CN113481285A - 一种等温扩增的核酸检测实验方法 - Google Patents

一种等温扩增的核酸检测实验方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种等温扩增的核酸检测实验方法，采用四条扩增引物来进行靶DNA的第一次等温扩增；并基于杂交链式反应原理设计两条探针；这两条探针可以将信号提取‑转换探针的特异信号进行第二次放大；此外，这两条探针和转换探针触发器(Trigger)的3’‑端进行过磷酸化处理；本发明由信号提取—转换探针耦合的两个扩增反应组成，转换探针能提取特异性信号，并在高温下触发杂交链式反应进行第二次信号放大，通过特异性信号提取、转换和放大机制，突破常规等温检测技术特异性差的瓶颈问题，构建核酸特异性、超灵敏扩增体系，将核酸扩增中的特异性信号进行提取、筛选、转换和放大，从而大大提高检测的特异性和灵敏度。

Description

一种等温扩增的核酸检测实验方法
技术领域
本发明涉及核酸检测实验技术领域，尤其涉及一种等温扩增的核酸检测实验方法。
背景技术
在生命科学应用中，核酸扩增和基因克隆的灵敏度和特异性尤为重要，特别是涉及病原体检测和防控，核酸检测过程中，非特异性扩增会产生核酸噪音，为了防止噪音产物的生成，研究人员已经开发了许多方法，例如向反应中加入热启动酶、新的碱基配对策略、热激活引物或修饰过后的dNTPs以及其他化学添加剂；
现有的等温扩增技术如环介导等温扩增(LAMP)，灵敏度高于PCR，设备成本低，但非特异性扩增的抑制和鉴别一直是行业难题，LAMP是一项能够在恒温条件下快速扩增靶标核酸的技术，此方法在恒温条件下(如60℃)一小时内即可完成核酸的大量扩增，不仅设备要求低(如恒温水浴锅、恒温金属浴)，而且灵敏度相比于普通的PCR提高了10倍，接近巢式PCR(nested PCR)，LAMP灵敏度高但扩增剧烈，容易发生非特异性扩增即假阳性，临床诊断的可靠性难以保障，并且目前常规采用的结果判读方式难以鉴别，因此，本发明提出一种等温扩增的核酸检测实验方法以解决现有技术中存在的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提出一种等温扩增的核酸检测实验方法，该等温扩增的核酸检测实验方法由信号提取—转换探针耦合的两个扩增反应组成，信号提取—转换探针能提取特异性信号并触发高温杂交链式反应进行第二次信号放大，通过特异性信号提取、转换和放大机制突破等温检测的技术瓶颈，构建核酸超灵敏、特异性扩增体系。
为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案实现：一种等温扩增的核酸检测实验方法，包括以下步骤：
步骤一、设计LAMP引物，采用LAMP等温扩增技术扩增靶DNA，信号提取-转换探针能特异性地提取信号，并触发高温杂交链式反应进行第二次信号放大，基于高温杂交链式反应的原理来设计探针H1和H2，H1和H2可以将转换探针的触发器Trigger的特异信号进行二次放大；
步骤二、将信号提取-转换探针的触发器Trigger、H1和H2的3’-端进行磷酸化处理，阻止DNA聚合酶将它们延伸；
步骤三、利用LAMP产生的哑铃状中间体，转换探针作为特异性信号提取器与哑铃状中间体杂交，并进一步在DNA聚合酶的催化下延伸形成一条互补链；
步骤四、转换探针与哑铃状结构杂交，并启动链置换延伸，转换探针的延伸链自发形成发夹结构，该发卡结构进行自延伸从而替换出转换探针的触发器Trigger；
步骤五、替换出的转换探针触发器Trigger与H1的粘性末端杂交，打开H1的发夹结构来启动高温杂交链式反应；
步骤六、利用新暴露出的H1的粘性末端打开H2的发夹结构并暴露H2的粘性末端，连续消耗H1和H2以形成线性长链，从而产生FAM荧光。
进一步改进在于：所述步骤一中设计LAMP引物包括FIP、BIP、F3和B3，采用LAMP等温扩增技术扩增靶DNA为第一次信号放大，所述步骤一中的LAMP的反应机理主要是能够形成一个过渡态的具有两个单链环状结构的哑铃状产物，这种具有靶标特异性和高灵敏度的特殊结构是连接第二次信号放大的关键，第二次信号放大即高温杂交链式反应。
进一步改进在于：所述步骤一种所述的信号提取-转换探针是一个部分互补的双链DNA，由提取探针EP和触发器Trigger组成，其中提取探针EP通过与LAMP哑铃状中间产物的单链环状结构结合来提取特异性扩增信号，触发器能够在特异性扩增发生后实时输出特异性信号，并启动高温杂交链式反应。
