CN113234854A - 一种人类免疫缺陷病毒ⅰ型的可视化等温扩增检测引物及试剂盒 - Google Patents

一种人类免疫缺陷病毒ⅰ型的可视化等温扩增检测引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物分子检测技术领域，涉及一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增检测引物及试剂盒。发明通过设计与现有引物序列不同的内引物FIP和BIP、外引物F3和B3，并加入了2条成环引物LoopF和LoopB，大幅缩短了核酸扩增反应的时间，采用本发明设计的特异性引物，最佳反应温度为65℃恒温，最佳反应时间为30分钟，相比原有的核酸扩增反应所需时间至少缩短了一半以上。同时，基于本发明设计的6条引物，由于其具有高度的特异性，只需根据扩增反应产物有无即可对靶基因序列的存在与否作出判断，可以快速实现核酸检测，完全满足了当前HIV‑1核酸检测的需要。

Description

一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增检测引物及试 剂盒
技术领域
本发明属于生物分子检测技术领域，涉及一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增检测引物及试剂盒。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是诱发人获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)的主要病原体，在分类学上属于逆转录病毒科(Retroviridae)，慢病毒属(Lentivirus)。
近年来，国内外主要采用酶联免疫吸附法(ELISA)、PCR、细胞培养等方法检测HIV-1抗体或病毒。这些方法都不同程度的存在一些缺点。
如ELISA法操作程序较复杂，易造成假阳性和假阴性，并易造成操作者受害和环境污染，试验时间较长，需要两个小时以上才能得出检测结果。同时必须具备酶标仪和洗板机，这在基层实验室和小型门诊较难达到，且试验受温度等条件限制，给检测带来不便。
细胞培养是一种无菌操作技术，要求具备很高的实验工作环境和条件，例如无菌操作间、超净工作台等)；需要大量的实验设备，例如培养箱、离心机、显微镜等；需要大量的专业实验器材，实验技术复杂；需要有经验的技术人员操作，且实验周期很长，不适宜疾病的快速检测。凝集试验包括明胶颗粒(PA)和乳胶颗粒(LAT)属于半定量测定，需多次倍比稀释测定费试剂，且结果重复性差，且灵敏度低。
普通的PCR技术虽然在灵敏度和特异性方面有优势，但是在技术应用上也有几点限制：第一，PCR技术需要昂贵的实验仪器，同时仪器要具备精细的温度控制程序和加热模板，从而实现很高温度下的DNA模板的变性，较低的温度下引物探针退火延伸模板，这样重复温度变化几十个循环之后实现模板量的放大。第二，由于每一个循环时间都较短，仪器必须能快速准确升降温度，这就需要银制或金制的加热模块，加大仪器研制的成本。第三，在PCR循环中每一个循环引物退火的时间都很短(几秒到几十秒)这就要求PCR体系必须有过量的PCR引物。而过量的引物会与模板错配，错误引发扩增，引物二聚体等等，进而抑制PCR扩增，特别是在初始模板量低的情况会使这种现象加剧。
与传统PCR技术相比，等温扩增技术主要利用重组酶的活性，不进行核酸解链和退火即可在恒温条件下进行核酸的扩增，因此不需要昂贵的仪器，也避免了高温对酶的损耗。同时等温扩增技术在体系中不需要加入过量的引物，降低了引物与模板错配或生成引物二聚体的可能性。等温扩增技术日益受到重视。
常见的等温扩增技术有以下几种：滚环等温扩增(RCA)，环介导等温扩增(LAMP)，依赖解旋酶等温扩增(HDA)等。该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，借助具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，在恒等温条件下进行靶序列高效扩增，可合成109-1010个数量级的靶标DNA。该技术避免了常规PCR对循环温度的特殊要求，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。在众多等温扩增技术中，环介导等温扩增目前已在一定范围内得到了应用，并因其高效性、简易性、成本低廉且检测周期短等特点提升了它的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增检测引物。
本发明的再一目的是提供一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增检测试剂盒。
本发明的用于检测人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增引物包括以下引物：
上游内引物FIP：
5’CTTGTATTACTACTGCCCCTTCACGAYCCAATTTGGAAAGGACC3’
下游内引物BIP：
5’TGATATAAARGTAGTACCAAGAAGATTTTACAATCATCACCTGCCATC3’
上游外引物F3：5’GGTTTATTACAGGGACAGCA3’
