CN114592094B - 一种特异性信号采集和输出一体化的核酸探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异性信号采集和输出一体化的核酸探针及其应用，该探针为采集和输出探针ETO，该采集和输出探针ETO由采集探针EP和输出探针OP构成；其中，所述采集探针EP包含一段能与哑铃状中间体的环状loop杂交的序列，用于信号采集，该哑铃状中间体的环状loop由LAMP引物与BstDNA聚合酶启动靶标核酸的复制而形成；所述输出探针OP包含一段G‑四链体序列，且OP的3’端为双脱氧或磷酸化处理的核苷酸，用于荧光信号输出。本发明的特异性信号采集和输出一体化的核酸等温检测系统SSEI，能够识别LAMP中的特异性扩增信号，该系统具有优异的抗背景核酸干扰性能。

Description

一种特异性信号采集和输出一体化的核酸探针及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于HBV检测的方法，具体涉及一种特异性信号采集和输出一体化的核酸探针及其应用。
背景技术
通常，临床样本是在规范可控的医学检验实验室里进行检测。然而，为了应对感染性疾病的暴发和资源短缺，发展快速、灵敏、低成本和可靠的检测方法仍然很急迫。众所周知，PCR是目前使用最为广泛的核酸检测技术，但是基于PCR的检测技术需要昂贵的设备，专业的实验室和技术人员，且耗时较长(2小时)。因此，为了简化操作并缩短反应时间，在近年来，许多等温扩增技术得以大力发展，例如指数式扩增(EXPAR)、链置换扩增(SDA)和环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。
LAMP是一种在恒温条件下、一个小时内、大量复制靶标核酸的扩增技术，由于其灵敏、快速和易操作的优点，LAMP被广泛应用于微生物检测。然而，在临床样本检测中，LAMP常常受非特异性扩增导致的假阳性的影响。与PCR使用两个引物相比，LAMP使用4至6条引物，这种相对复杂的引物设计会增加引物二聚体的形成概率或者引物与非靶标核酸的错配杂交，两者都会导致非特异性扩增，因此用传统的钙黄绿素、SYBR Green I或酚红等报告扩增信号，很难区分特异性和非特异性扩增产物，这个关键的技术瓶颈极大的限制了LAMP的临床应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性信号采集和输出一体化的核酸探针及其应用，解决了LAMP检测难以区分特异性和非特异性扩增产物的问题，通过构建LAMP中的特异性信号采集和输出策略来解决LAMP鉴别非特异性扩增的难题。
为了达到上述目的，本发明提供了一种特异性信号采集和输出一体化的核酸探针，该探针为采集和输出探针ETO(extract-to-outputprobe)，该采集和输出探针ETO由采集探针EP(extractprobe)和输出探针OP(outputprobe)构成，且采集探针EP的5’端部分与输出探针OP杂交；其中，所述采集探针EP包含一段能与哑铃状中间体的环状loop杂交的序列，用于信号采集，该哑铃状中间体的环状loop由LAMP引物与Bst DNA聚合酶启动靶标核酸的复制而形成；所述输出探针OP包含一段G-四链体序列，且OP的3’端为双脱氧或磷酸化处理的核苷酸，用于荧光信号输出。
优选地，G-四链体序列为TGGGTTGGGTAGGGCGGG。
本发明的另一目的是提供一种特异性信号采集和输出一体化的核酸等温检测系统(specific signal extract-to-output isothermal detection system，SSEI)，该等温检测系统中的探针为所述的特异性信号采集和输出一体化的探针。
优选地，该等温检测系统中含有LAMP扩增引物、特异性信号采集和输出探针ETO和Bst DNA聚合酶。
本发明的另一目的是提供一种用于HBV检测的特异性信号采集和输出一体化的探针，该探针为采集和输出探针ETO，该采集和输出探针ETO由采集探针EP和输出探针OP构成；其中，所述采集探针EP包含一段能与哑铃状中间体的环状loop杂交的序列，用于信号采集，该哑铃状中间体的环状loop由LAMP引物与Bst DNA聚合酶启动靶标核酸的复制而形成；所述输出探针OP包含一段G-四链体序列，且OP的3’端为双脱氧或磷酸化处理的核苷酸，用于荧光信号输出；所述输出探针OP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述采集探针EP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的另一目的是提供一种用于HBV检测的引物组，该引物组包含：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物FIP、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的引物BIP、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物F3、核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物B3。