进一步改进在于：所述提取探针EP又分为两个部分，一是信号提取序列，能够结合特异性的环状区域，二是结合触发器的序列，使不同靶标的检测可以有通用性，以提升高温链式自组装耦合等温扩增的核酸检测方法的通用性。
进一步改进在于：所述步骤二中的H2作为信号报告单元，带有荧光基团和淬灭基团。
进一步改进在于：所述步骤四中扩增引物FIP与哑铃状结构上杂交的两个端部分别为F1和F2c。
进一步改进在于：所述步骤六中暴露的H2的粘性末端与信号提取-转换探针的触发器Trigger的序列相同
本发明的有益效果为：本发明由信号提取—转换探针耦合的两个扩增反应组成，信号提取—转换探针能提取特异性信号并触发高温杂交链式反应进行第二次信号放大，通过特异性信号提取、转换和放大机制突破等温检测的技术瓶颈，构建核酸超灵敏、特异性扩增体系，将核酸扩增中的特异性信号进行提取、筛选、转换和放大，具有提高检测的特异性和灵敏度。
附图说明
图1为本发明信号提取—转换探针、引物和高温杂交链式反应的信号放大探针结构示意图。
图2为本发明特异性信号提取、转换和放大的反应机理图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例1
根据图1、2所示，本实施例提供了一种等温扩增的核酸检测实验方法，包括以下步骤：
步骤一、采用FIP、BIP、F3和B3四条扩增引物作为LAMP的引物来扩增靶DNA，并基于高温杂交链式反应原理设计H1和H2探针；H1和H2可以将信号提取-转换探针的触发器(Trigger)携带的特异信号进行二次放大；其中LAMP的反应机理主要是能够形成一个过渡态的具有两个单链环状结构的哑铃状产物，这种具有特异性的结构是连接第二次信号放大的关键，第二次信号放大即高温杂交链式反应；
其中信号提取转换探针是一个部分互补的双链DNA，由提取探针(EP)和触发器(Trigger)部分组成，其中提取探针通过与LAMP的环状区结合来提取特异性信息，触发器能够在特异性扩增发生后实时输出特异性信号并启动高温杂交链式反应，所述提取探针又分为两个部分，一是信号提取序列，能够结合特异性的环状区域；二是结合触发器序列，使不同的靶标检测可以通用，以提升高温链式自组装耦合等温扩增的核酸检测方法的通用性；
步骤二、将信号提取-转换探针的触发器Trigger、H1和H2的一端进行磷酸化处理，阻止DNA聚合酶将其延伸，其中H2作为信号报告单元，修饰有荧光基团和和淬灭基团；
步骤三、启动LAMP后，使其形成哑铃状结构，将信号提取-转换探针作为特异性信号提取器与哑铃状结构的LAMP的环状区杂交，且被DNA聚合酶延伸形成一条互补链；
步骤四、将扩增引物FIP与哑铃状结构上的两个端部杂交并启动链置换延伸，其中扩增引物FIP与哑铃状结构上杂交的两个端部分别为F1和F2c，释放转换探针的提取探针部的延伸链形成发夹结构，进行自延伸从而替换出转换探针的触发器；
步骤五、将替换出的转换探针触发器与H1的粘性末端杂交，打开H1的发夹结构来启动高温杂交链式反应；
步骤六、利用新暴露出的H1的粘性末端打开H2的发夹结构并暴露H2的粘性末端，连续消耗H1和H2以形成线性长链，产生FAM荧光。
实施例2
以HPV16为靶标进行了如下实验，对方案的原理和操作的可行性都进行了充分验证。在此基础上进行了HPV16，HPV18，HPV58临床核酸样品检测。
信号提取—转换探针中EP提取信号的原理：
为了更好地理解信号提取—转换探针的信号提取过程，采用FAM标记的EP做了一系列延伸对比实验，以验证其是否只在LAMP进行期间高效、特异性地延伸。在LAMP反应开始前，向其中加入含有与靶标匹配的EP的信号提取—转换探针，可以在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中观察到大量带荧光的扩增产物；而在EP不匹配的情况下，没有观察到荧光产物；而延迟添加EP则产物量减少，这说明信号提取—转换探针的添加时机不对。实验表明：含有与靶标匹配的EP的信号提取—转换探针可以有效地提取扩增过程中的特异性信息；而不匹配的EP不能参与扩增，说明信号提取—转换探针与靶标特异性相关；LAMP形成的哑铃状结构是动态变化的，这种结构的量在扩增后大幅减少，该现象也揭示了信号提取—转换探针参与反应体系的时机。这些实验结果表明信号提取—转换探针能高效工作且具有良好的特异性。