下游外引物B3：5’ATCCTGTCTACTTGCCAC3’
加速上游环状引物LoopF：5’CTTTCCAGAGAAGCTTTGCT3’
加速下游环状引物LoopB：5’AGCAAAGATCATTAGGGATTAT3’。
根据本发明的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增检测试剂盒，包括以下引物：
上游内引物FIP：
5’CTTGTATTACTACTGCCCCTTCACGAYCCAATTTGGAAAGGACC3’
下游内引物BIP：
5’TGATATAAARGTAGTACCAAGAAGATTTTACAATCATCACCTGCCATC3’
上游外引物F3：5’GGTTTATTACAGGGACAGCA3’
下游外引物B3：5’ATCCTGTCTACTTGCCAC3’
加速上游环状引物LoopF：5’CTTTCCAGAGAAGCTTTGCT3’
加速下游环状引物LoopB：5’AGCAAAGATCATTAGGGATTAT3’。
根据本发明的检测待测样品是否感染人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的方法，其中，所述样品为人类血浆的RNA提取物，所述所述方法包括使用上述用于检测人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增引物组进行检测的步骤。
本发明检测方法容易操作，成本低廉，可广泛应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种快速、低成本、准确判断HIV-1感染的特异性方法，该方法具有操作便捷、无需特殊仪器、成本低廉的特点，不仅能为HIV-1患者的准确诊疗提供强有力的帮助，而且其检测效率高、成本低廉的特点也非常适合基层使用，具备大规模推广应用的条件。
(2)本发明通过设计与现有引物序列不同的内引物FIP和BIP、外引物F3和B3，并加入了2条成环引物LoopF和LoopB(有利于增加模板扩增的起点)，大幅缩短了核酸扩增反应的时间，试验表明：采用本发明设计的特异性引物，最佳反应温度为65℃恒温，最佳反应时间为30分钟，相比原有的核酸扩增反应所需时间至少缩短了一半以上。同时，基于本发明设计的6条引物，由于其具有高度的特异性，只需根据扩增反应产物有无即可对靶基因序列的存在与否作出判断，可以快速实现核酸检测，完全满足了当前HIV-1核酸检测的需要。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1显示本发明的具体实施例1的检测方法的LAMP实验结果；
图2显示本发明的具体实施例1的检测方法的扩增产物电泳实验结果；
图3显示本发明的LAMP引物组的灵敏性验证实验结果；
图4显示本发明的LAMP引物组的灵敏性验证实验电泳结果；
图5显示本发明的LAMP引物组的稳定性验证试验结果；
图6显示本发明的LAMP引物组的特异性验证试验结果，从上往下，第一管为HIV-1质粒组，第二管为HBV组，第三管为HIV-1RNA组，第四管为HCV组。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请具体实施例及相应的附图对本申请技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本发明的目的是要提供人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增检测试剂及其应用，缩短了检测时间，提高了特异性和敏感性，以及提高了操作的方便性、降低了成本。
本发明首先设计了6条引物，包括F3(正向外引物)、B3(反向外引物)、FIP(正向内引物)、BIP(反向内引物)、LoopF(成环引物)、LoopB(成环引物)，所有引物的序列分别如下：
上游内引物FIP：
5′CTTGTATTACTACTGCCCCTTCACGAYCCAATTTGGAAAGGACC 3′
下游内引物BIP：
5′TGATATAAARGTAGTACCAAGAAGATTTTACAATCATCACCTGCCATC3′
上游外引物F3：5′GGTTTATTACAGGGACAGCA3′
下游外引物B3：5′ATCCTGTCTACTTGCCAC3′
加速上游环状引物LoopF：5′CTTTCCAGAGAAGCTTTGCT3′
加速下游环状引物LoopB：5′AGCAAAGATCATTAGGGATTAT3′
根据本发明的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温检测试剂盒，包含上述引物组，还包含检测试剂。
优选的，所述检测试剂包括如下组分：10×反应缓冲液、dNTPs、Mg2+、Bst2.0 DNA聚合酶、去离子水、模板RNA和显色试剂。
所述试剂中Mg2+的浓度为8.0mmol·L-1。
所述试剂中dNTPs的浓度为2.0mmol·L-1；
所述试剂中显色试剂为酚红与甲酚红混合指示剂。
所述试剂还包括阳性对照。
本发明的检测试剂盒可以被用于如下任一种条件：
一、不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测人类免疫缺陷病毒Ⅰ型；
