CN109679948B - 一种用于游离dna亚硫酸氢盐转化的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于游离DNA亚硫酸氢盐转化的试剂盒，包括亚硫酸氢盐溶液、保护液、洗液A、磁珠悬浮液、洗液B、洗液C和洗脱液，保护液由以下组分组成：四氢呋喃糠醇80％～85％，D‑α‑生育酚酸聚乙二醇1000琥珀酸10％～15％，乙酸四氢糖酯0.2％～0.3％，乙氧基黄叱精0.05％～0.1％，余量为水。本发明还提供了利用该试剂盒进行游离DNA亚硫酸氢盐转化及纯化DNA的方法。本发明对亚硫酸盐转化方法进行了大幅技术改进，使ctDNA转化能够在温和条件下(70～80℃)条件下快速(40～60分钟)完成，能够稳定体系pH并防止ctDNA降解，能够快速得到高转化率、高质量、高纯度的游离DNA，有利于甲基化研究的全自动化操作。

Description

一种用于游离DNA亚硫酸氢盐转化的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于游离DNA亚硫酸氢盐转化的试剂盒，属于基因检测技术领域。

背景技术

表观遗传学研究领域是近几年里众多生物学研究方向中发展最为迅速的一门学科，是经典遗传学的补充和进一步的发展，在人体细胞中被研究的最充分的表观遗传学现象就是DNA的甲基化。DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶将甲基基团转移到DNA中的碱基上，脊椎动物中常见的是胞嘧啶，即5-甲基胞嘧啶。哺乳动物中DNA甲基化是必不可少的DNA修饰，几乎所有的甲基化胞嘧啶均发生在CpG位点，CpG岛的胞嘧啶的DNA甲基化在生物过程比如细胞分化和发育中起着重要的作用。另外，异常甲基化是恶性肿瘤的一个标志，并在致癌过程中发挥关键作用，一些DNA甲基化生物标志物已用在肿瘤的预测、诊断和筛选上，所以甲基化是目前肿瘤研究的一个热点。近些年来，以循环肿瘤DNA检测为代表的液体活检技术得到了很好的研究和发展，它可以在很大程度上克服肿瘤组织取材困难，以及肿瘤异质性的问题。目前液体活检的甲基化检测已应用于肿瘤早筛，前景非常广阔。

5-甲基胞嘧啶不能直接通过常规的分子生物学方法检测，因为PCR或者克隆的系统中不包含甲基转移酶，DNA甲基化信息在扩增的过程中丢失。因此，几乎所有的序列特异性的DNA甲基化分析技术在进行PCR或者杂交之前都依赖于DNA亚硫酸盐转化处理。DNA经亚硫酸盐预处理后,重亚硫酸盐对未甲基化的胞胞嘧啶的脱氨基的速度要远高于5-甲基胞嘧啶，非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不受亚硫酸盐影响,保持不变。亚硫酸盐将表观遗传学事件转化为基因组的变化,通过区分后者就可间接判断样品中的胞嘧啶甲基化与否。

重亚硫酸盐转化需要苛刻的化学条件才能将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，而苛刻的化学条件会导致DNA降解，所以在转化效率、DNA稳定性、操作时间、DNA产量等方面，要想达到一个最佳的平衡，不是一件容易的事情。目前市面上大部分的亚硫酸盐转化试剂盒仍然采用传统的氢氧化钠变性、亚硫酸盐高温转化及脱磺酸基和脱盐。但是长时间的高温低pH处理会导致DNA的严重降解。对于含量极低(不高于1％)、片段极短(平均160bp)且本身极易降解(血液中平均半衰期2h)的循环肿瘤DNA，降解将会更加严重，导致无法进行后续的相关操作，因此目前鲜有能够用于游离DNA亚硫酸氢盐转化的试剂盒。