本实验中匹配的EP核酸序列：
5’-FAM-CCATCAAACCGAAGCTGCCGCTATATATCCTGTCGCACGGAAAATAAACTGTAAATCATATTCCTCC-3’
不匹配的EP核酸序列：
5’-FAM-CCATCAAACCGAAGCTGCCGCTATATATCCTGTCGCACGGGGTAATCCATATTTTAGGGTTCCTG-3’
高温杂交链式反应的热稳定性研究及HAI反应条件的优化：
作为一种多功能的DNA信号放大系统，杂交链式反应(HCR)能特异性识别并放大单链核酸信号，但这种反应体系通常在室温下进行。为了与第一个等温扩增反应LAMP耦连，设计信号提取—转换探针在高温下释放触发器Trigger，然后实时引发高温杂交链式反应。在高温(如60℃)情况下，H1和H2的茎(stem)长度对发夹结构的稳定性十分重要。因此，通过改变发夹结构茎的长短【18、25和30对碱基(base pair，bp)】，对H1和H2的热稳定性进行了优化。琼脂糖凝胶电泳分析证实发现，当茎的长度为30bp时，60℃下是最稳定的，而当茎的长度为18bp和25bp时，发夹结构不够稳定，导致即使没有Trigger也会触发自组装反应生成分子量大小不一的自组装产物。在优化HAI反应温度时考虑以下几个问题：(1)Bst DNA聚合酶参与反应的最佳温度在50-70℃左右；(2)较低的温度会降低LAMP的特异性，延迟出峰时间(threshold time)；(3)高温会影响H1和H2茎的稳定性。因此，设置了56-64℃范围内的一系列温度梯度，发现最佳温度为60℃：在该温度下，整个体系既能保持较高的扩增效率，也能提供良好的信噪比。后续实验将在这些优化后的条件下进行。
HAI快速检测靶标DNA：
为了证明可行性，首先进行了HAI检测pHPV16试验，并与传统荧光LAMP进行对照。从实验中，可以注意到HAI和LAMP几乎是同时出峰，这表明HAI和LAMP的检测速度一样快。虽然作为一锅法检测系统的HAI包含等温扩增和高温杂交链式反应两个扩增步骤。HAI和LAMP输出的信号是通过不同机制产生的，HAI是通过分子信标，LAMP是通过荧光染料。但是，这些结果表明HAI的两个扩增系统并不会延长检测时间，因为高温杂交链式反应能实时采集和放大转换探针在进行等温扩增时释放的特异性信号(Trigger)。
Table2.Results ofcervical samples detectedwith SEA.
Figure BDA0003154663330000081
此外，在没有靶标存在的情况下，即使过了很长时间，HAI也不会产生明显的荧光增强，而LAMP在65分钟后就显示出非特异性的荧光信号。这些结果表明HAI比LAMP有更高的特异性，有望在此基础上提高灵敏度。据实验数据看出HAI的出峰时间取决于靶标数量，HAI可以检测到单数量级拷贝数的靶标DNA(5个拷贝)。相反，LAMP无法区分低拷贝数和背景噪音，只能有效检测100个拷贝以上的靶DNA。这些结果表明，HAI比LAMP更加灵敏。此外，还进行了琼脂糖凝胶电泳分析，证实这两种信号扩增体系(LAMP和高温杂交链式反应)是独立工作的，彼此干扰很小。值得一提的是，如果在一锅法体系中加入逆转录酶，HAI还具有检测RNA(如SARS-CoV-2病毒)的潜力。
与LAMP和PCR相比，HAI检测具有更强的抗背景干扰能力：
为了研究HAI对背景DNA(临床样本一般为2-8ng/μL)的抗干扰能力，在HAI和LAMP检测中加入不同浓度的人类基因组DNA。结果表明，HAI可以有效检测含有20ng/μL背景DNA样本中的靶标，而LAMP可以有效检测含有5ng/μL背景DNA下的靶标。此外，还用临床样本评估了HAI的特异性，包括HPV16，人类疱疹病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和大肠杆菌DNA(ECD)。这些样本用HAI分析后，再与采用SYBRGreen I输出信号的PCR和LAMP相比较。LAMP和PCR分别在37个循环和60min后出现非特异性扩增曲线，但HAI却没有产生任何非特异性信号。实验结果表明HAI可以准确检测出HPV16，而LAMP和PCR检测HPV16会出现误诊情况。这意味着HAI在临床样品检测中具有良好的选择性。
将HAI用于HPV检测并进行基因分型检测：