二、制备用于检测或辅助检测人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的产品；
三、不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测待测样品是否感染人类免疫缺陷病毒Ⅰ型；
四、制备用于检测或辅助检测待测样品是否感染人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的产品；
五、不以疾病的诊断和治疗为目的的检测待测病毒是否为人类免疫缺陷病毒Ⅰ型；
六、制备用于检测或辅助检测待测病毒是否为人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的产品。
根据本发明的具体实施方式，检测或辅助检测待测样品是否感染人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：
反应步骤：从待测血浆样品提取病毒RNA作为模板，采用上述任一项所述的检测试剂或上述的检测试剂盒进行环介导等温扩增，得到扩增产物；作为优选，所述环介导等温扩增的反应条件为：恒温65℃，反应30min；
确认步骤：按照下述任一方法确定待测样品是否感染人类免疫缺陷病毒Ⅰ型：
A、扩增产物呈现橙黄色则待测样品感染人类免疫缺陷病毒Ⅰ型；扩增产物呈现紫红色则待测样品未感染人类免疫缺陷病毒Ⅰ型；
B、将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带呈梯状分布，则待测样品感染人类免疫缺陷病毒Ⅰ型；仅有一条引物条带，则待测样品未感染人类免疫缺陷病毒Ⅰ型。
根据本发明的具体实施方式的检测或辅助检测待测病毒为人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：
反应步骤：从待测病毒中提取基因组DNA作为模板，采用上述任一项所述的检测试剂或上述的检测试剂盒进行环介导等温扩增，得到扩增产物；作为优选，所述环介导等温扩增的反应条件为：恒温65℃，反应30min；
确认步骤：按照下述任一方法确定待测病毒是否为人类免疫缺陷病毒Ⅰ型：
A、扩增产物呈现橙黄色则待测病毒是人类免疫缺陷病毒Ⅰ型；扩增产物呈现紫红色则待测病毒不是人类免疫缺陷病毒Ⅰ型；
B、将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带呈梯状分布，则待测动物病毒是人类免疫缺陷病毒Ⅰ型；仅有一条引物条带，则待测病毒不是人类免疫缺陷病毒Ⅰ型。
下面结合附图说明和实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
实施例1
LAMP反应体系的建立
20μL检测体系的HIV-1可视化等温扩增检测试剂盒包括如下组分：
Figure BDA0003020456440000071
Figure BDA0003020456440000081
其中，阳性对照为HIV-1样品RNA。
将上述组分混匀后放置于PCR仪内恒温65℃作用30min；反应结束后，可以将扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件为120V、30min；也可直接肉眼观察其颜色变色，两者判定结果一致。肉眼观察时，阳性结果显示为橙黄色，阴性结果显示为紫红色。
LAMP检测结果如图1、图2所示，实验组1为感染了HIV-1的患者血浆RNA提取物。实验组2为含有HIV-1片段的合成质粒，阴性对照为纯水。图1阳性对照和阴性对照分别显示了LAMP扩增结果的肉眼可观察，自然光下阳性管为橙黄色，而阴性管保持紫红色。
以临床上常见的另一种血浆病毒：HBV的DNA为检测对象，用HIV-1引物进行LAMP检测，来验证其反应的特异性，结果参见图1、图2的特异性对照组。
电泳结果显示只有HIV-1出现条带，HBV条带均未出现，说明以HBV病毒作为模板时没有阳性扩增，本发明设计的HIV-1LAMP引物具有高度的特异性。
实施例2
LAMP引物组的灵敏性和稳定性验证试验。
1.灵敏性验证试验：将已知浓度的HIV-1RNA样品以10倍梯度进行系列稀释,从3.86×103～3.86×106copies/mL区间取每一数量级的稀释液5μL作为扩增模板。试验条件同实例1。结果显示：在稀释液中HIV-1的RNA拷贝数为3.86×103copies/mL时依然能够看到明显的变色情况(见图3、图4)，证明LAMP法能够检测到的最低稀释度<3.86×103copies/mL(大约相当于检测最低限度为每个反应20个RNA拷贝量)，具有良好的灵敏度，每个反应都可最低检测到20个拷贝数RNA。
2.稳定性验证试验：分别在第0、5、10日、15日分别分装四组本发明提供的引物，于-20℃贮存。之后在第20日一起进行LAMP法扩增试验(试验方法和程序同实施例1)，比较同一组HIV-1RNA样品与四组引物进行LAMP试验的结果，判断引物稳定性。四组试验结果见图5。结果显示，不同贮存时间下的引物与HIV-1RNA进行LAMP反应产物均呈现黄橙色，证明本发明提供的引物组具有良好的稳定性。
实施例3
LAMP引物组特异性的进一步证明实验。