发明内容

针对上述现有技术，基于目前液体活检的甲基化检测火热发展趋势，本发明提供了一种用于游离DNA亚硫酸氢盐转化的试剂盒。本发明对亚硫酸盐转化方法进行了大幅技术改进，使ctDNA转化能够在温和条件下(70～80℃)条件下快速(40～60分钟)完成，转化过程中加入了保护液，能够稳定体系pH并防止ctDNA降解，并采用磁珠法对转化ctDNA进行纯化，能够快速得到高转化率、高质量、高纯度的游离DNA，有利于甲基化研究的全自动化操作，用于后续分子生物学研究，尤其临床分子诊断。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于游离DNA亚硫酸氢盐转化的试剂盒，包括亚硫酸氢盐溶液、保护液、洗液A、磁珠悬浮液、洗液B、洗液C和洗脱液，其中，

所述亚硫酸氢盐溶液，由以下组分组成，各组分按重量百分数计：亚硫酸氢铵50％，亚硫酸氢钠2％～6％，一水合亚硫酸铵1％～3％，TritionX-100 0.5％～1％，余量为水，pH值在5.3～5.6。由于亚硫酸氢盐对氧气十分敏感，因此目前市面上大部分商品化试剂盒HSO₃ ^-的浓度为5～6M，本发明克服技术难题，提供了一种HSO₃ ^-浓度为8M的亚硫酸氢盐溶液，这能够显著加速转化反应速率，缩短反应时间。

所述保护液，由以下组分组成，各组分按重量百分数计：四氢呋喃糠醇80％～85％，D-α-生育酚酸聚乙二醇1000琥珀酸(TPGS)10％～15％，乙酸四氢糖酯0.2％～0.3％，乙氧基黄叱精0.05％～0.1％，余量为水。本法明中的D-α-生育酚酸聚乙二醇1000琥珀酸，较市面上常用的喹诺二甲基丙烯酸酯，溶解性更佳且价格更低，有利于大量工业化生产。乙氧基黄叱精作为pH指示剂，可以全程检测反应体系pH值，当反应体系pH低于5.0时，会由正常的黄褐色变为红色，可根据颜色来判断反应状态是否处在最佳pH范围内，能够实时监控转化反应的效率。

所述洗液A，由以下组分组成，各组分按重量百分数计：异硫氰酸胍20％～25％，TritionX-100 10％～15％，1,2-丙二醇3％～5％，乙二醇乙醚乙酸酯0.2％～0.4％，乙醇35％～37％，三羟甲基氨基甲烷0.5％～1％，余量为水。

所述磁珠悬浮液，为50mg/ml的纳米磁性颗粒的水悬浮液；所述磁性颗粒为超顺四氧化三铁颗粒或超顺三氧化二铁颗粒，且外表由表面修饰有羟基的二氧化硅包被。该纳米磁性颗粒可通过市场常规购买得到。

所述洗液B，由氢氧化钠、乙醇和水组成，其中，氢氧化钠的浓度为0.3mol/L，乙醇的浓度为75％～80％(体积分数)。

所述洗液C为75％～80％的乙醇溶液(体积分数)。

所述洗脱液为10mM的Tris-HCl缓冲液，pH 8.0。

一种游离DNA亚硫酸氢盐转化及纯化DNA的方法，利用上述试剂盒，包括以下步骤：

(一)DNA重亚硫酸盐转化：向含有90～100微升DNA溶液的离心管中加入150微升亚硫酸氢盐溶液和30微升保护液，涡旋混匀，短暂离心，70～80℃下恒温孵育40～60分钟(将离心管置于恒温振荡器中，不要振荡)；孵育结束后，短暂离心；

(二)亚硫酸盐转化的DNA纯化：

(1)向离心管中依次加入1～1.5mL洗液A、25～30μl磁珠悬浮液(新鲜悬浮)，涡旋混匀；

注意：充分混匀磁珠是试验成功的关键因素，磁珠数目的差异将产生错误结果；为了确保磁珠浓度均匀，移液前用涡旋混匀器充分混匀磁珠至瓶底无明显沉淀物；同时在移液过程中，也要保证磁珠的均匀悬浮；

(2)将离心管置于恒温振荡器中，在23℃、转速1000～1100rpm条件下孵育45～60分钟；短暂离心，将离心管置于磁力管架2～3分钟，用一次性移液管尽量去除液体；