HPV是导致宫颈癌的关键因素，有一百多种亚型，其中HPV16、HPV18和HPV58致癌率最高。近年来，HPV筛查越来越受到人们的关注。由于HAI的高灵敏度和特异性，将这种“一锅法”策略应用于HPV临床样本的检测和亚型分析。用刷子收集宫颈上皮细胞，然后将其煮沸，释放核酸；将煮沸的上清液转移到PCR管中，然后用HAI进行分析。在检测HPV16时，采用经临床批准的人乳头瘤病毒DNA基因分型诊断试剂盒(GDK)作为对照，收集8例HPV16阳性样本和8例HPV阴性样本进行分析。结果显示HAI检测结果与GDK检测结果完全一致，这证实了HAI在临床样本诊断中的可靠性和准确性。此外，为了证明HAI具有对HPV进行基因分型的能力，在设计相应的基因分型的引物和EP序列后，使用HAI对其进行检测。结果表明，与GDK一致，HAI能够准确识别临床样本中的各种HPV亚型，甚至能够识别包含多种HPV亚型的样本。这些实验结果表明“一锅法”检测系统在临床诊断中具有简单、快速、准确、特异性强和灵敏度高的特点。
该等温扩增的核酸检测实验方法由信号提取—转换探针耦合的两个扩增反应组成，信号提取—转换探针能提取特异性信号并触发高温杂交链式反应进行第二次信号放大，通过特异性信号提取、转换和放大机制突破等温检测的技术瓶颈，构建核酸超灵敏、特异性扩增体系，将核酸扩增中的特异性信号进行提取、筛选、转换和放大，具有提高检测的特异性和灵敏度。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种等温扩增的核酸检测实验方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、设计LAMP引物，采用LAMP等温扩增技术扩增靶DNA，信号提取-转换探针能特异性地提取信号，并触发高温杂交链式反应进行第二次信号放大，基于高温杂交链式反应的原理来设计探针H1和H2，H1和H2可以将转换探针的触发器Trigger的特异信号进行二次放大；
步骤二、将信号提取-转换探针的触发器Trigger、H1和H2的3’-端进行磷酸化处理，阻止DNA聚合酶将它们延伸；
步骤三、利用LAMP产生的哑铃状中间体，转换探针作为特异性信号提取器与哑铃状中间体杂交，并进一步在DNA聚合酶的催化下延伸形成一条互补链；
步骤四、转换探针与哑铃状结构杂交，并启动链置换延伸，转换探针的延伸链自发形成发夹结构，该发卡结构进行自延伸从而替换出转换探针的触发器Trigger；
步骤五、替换出的转换探针触发器Trigger与H1的粘性末端杂交，打开H1的发夹结构来启动高温杂交链式反应；
步骤六、利用新暴露出的H1的粘性末端打开H2的发夹结构并暴露H2的粘性末端，连续消耗H1和H2以形成线性长链，从而产生FAM荧光。
2.根据权利要求1所述的一种等温扩增的核酸检测实验方法，其特征在于：所述步骤一中设计LAMP引物包括FIP、BIP、F3和B3，采用LAMP等温扩增技术扩增靶DNA为第一次信号放大，所述步骤一中的LAMP的反应机理主要是能够形成一个过渡态的具有两个单链环状结构的哑铃状产物，这种具有靶标特异性和高灵敏度的特殊结构是连接第二次信号放大的关键，第二次信号放大即高温杂交链式反应。
3.根据权利要求1所述的一种等温扩增的核酸检测实验方法，其特征在于：所述步骤一种所述的信号提取-转换探针是一个部分互补的双链DNA，由提取探针EP和触发器Trigger组成，其中提取探针EP通过与LAMP哑铃状中间产物的单链环状结构结合来提取特异性扩增信号，触发器能够在特异性扩增发生后实时输出特异性信号，并启动高温杂交链式反应。
4.根据权利要求3所述的一种等温扩增的核酸检测实验方法，其特征在于：所述提取探针又分为两个部分，一是信号提取序列，能够结合特异性的环状区域，二是结合触发器序列，使不同靶标的检测可以有通用性，以提升高温链式自组装耦合等温扩增的核酸检测方法的通用性。
5.根据权利要求1所述的一种等温扩增的核酸检测实验方法，其特征在于：所述步骤二中的H2作为信号报告单元，带有荧光基团和淬灭基团。
6.根据权利要求1所述的一种等温扩增的核酸检测实验方法，其特征在于：所述步骤四中扩增引物FIP与哑铃状结构上杂交的两个端部分别为F1和F2c。
7.根据权利要求1所述的一种等温扩增的核酸检测实验方法，其特征在于：所述步骤六中暴露的H2的粘性末端与信号提取-转换探针的触发器Trigger序列相同。
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