下颠倒干粉反应管8-10次，确认干粉完全溶解。在反应管1中加入2μl HIV-1核酸，在反应管2中加入2μl 人基因组DNA作为阴性对照，用灭菌水补足体系到45μl，混匀后再分别加入5μl启动液。
选择荧光定量PCR仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，45个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图1。
从图1可以看出，反应体系对应的HIV-1核酸样本检测结果呈明显的”S”型扩增曲线，表明检测结果为阳性。检测阴性对照无”S”型扩增曲线，表明检测结果为阴性。本实验表明本试剂盒的检测特异性好、准确度高。
通过实施例与传统PCR检测试剂的操作时长比较，实施例所述试剂盒所需反应时间小于30min，而传统PCR检测试剂普遍需要3-5小时，可见本发明试剂盒能大幅度缩减检测时间，检测效率高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州和实生物技术有限公司
<120> 一种人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒
<130> 2017
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccctcagatg ctgcatataa gcagctgctt t 31
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccctgttcgg gcgccactgc tagagatttt 30
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cactgttaag cctcaataaa gcttgccttg agtg 34

Claims (10)

1.一种人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，包括反应液、启动液、反应酶系、阴性质控品和阳性质控品，其特征在于：所述的反应酶系的成分包括单链结合蛋白、重组酶、HIV特异性引物（正向引物和反向引物）和荧光探针等，其中，重组酶为不依赖于能量分子的重组酶。
2.根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，其特征在于：其反应液成分包括：
Tris-缓冲液 10mM--150mM
硫酸铵 0mM--150mM
二硫苏糖醇 0mM--10mM
甜菜碱 0M-2M
Tween20 0%-1%（质量百分比）
PEG 1%--20%（质量百分比）
BSA 0mg/mL--1mg/mL。
3.根据权利要求2所述的人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，其特征在于：Tris-缓冲液可选自Tris-H2SO4、Tris-乙酸、Tris-HCl中的任意一种或多种，Tris-缓冲液的pH为7.0～9.0。
4.根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，其特征在于：其启动液成分包括：
Mg2+ 5mM--20mM。
5.根据权利要求4所述的人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，其特征在于：Mg2+来自于硫酸镁、乙酸镁、氯化镁中的任意一种或多种。
6.根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，其特征在于：其反应酶系（干粉反应管）成分包括：
dNTPs 200uM-500uM
聚合酶Bsu 10-100U
单链结合蛋白 1-10ug
重组酶（E.coli RecT） 1-10ug
逆转录酶 10-100U
正向引物 10-40pM
反向引物 10-40pM
荧光探针 10-30pM。
7.根据权利要求1或6所述的人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，其特征在于：正向引物的序列为CCCTCAGATGCTGCATATAAGCAGCTGCTTT；反向引物的序列为CCCTGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGATTTT，荧光探针的序列为FAM-CACTG-dR-[T(BHQ-1)]TTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTG-SpacerC3，其中荧光探针的标记方式为：5’端标记FAM，3’端标记SpacerC3，第5个碱基标记BHQ-1。
8.根据权利要求7所述的人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，其特征在于：荧光探针5’端标记的FAM荧光基团可被常用的其他荧光基团（如HEX、VIC、CY5等）替换。
9.根据权利要求1或6所述的人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，其特征在于：重组酶选自E.coli RecT蛋白；λ噬菌体β蛋白；啤酒酵母SepΙ/STPβ；啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STPα蛋白；粟酒裂殖酵母p140/Exoǁ蛋白以及RrpΙ、HPP-Ι、v-SEP、ICP8蛋白。
10.一种人类免疫缺陷病毒1型恒温检测试剂盒，包括将反应液、反应酶系与启动液混合，加入待检样本，在荧光定量PCR仪上进行恒温扩增，得到检测结果，其特征在于：恒温扩增的温度为35～42℃。
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