(3)将离心管从磁力架上取下，加入800～1000μl洗液A，涡旋混匀重悬磁珠，短暂离心，将离心管置于磁力管2～3分钟。用一次性移液管尽量去除液体；

(4)将离心管从磁力架上取下，加入600～700μl洗液B，涡旋混匀重悬磁珠，将离心管置于恒温振荡器中，在23℃、转速1000～1100rpm条件下孵育5～7分钟；将离心管置于磁力管2～3分钟，用一次性移液管尽量去除液体；

(5)将离心管从磁力架上取下，加入800～1000μl洗液C，涡旋混匀重悬磁珠，短暂离心，将离心管置于磁力架2～3分钟，用一次性移液管尽量去除液体；

(6)将离心管从磁力架上取下，加入400～500μl洗液C，涡旋混匀重悬磁珠，短暂离心，将离心管置于磁力架2～3分钟，用一次性移液管尽量去除液体；

(7)将离心管从磁力架上取下，短暂离心，将离心管置于磁力架2～3分钟，用移液器(10～100μl)尽量除去残余液体；将离心管置于磁力架上，室温静置3～5分钟待磁珠干燥(打开离心管管盖，不要震荡)；

(8)将离心管从磁力架上取下，加入60～80μl洗脱液，轻轻涡旋混匀重悬磁珠；将离心管放入恒温振荡器中，在25℃、1000rpm条件下孵育10分钟；短暂离心，将离心管置于磁力架2～3分钟，将60～80μl洗脱液转移至新的1.5mL低吸附离心管中，即得纯化的DNA溶液。

本发明的游离DNA亚硫酸氢盐转化及纯化DNA的方法，具有以下优点：

(1)亚硫酸盐转化由传统的过夜缩短为40～60分钟，避免了DNA降解的同时大大缩短了操作时间(传统的DNA亚硫酸氢盐转化需要过夜，以确保完全转化并且排除假阳性结果，但是过长的反应时间会导致DNA的剧烈降解)。

(2)亚硫酸氢盐转化在70～80℃温和恒定反应温度下进行，有效降低了DNA的降解(传统亚硫酸盐转化需要一个热循环的过程，这个热循环至少二轮热尖峰使反应温度升高到94～96℃，反复的高温处理，DNA的降解速率也提高)。

(3)Hayatsu(2014)等研究表明亚硫酸氢盐转化反应最佳pH范围为5.0～5.6，本发明保护液中含有pH指示剂乙氧基黄叱精，可根据颜色来判断反应状态是否处在最佳pH范围内，能够实时监控转化反应的效率。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：采用本发明的方法处理10个结直肠癌患者血液ctDNA样品和后续septin9基因甲基化特异性PCR电泳检测图；其中，泳道M：脱氧核糖核酸分子量标准(TaKaRa，500bpDNA Ladder)。泳道1～10：以使用本发明的方法处理的10个结直肠癌患者血液ctDNA为模板，以按照转化后的septin9基因序列设计的引物为引物进行的甲基化特异性PCR扩增的产物。

图2：采用本发明的方法与Qiagen商品化试剂盒方法转化20例正常人cfDNA的ACTB基因实时荧光PCR检测图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

下述所用磁力架，为DynaMag^TM-2磁性试管架。

实施例1用于游离DNA亚硫酸氢盐转化的试剂盒

所述试剂盒，包括了以下组分：亚硫酸氢盐溶液、保护液、洗液A、磁珠悬浮液、洗液B、洗液C和洗脱液。

所述亚硫酸氢盐溶液，由以下组分组成，各组分按重量百分数计：亚硫酸氢铵50％，亚硫酸氢钠4％，一水合亚硫酸铵2％，TritionX-100 0.8％，余量为水，pH值在5.3～5.6。

所述保护液，由以下组分组成，各组分按重量百分数计：四氢呋喃糠醇83％，D-α-生育酚酸聚乙二醇1000琥珀酸(TPGS)12％，乙酸四氢糖酯0.25％，乙氧基黄叱精0.08％，余量为水。