本发明的另一目的是提供一种用于HBV检测的特异性信号采集和输出一体化的等温检测系统，该等温检测系统中的探针为所述的用于HBV检测的特异性信号采集和输出一体化的探针，引物为所述的用于HBV检测的引物组。
优选地，该等温检测系统中含有LAMP扩增引物、特异性信号采集和输出探针ETO和Bst DNA聚合酶。
本发明的另一目的是提供一种用于HBV检测的试剂盒，该试剂盒中的探针为所述的用于HBV检测的特异性信号采集和输出一体化的探针，引物为所述的用于HBV检测的引物组。
本发明的另一目的是提供一种用于HBV检测的特异性信号采集和输出一体化的检测方法，该方法采用所述的用于HBV检测的特异性信号采集和输出一体化的探针和所述的用于HBV检测的引物组进行检测。
本发明的特异性信号采集和输出一体化的核酸探针及其应用，解决了LAMP检测难以区分特异性和非特异性扩增产物的问题，具有以下优点：
本发明的特异性信号采集和输出一体化的核酸等温检测系统SSEI，能够识别LAMP中的特异性扩增信号，该系统具有优异的抗背景核酸干扰性能。本发明的SSEI是一步法检测技术，包含一个特定设计的核酸探针，可同时用于LAMP扩增中靶标信号的采集和输出，该探针可以识别LAMP中被称为哑铃状结构的中间产物(dumbbell-like structure)，通过一系列核酸延伸、链置换反应最终释放信号报告探针。在ETO探针的帮助下，SSEI可以检测低至10拷贝的靶标核酸。此外，本发明的检测技术已成功用于检测临床核酸样本中的乙肝病毒(HBV)。
本发明的SSEI检测临床样本中的靶标核酸速度约为40分钟，检测限可达10个拷贝/反应，可一步操作、荧光法检测靶标核酸，具有出色的灵敏度和抗干扰能力。此外，只需重新设计相应的引物和EP探针，SSEI便可以很容易的扩展到其他不同病原体的检测。因此，本发明的SSEI是一种操作简单、低仪器成本但可靠的检测策略。
附图说明
图1为本发明的SSEI的检测原理。
图2为本发明的ETO探针特异性识别能力分析；(A)FAM标记EP的ETO探针；(B)泳道1：仅含ETO探针；泳道2：匹配的ETO探针嵌入到了扩增产物；泳道3：无扩增(阴性)；泳道4：不匹配ETO探针不会参与扩增；靶标浓度：105拷贝/反应。
图3为本发明的SSEI用于荧光检测靶标DNA；(A)SSEI一步法荧光检测过程；(B)SSEI随pHBV(含有HBV S基因的质粒)浓度变化与阈值时间的关系。
图4为本发明的SSEI与其他检测临床样本方法的特异性比较。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例1扩增引物和ETO探针设计
如图1所示，为本发明的SSEI的检测原理，基于LAMP反应中，引物和Bst DNA聚合酶启动靶标核酸的合成，形成两端有茎-环(stem-loop)结构的哑铃状中间体。本发明的ETO探针是一个部分杂交的双链DNA：由采集探针(extract probe，EP)和输出探针(outputprobe，OP)构成。其中，EP包含一段能与loop杂交的序列，用于信号采集。OP包含一段G-四链体(图中波浪线)序列(TGGGTTGGGTAGGGCGGG)，用于荧光信号输出。需要注意的是，为了避免DNA聚合酶的延伸，OP在3’端为双脱氧或磷酸化处理的核苷酸(图中用圆标记)。
SSEI检测靶标核酸原理，具体如下：
(1)如果扩增引物(FIP、BIP、F3、B3)启动特异性扩增，LAMP将生成与靶标相关的哑铃型中间体(图1中的步骤1)；
(2)然后，ETO探针中的EP特异性识别loop序列(F1c和F2c之间的序列)，通过聚合酶延伸(图1中的步骤2和步骤3)形成互补链；
(3)随后，其中引物FIP将结合到F1和F2c的序列上，启动聚合酶诱导的DNA链置换反应，释放EP形成的延伸链(图1中的步骤4和步骤5)，该延伸链包含序列B1c和B1，所以它可以形成发夹结构并自延伸(self-templated DNAsynthesis reaction)释放OP(图1中的步骤6)；
(4)然后，OP中G-四链体序列在缓冲液中钾离子帮助下，形成笼状结构(图1中的步骤7)，笼状结构捕获反应体系中的硫磺素T(ThT)，随后产生强的荧光(图1中的步骤8)。
SSEI检测靶标核酸中，如果发生非特异性扩增或无扩增，ETO探针可以保持结构稳定，不释放荧光信号，保证体系的特异性。
实验例2SSEI检测在HBV检测中的实际应用
1、引物设计
设计SSEI所需的LAMP引物，如下表1所示。
表1针对HBV检测为SSEI设计的扩增引物和探针序列
2、构建靶标DNA
将质粒(pHBV)作为靶标DNA，质粒(pHBV)含有HBV的S基因HE652606.1，长度为600bp，从GenBank数据库中获取HBV基因的序列信息，S基因经合成后插入pUC57质粒中，从而构建质粒pHBV。质粒DNA浓度用Multiskan Go微孔板分光光度计(Thermo Scientific,MA,USA)测定。
pHBV DNA拷贝数的计算公式如下：
DNA拷贝数＝(ng×6.02×1023×10-9)/(片段长度×660)
式中，ng表示DNA模板的加入量，单位为纳克；片段长度的单位为bp(base pair)。
3、ETO探针的靶标特异性识别能力