以临床上常见的另外两种血浆病毒为检测对象(包括DNA病毒HBV和RNA病毒HCV)。用HIV-1的引物组进行LAMP检测，来验证其反应的特异性，结果参见图6的HBV对照组和HCV对照组。
结果显示HBV对照组和HCV对照组均呈现紫红色，证明无扩增；而同样反应条件下的HIV-1质粒组和HIV-1RNA组均变为黄橙色，证明本发明引物组具有良好的特异性。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。
本发明通过设计与现有引物序列不同的内引物(FIP和BIP)、外引物(F3和B3)，并加入了2条成环引物(LoopF和LoopB)，不仅大幅缩短了核酸扩增反应的时间，而且能快速、有效地实现核酸检测。本发明能为HIV-1患者的准确诊疗提供强有力的帮助，而且其检测效率高、成本低廉的特点也非常适合基层使用，更适合大规模推广应用。
序列表
<110> 北京良芯生物科技发展有限公司
<120> 一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增检测引物及试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttgtattac tactgcccct tcacgaycca atttggaaag gacc 44
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgatataaar gtagtaccaa gaagatttta caatcatcac ctgccatc 48
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtttattac agggacagca 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atcctgtcta cttgccac 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctttccagag aagctttgct 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agcaaagatc attagggatt at 22

Claims (7)

1.用于检测人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增引物组，其特征在于，所述引物组包括以下引物：
上游内引物FIP：
5’CTTGTATTACTACTGCCCCTTCACGAYCCAATTTGGAAAGGACC3’
下游内引物BIP：
5’TGATATAAARGTAGTACCAAGAAGATTTTACAATCATCACCTGCCATC3’
上游外引物F3：5’GGTTTATTACAGGGACAGCA3’
下游外引物B3：5’ATCCTGTCTACTTGCCAC3’
加速上游环状引物LoopF：5’CTTTCCAGAGAAGCTTTGCT3’
加速下游环状引物LoopB：5’AGCAAAGATCATTAGGGATTAT3’。
2.一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增引物组，所述引物组包括以下引物：
上游内引物FIP：
5’CTTGTATTACTACTGCCCCTTCACGAYCCAATTTGGAAAGGACC3’
下游内引物BIP：
5’TGATATAAARGTAGTACCAAGAAGATTTTACAATCATCACCTGCCATC3’
上游外引物F3：5’GGTTTATTACAGGGACAGCA3’
下游外引物B3：5’ATCCTGTCTACTTGCCAC3’
加速上游环状引物LoopF：5’CTTTCCAGAGAAGCTTTGCT3’
加速下游环状引物LoopB：5’AGCAAAGATCATTAGGGATTAT3’。
3.根据权利要求2所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下试剂：10×反应缓冲液、dNTPs、Mg2+、DNA聚合酶、去离子水、模板RNA和显色试剂。
4.根据权利要求3所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增检测试剂盒，其特征在于，Mg2+的浓度为8.0mmol·L-1。
5.根据权利要求3所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述试剂中dNTPs的浓度为2.0mmol·L-1；所述显色试剂为酚红与甲酚红混合指示剂。
6.根据权利要求3所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照。
7.一种检测待测样品是否含有人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的方法，其特征在于，所述样品为人类血浆的RNA提取物，所述方法包括使用权利要求1所述用于检测人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的可视化等温扩增引物组进行检测的步骤。
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