所述洗液A，由以下组分组成，各组分按重量百分数计：异硫氰酸胍22％，TritionX-10013％，1,2-丙二醇4％，乙二醇乙醚乙酸酯0.3％，乙醇36％，三羟甲基氨基甲烷0.8％，余量为水。

所述磁珠悬浮液，为50mg/ml的纳米磁性颗粒的水悬浮液；所述磁性颗粒为超顺四氧化三铁颗粒或超顺三氧化二铁颗粒，且外表由表面修饰有羟基的二氧化硅包被。

所述洗液B，由氢氧化钠、乙醇和水组成，其中，氢氧化钠的浓度为0.3mol/L，乙醇的浓度为75％(体积分数)。

所述洗液C为75％的乙醇溶液(体积分数)。

所述洗脱液为10mM的Tris-HCl缓冲液，pH 8.0。

实验1游离DNA亚硫酸氢盐转化及纯化DNA

利用结直肠癌患者血液样本验证本发明的试剂盒是否能在极短的转化反应时间内完成转化，具体如下(实验中所用的试剂盒同实施例1)。

1.10例正常人血液样本游离DNA的提取

1.1血浆样本的制备

离心装有全血的采血管12分钟，离心力1350±150rcf。从离心机中取出采血管，用一个干净的一次性移液管把血浆转移到聚丙烯材质、圆锥底的15ml离心管中。

离心血浆12分钟，离心力1350±150rcf。用新的一次性移液管或者血清移液管将3.5ml血浆移入标记好的圆锥底的离心管中。

1.2游离DNA的提取

本次实验采用康为磁珠法游离DNA提取试剂盒(CW2522S)进行游离DNA的提取，步骤参照试剂盒说明书进行，具体如下：

(1)向15ml离心管中加入120μl Proteinase K、3.5mL血浆、4.2mL Buffer MPL和100μl Magbeads ZN。

(2)将离心管中速涡旋震荡混匀15s后放于56℃水浴10分钟，期间涡旋混匀3次，每次30sec。

(3)将离心管从水浴中取出，之后置于轮状旋转混匀器上，室温中速(大约10-15rpm)旋转15分钟，旋转角度大约35-45°。

(4)将离心管放于磁力架上静置3分钟，小心倒掉上清(注意不要倒掉磁珠，倒掉上清时保持15ml离心管放置于磁性试管架上)。

(5)把离心管从磁力架上取下，向离心管中加入1.5mL Buffer CW1，低速涡旋混匀确保磁珠彻底重悬(避免起泡)，用一次性移液管将磁珠悬浮液移至标记好的2.0ml离心管中；之后将离心管上下颠倒混匀30s，短暂离心离心管，将离心管放于磁力架上静置2分钟，弃去溶液。

(6)向离心管中加入1.5mL Buffer GW2(使用前请检查是否已加入无水乙醇)，之后将离心管涡旋震荡1分钟，短暂离心离心管，将离心管放于磁力架上静置2分钟，之后弃去溶液。

(7)短暂离心离心管，将离心管放于磁力架上静置2分钟，用10-100μl移液器尽量除去残余液体。

(8)保持离心管固定于磁力架上静置5分钟，使乙醇充分挥发。

(9)向离心管中加入103μl Buffer EB，置于恒温振荡器中，转速设为1000rpm，温度设为56℃，震荡10分钟。

(10)将离心管放于磁力架上静置2分钟，之后将100μl洗脱液转移至新的2.0ml离心管中。

2.游离DNA的亚硫酸氢盐转化

向含有编号1-10的100微升DNA溶液的2mL离心管中分别加入150微升亚硫酸氢盐溶液和30微升保护液，涡旋混匀，短暂离心，其中1-3号样本75℃下恒温孵育40分钟，4-6号样本75℃下恒温孵育50分钟，7-10号样本75℃下恒温孵育60分钟(将离心管置于恒温振荡器中，不要振荡)；孵育结束后，立即取出离心管，短暂离心。