根据图1的反应原理，ETO探针准确识别与靶标相关的哑铃状结构产物是SSEI技术成功的关键。为了验证，设计了如下不匹配的EP序列(5’端修饰一个荧光基团FAM)，并在表1中的EP的5’端修饰一个荧光基团(FAM)，在靶标核酸存在的情况下，匹配的ETO探针(由表1中的匹配的EP和OP构成)完全参与反应，且匹配的EP嵌入到扩增产物中，不匹配的ETO探针没有参与反应。
设计不匹配的EP，其序列(5’端至3’端)如下(SEQ ID NO.7)：
CCCGCCCTACCCAACCCAAAAAAAAAAAAATTTCCTAATTAACGTTACCTAC。
验证试验的过程，具体如下：
将2μL 105拷贝/反应的质粒核酸样本(即前述构建的靶标DNA)加入含有Bst2.0WarmStart DNA聚合酶(200U/mL)、dNTP(1.2mM)、预先退火的FAM修饰的ETO探针(与靶标匹配或者不匹配，0.5μM，EP和OP比例为1：1)、FIP(0.8μM)、BIP(0.8μM)、F3(0.1μM)和B3(0.1μM)的18μL Tris-HCl缓冲液中(缓冲液包含：50mM KCl、10mM(NH4)2SO4、8mM MgSO4和0.1％Tween-20，pH＝8.8)。
在64℃下反应，由罗氏LightCycler 96System记录(检测格式：FAM；激发波长：470nm；检测波长：514nm)。
凝胶电泳表征过程为：天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，将扩增反应产物与6倍上样缓冲液混合，取5μL分别加入聚丙烯酰胺凝胶(10％，V/V％，Acr/Bis＝29:1)的电泳中。凝胶在150V下在1倍TBE缓冲液中室温下电泳30分钟，然后由Fusion Fx vilber lourmat成像系统(vilber Co.)扫描成像。
结果如下：
如图2的B所示，为凝胶电泳分析结果，在靶标核酸存在的情况下，泳道2中匹配的ETO探针完全参与反应，且EP嵌入到扩增产物中，泳道4可以看出不匹配的ETO探针没有参与反应，这些结果表明ETO探针对靶标核酸具有特异性，可以有效地识别靶标特异性信号。
4、SSEI检测靶标DNA的能力
进一步地，使用硫磺素T来验证SSEI荧光检测的可行性，具体过程如下：
将2μL不同浓度的质粒核酸样本(即前述构建的靶标DNA)加入含有硫磺素T(ThT，15μM)、Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶(200U/mL)、dNTP(1.2mM)、预先退火的匹配的ETO探针(0.5Μm，EP和OP比例为1：1)、FIP(0.8μM)、BIP(0.8μM)、F3(0.1μM)和B3(0.1μM)的18μLTris-HCl缓冲液中(缓冲液包含：50mM KCl、10mM(NH4)2SO4、8mM MgSO4和0.1％Tween-20，pH＝8.8)。
在64℃下反应，由罗氏LightCycler 96System记录(检测格式：FAM；激发波长：470nm；检测波长：514nm)。
结果如下：
如图3的A所示，首先所有的扩增成分添加到PCR管中，然后将靶标DNA(pHBV)加入试管中，置于恒温荧光检测器(或荧光定量PCR仪)中监测荧光信号的变化。
如图3的B所示，实时荧光分析pHBV检测结果：在无pHBV时，即使120分钟后，SSEI系统也没有任何荧光信号增加；在有pHBV时，SSEI的阈值时间随着pHBV的降低而增加，大约40分钟可以检测低至10拷贝/反应的靶标DNA。
5、SSEI特异性检测的抗干扰的能力以及与现有方法对比
利用SSEI检测含有不同病毒HBV、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、EB病毒(Epstein-Barr病毒)、单纯疱疹病毒(HSV)的临床样本，进一步测试其抵抗背景核酸干扰的能力。
(1)临床标本制备
收集HBV、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、EB病毒(Epstein-Barr病毒)、单纯疱疹病毒(HSV)的临床样本，提取样本的核酸。
血样在100℃变性10分钟释放HBV样本中的DNA，然后离心(12000rpm，10分钟)，收集上清液。采集核酸后，采用临床批准的乙型肝炎病毒DNA诊断试剂盒(厦门安普利生物科技有限公司)，根据厂家说明书，确认标本感染情况(HBV阳性或HBV阴性)。其他病毒样品根据各自的临床试剂盒要求进行操作和制备。
(2)SSEI、LAMP、PCR实验
SSEI实验过程，具体如下：
将2μL不同病毒的临床核酸样本加入含有硫磺素T(ThT，15μM)、Bst 2.0WarmStartDNA聚合酶(200U/mL)、dNTP(1.2mM)、预先退火的匹配的ETO探针(0.5μM，EP和OP比例为1：1)、FIP(0.8μM)、BIP(0.8μM)、F3(0.1μM)和B3(0.1μM)的18μL Tris-HCl缓冲液中(缓冲液包含：50mM KCl、10mM(NH4)2SO4、8mM MgSO4和0.1％Tween-20，pH＝8.8)。
在64℃下反应，由罗氏LightCycler 96System记录(检测格式：FAM；激发波长：470nm；检测波长：514nm)。
LAMP实验过程，具体如下：