3.亚硫酸氢盐转化的DNA纯化：

(1)向离心管中依次加入1mL洗液A、30μl磁珠悬浮液(新鲜悬浮)，涡旋混匀。

注意：充分混匀磁珠是试验成功的关键因素，磁珠数目的差异将产生错误结果；为了确保磁珠浓度均匀，移液前用涡旋混匀器充分混匀磁珠至瓶底无明显沉淀物；同时在移液过程中，也要保证磁珠的均匀悬浮。

(2)将离心管置于恒温振荡器中，在23℃、转速1000rpm条件下孵育45分钟；短暂离心，将离心管置于磁力管架2分钟，用一次性移液管尽量去除液体。

(3)将离心管从磁力架上取下，加入1000μl洗液A，涡旋混匀重悬磁珠，短暂离心，将离心管置于磁力管2分钟。用一次性移液管尽量去除液体。

(4)将离心管从磁力架上取下，加入700μl洗液B，涡旋混匀重悬磁珠，将离心管置于恒温振荡器中，在23℃、转速1000rpm条件下孵育7分钟；将离心管置于磁力管2分钟，用一次性移液管尽量去除液体。

(5)将离心管从磁力架上取下，加入1000μl洗液C，涡旋混匀重悬磁珠，短暂离心，将离心管置于磁力架2分钟，用一次性移液管尽量去除液体。

(6)将离心管从磁力架上取下，加入500μl洗液C，涡旋混匀重悬磁珠，短暂离心，将离心管置于磁力架2分钟，用一次性移液管尽量去除液体。

(7)将离心管从磁力架上取下，短暂离心，将离心管置于磁力架2分钟，用移液器(10～100μl)尽量除去残余液体；将离心管置于磁力架上，室温静置5分钟待磁珠干燥(打开离心管管盖，不要震荡)。

(8)将离心管从磁力架上取下，加入60μl洗脱液，轻轻涡旋混匀重悬磁珠；将离心管放入恒温振荡器中，在25℃、1000rpm条件下孵育10分钟；短暂离心，将离心管置于磁力架2分钟，将全部洗脱液转移至新的1.5mL低吸附离心管中，即得纯化的DNA溶液。

4.PCR设置

根据反应样本量，融化1管PCR反应液(包含引物、dNTP、Buffer)。涡旋混匀PCR反应液10-15秒，短暂离心，按照表1所示的反应体系，配制混合液，每个总反应体积为20μL。其中纯化水和酶配制混合液，模板分别加入，酶使用的是TaKaRa R007A TaqHS。PCR程序如表2所示。

PCR反应结束后，取5μL的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。如果样本游离DNA没有得到有效的转化，则甲基化的胞嘧啶不会高效转化成尿嘧啶，导致后续PCR不会出现任何扩增条带。本实验中所有样本孔均得到一条大小约为120bp的单一清晰条带并且没有拖尾(如图1所示)，说明所有样本孔都进行了有效的扩增。可见10例样本游离DNA都得到了有效的转化，证明本发明在40-60分钟内可以快速实现DNA的亚硫酸氢盐转化。

表1 反应体系

表2 PCR程序

实验2 利用Qiagen试剂盒验证本发明试剂盒的转化效率

凯杰(Qiagen)公司的EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kits(货号59824)是业界公认的对胞嘧啶转化率超过99％的试剂盒，本试剂盒以其作为对照进行转化效率的验证。

实验选取了20例正常人血液样本，游离DNA提取根据实验1的技术方案，本发明试剂盒亚硫酸氢盐转化及DNA纯化均根据实例1的技术方案，Qiagen试剂盒严格按照试剂盒说明书进行操作，然后对转化后的DNA的ACTB基因进行荧光定量PCR检测，实验重复3次。

PCR设置如下：

(1)PCR反应体系如表3所示。其中，PCR反应液包含有引物、dNTP、Buffer和探针，酶使用的是TaKaRa EpiTaq^TM HS(for bisulfite-treated DNA)。

表3

组分	体积
		PCR反应液	20.6μL
酶(Polymerase)	0.6μL
		纯化水	8.8μL
样本ctDNA	30μL
		总体积	60μL

(2)PCR程序设置：将96孔板放入PCR仪样品槽中，点击仪器软件开始设置反应程序。本次PCR过程使用Applied Biosystems 7500 PCR仪，参数设置如下：选择FAM(ReporterDye：FAM Quencher Dye:none)，扩增温度参数设置如表4所示。

表4

注：X代表荧光收集阶段。

(3)结果分析：从图2扩增曲线看到，所有样本孔均在FAM通道得到标准的S型扩增曲线，说明都产生了有效扩增。随后对,两组结果进行统计学t-检验(结果如表5所示)，分析得到两组结果无显著差异，说明本试剂盒的转化效率与Qiagen试剂盒相当。

表5

实施例2用于游离DNA亚硫酸氢盐转化的试剂盒

所述试剂盒，包括了以下组分：亚硫酸氢盐溶液、保护液、洗液A、磁珠悬浮液、洗液B、洗液C和洗脱液。

所述亚硫酸氢盐溶液，由以下组分组成，各组分按重量百分数计：亚硫酸氢铵50％，亚硫酸氢钠2％，一水合亚硫酸铵3％，TritionX-100 0.5％，余量为水，pH值在5.3～5.6。

所述保护液，由以下组分组成，各组分按重量百分数计：四氢呋喃糠醇80％，D-α-生育酚酸聚乙二醇1000琥珀酸(TPGS)15％，乙酸四氢糖酯0.2％，乙氧基黄叱精0.1％，余量为水。

所述洗液A，由以下组分组成，各组分按重量百分数计：异硫氰酸胍20％，TritionX-10015％，1,2-丙二醇3％，乙二醇乙醚乙酸酯0.4％，乙醇35％，三羟甲基氨基甲烷1％，余量为水。

所述磁珠悬浮液，为50mg/ml的纳米磁性颗粒的水悬浮液；所述磁性颗粒为超顺四氧化三铁颗粒或超顺三氧化二铁颗粒，且外表由表面修饰有羟基的二氧化硅包被。

所述洗液B，由氢氧化钠、乙醇和水组成，其中，氢氧化钠的浓度为0.3mol/L，乙醇的浓度为80％(体积分数)。

所述洗液C为80％的乙醇溶液(体积分数)。

所述洗脱液为10mM的Tris-HCl缓冲液，pH 8.0。

实施例3用于游离DNA亚硫酸氢盐转化的试剂盒

所述试剂盒，包括了以下组分：亚硫酸氢盐溶液、保护液、洗液A、磁珠悬浮液、洗液B、洗液C和洗脱液。

所述亚硫酸氢盐溶液，由以下组分组成，各组分按重量百分数计：亚硫酸氢铵50％，亚硫酸氢钠6％，一水合亚硫酸铵1％，TritionX-100 1％，余量为水，pH值在5.3～5.6。

所述保护液，由以下组分组成，各组分按重量百分数计：四氢呋喃糠醇85％，D-α-生育酚酸聚乙二醇1000琥珀酸(TPGS)10％，乙酸四氢糖酯0.3％，乙氧基黄叱精0.05％，余量为水。

所述洗液A，由以下组分组成，各组分按重量百分数计：异硫氰酸胍25％，TritionX-10010％，1,2-丙二醇5％，乙二醇乙醚乙酸酯0.2％，乙醇37％，三羟甲基氨基甲烷0.5％，余量为水。

所述磁珠悬浮液，为50mg/ml的纳米磁性颗粒的水悬浮液；所述磁性颗粒为超顺四氧化三铁颗粒或超顺三氧化二铁颗粒，且外表由表面修饰有羟基的二氧化硅包被。

所述洗液B，由氢氧化钠、乙醇和水组成，其中，氢氧化钠的浓度为0.3mol/L，乙醇的浓度为78％(体积分数)。

所述洗液C为78％的乙醇溶液(体积分数)。

所述洗脱液为10mM的Tris-HCl缓冲液，pH 8.0。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

Claims (6)