将2μL不同病毒的临床核酸样本加入含有Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶(200U/mL)、dNTP(1.2mM)、FIP(0.8μM)、BIP(0.8μM)、F3(0.1μM)、B3(0.1μM)的18μLTris-HCl缓冲液中(缓冲液包含50mM KCl，10mM(NH4)2SO4，8mM MgSO4和0.1％Tween-20，pH 8.8)。
在64℃下反应，由罗氏LightCycler 96System记录(检测格式：FAM；激发波长：470nm；检测波长：514nm)。
PCR实验过程，具体如下：
根据试剂盒制造商的说明(SuperRealPreMix，天根生物技术，北京)进行。在罗氏LightCycler 96系统中进行，先95℃退火5分钟，然后热循环(45个循环，90分钟)，每个循环分别在95℃反应30秒，55℃反应45秒和72℃反应45秒，最后在72℃延伸5分钟。
结果如下：
如图4所示，SSEI检测结果显示：只有HBV阳性有扩增曲线，其它病毒没有扩增曲线。此外，对比图4的A、B、C，LAMP和PCR的非特异性扩增曲线分别出现在60分钟和28个循环以后，表面本发明的SSEI对临床样品检测具有良好的选择性和抗干扰能力。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序 列 表
<110> 川北医学院
<120> 一种特异性信号采集和输出一体化的核酸探针及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccgcagacac atccagcgat aatctccagt cactcaccaa cc 42
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tcttcctctg catcctgctg caaacgggca acataccttg a 41
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gccaaaattc gcagtccca 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
cctaatctcc tcccccaaga 20
<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cccgccctac ccaacccaaa aaaaaaaaaa ccaggacaaa ttggaggaca ac 52
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
tttttttttt tttgggttgg gtagggcggg 30
<210> 7
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
cccgccctac ccaacccaaa aaaaaaaaaa tttcctaatt aacgttacct ac 52

Claims (4)

1.一种用于HBV检测的特异性信号采集和输出一体化的核酸探针，其特征在于，该探针为采集和输出探针ETO，该采集和输出探针ETO由采集探针EP和输出探针OP构成，且采集探针EP的5’端部分与输出探针OP杂交；其中，所述采集探针EP包含一段能与哑铃状中间体的环状loop杂交的序列，用于信号采集，该哑铃状中间体的环状loop由LAMP引物与Bst DNA聚合酶启动靶标核酸的复制而形成；所述输出探针OP包含一段G-四链体序列，且OP的3’端为双脱氧或磷酸化处理的核苷酸，用于荧光信号输出；
所述输出探针OP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述采集探针EP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述G-四链体序列为TGGGTTGGGTAGGGCGGG。
2.一种用于HBV检测的特异性信号采集和输出一体化的等温检测系统，其特征在于，该等温检测系统中的探针为如权利要求1所述的用于HBV检测的特异性信号采集和输出一体化的探针，LAMP扩增引物为用于HBV检测的引物组，该引物组包含：核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示的引物FIP、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的引物BIP、核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示的引物F3、核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物B3。
3.根据权利要求2所述的等温检测系统，其特征在于，该等温检测系统中含有LAMP扩增引物、特异性信号采集和输出探针ETO和Bst DNA聚合酶。
4.一种用于HBV检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中的探针为如权利要求1所述的用于HBV检测的特异性信号采集和输出一体化的探针，引物为如权利要求2中所述的引物组。
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