1.一种用于游离DNA亚硫酸氢盐转化的试剂盒，其特征在于：包括亚硫酸氢盐溶液、保护液、洗液A、磁珠悬浮液、洗液B、洗液C和洗脱液，其中，

所述亚硫酸氢盐溶液，由以下组分组成，各组分按重量百分数计：亚硫酸氢铵50％，亚硫酸氢钠2％～6％，一水合亚硫酸铵1％～3％，TritionX-100 0.5％～1％，余量为水，pH值在5.3～5.6；

所述保护液，由以下组分组成，各组分按重量百分数计：四氢呋喃糠醇80％～85％，D-α-生育酚酸聚乙二醇1000琥珀酸10％～15％，乙酸四氢糖酯0.2％～0.3％，乙氧基黄叱精0.05％～0.1％，余量为水；

所述洗液A，由以下组分组成，各组分按重量百分数计：异硫氰酸胍20％～25％，TritionX-100 10％～15％，1,2-丙二醇3％～5％，乙二醇乙醚乙酸酯0.2％～0.4％，乙醇35％～37％，三羟甲基氨基甲烷0.5％～1％，余量为水；

所述磁珠悬浮液，为50mg/ml的纳米磁性颗粒的水悬浮液；所述磁性颗粒为超顺四氧化三铁颗粒或超顺三氧化二铁颗粒，且外表由表面修饰有羟基的二氧化硅包被；

所述洗液B，由氢氧化钠、乙醇和水组成，其中，氢氧化钠的浓度为0.3mol/L，乙醇的浓度为75％～80％；

所述洗液C为75％～80％的乙醇溶液；

所述洗脱液为10mM的Tris-HCl缓冲液，pH 8.0。

2.根据权利要求1所述的用于游离DNA亚硫酸氢盐转化的试剂盒，其特征在于：所述亚硫酸氢盐溶液，由以下组分组成，各组分按重量百分数计：亚硫酸氢铵50％，亚硫酸氢钠4％，一水合亚硫酸铵2％，TritionX-100 0.8％，余量为水，pH值在5.3～5.6；

所述保护液，由以下组分组成，各组分按重量百分数计：四氢呋喃糠醇83％，D-α-生育酚酸聚乙二醇1000琥珀酸(TPGS)12％，乙酸四氢糖酯0.25％，乙氧基黄叱精0.08％，余量为水；

所述洗液A，由以下组分组成，各组分按重量百分数计：异硫氰酸胍22％，TritionX-10013％，1,2-丙二醇4％，乙二醇乙醚乙酸酯0.3％，乙醇36％，三羟甲基氨基甲烷0.8％，余量为水；

所述磁珠悬浮液，为50mg/ml的纳米磁性颗粒的水悬浮液；所述磁性颗粒为超顺四氧化三铁颗粒或超顺三氧化二铁颗粒，且外表由表面修饰有羟基的二氧化硅包被；

所述洗液B，由氢氧化钠、乙醇和水组成，其中，氢氧化钠的浓度为0.3mol/L，乙醇的浓度为75％；

所述洗液C为75％的乙醇溶液；

所述洗脱液为10mM的Tris-HCl缓冲液，pH 8.0。

3.利用权利要求1或2所述的用于游离DNA亚硫酸氢盐转化的试剂盒进行游离DNA亚硫酸氢盐转化及纯化DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(一)DNA重亚硫酸盐转化：向含有90～100微升DNA溶液的离心管中加入150微升亚硫酸氢盐溶液和30微升保护液，涡旋混匀，短暂离心，70～80℃下恒温孵育40～60分钟；孵育结束后，短暂离心；

(二)亚硫酸盐转化的DNA纯化：

(1)向离心管中依次加入1～1.5mL洗液A、25～30μl磁珠悬浮液，涡旋混匀；

(2)将离心管置于恒温振荡器中，在23℃、转速1000～1100rpm条件下孵育45～60分钟；短暂离心，将离心管置于磁力管架2～3分钟，用移液管尽量去除液体；

(3)将离心管从磁力架上取下，加入800～1000μl洗液A，涡旋混匀重悬磁珠，短暂离心，将离心管置于磁力管2～3分钟， 用移液管尽量去除液体；

(4)将离心管从磁力架上取下，加入600～700μl洗液B，涡旋混匀重悬磁珠，将离心管置于恒温振荡器中，在23℃、转速1000～1100rpm条件下孵育5～7分钟；将离心管置于磁力管2～3分钟，用移液管尽量去除液体；

(5)将离心管从磁力架上取下，加入800～1000μl洗液C，涡旋混匀重悬磁珠，短暂离心，将离心管置于磁力架2～3分钟，用移液管尽量去除液体；

(6)将离心管从磁力架上取下，加入400～500μl洗液C，涡旋混匀重悬磁珠，短暂离心，将离心管置于磁力架2～3分钟，用移液管尽量去除液体；

(7)将离心管从磁力架上取下，短暂离心，将离心管置于磁力架2～3分钟，用移液器尽量除去残余液体；将离心管置于磁力架上，室温静置3～5分钟待磁珠干燥；

(8)将离心管从磁力架上取下，加入60～80μl洗脱液，轻轻涡旋混匀重悬磁珠；将离心管放入恒温振荡器中，在25℃、1000rpm条件下孵育10分钟；短暂离心，将离心管置于磁力架2～3分钟，将洗脱液转移至新离心管中，即得纯化的DNA溶液。

4.根据权利要求3所述的游离DNA亚硫酸氢盐转化及纯化DNA的方法，其特征在于：所述步骤(一)中，恒温孵育时，将离心管置于恒温振荡器中，不要振荡。

5.根据权利要求3所述的游离DNA亚硫酸氢盐转化及纯化DNA的方法，其特征在于：所述步骤(二)中，磁珠悬浮液为新鲜制备的磁珠悬浮液。

6.根据权利要求3～5中任一项所述的游离DNA亚硫酸氢盐转化及纯化DNA的方法，其特征在于：步骤如下：

(一)游离DNA的亚硫酸氢盐转化：向含有100微升DNA溶液的2mL离心管中分别加入150微升亚硫酸氢盐溶液和30微升保护液，涡旋混匀，短暂离心，75℃下恒温孵育60分钟；孵育结束后，立即取出离心管，短暂离心；

(二)亚硫酸氢盐转化的DNA纯化

(1)向离心管中依次加入1mL洗液A、30μl磁珠悬浮液，涡旋混匀；

(2)将离心管置于恒温振荡器中，在23℃、转速1000rpm条件下孵育45分钟；短暂离心，将离心管置于磁力管架2分钟，用一次性移液管尽量去除液体；

(3)将离心管从磁力架上取下，加入1000μl洗液A，涡旋混匀重悬磁珠，短暂离心，将离心管置于磁力管2分钟， 用一次性移液管尽量去除液体；

(4)将离心管从磁力架上取下，加入700μl洗液B，涡旋混匀重悬磁珠，将离心管置于恒温振荡器中，在23℃、转速1000rpm条件下孵育7分钟；将离心管置于磁力管2分钟，用一次性移液管尽量去除液体；

(5)将离心管从磁力架上取下，加入1000μl洗液C，涡旋混匀重悬磁珠，短暂离心，将离心管置于磁力架2分钟，用一次性移液管尽量去除液体；

(6)将离心管从磁力架上取下，加入500μl洗液C，涡旋混匀重悬磁珠，短暂离心，将离心管置于磁力架2分钟，用一次性移液管尽量去除液体；

(7)将离心管从磁力架上取下，短暂离心，将离心管置于磁力架2分钟，用移液器尽量除去残余液体；将离心管置于磁力架上，室温静置5分钟待磁珠干燥，不要震荡；

(8)将离心管从磁力架上取下，加入60μl洗脱液，轻轻涡旋混匀重悬磁珠；将离心管放入恒温振荡器中，在25℃、1000rpm条件下孵育10分钟；短暂离心，将离心管置于磁力架2分钟，将全部洗脱液转移至新的1.5mL低吸附离心管中，即得纯化的DNA溶液。

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