CN114350811A - 一种成人脑胶质瘤分子分型NGS panel及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种成人胶质瘤分子分型panel，该panel基于二代测序技术设计，针对IDH1、IDH2、CDKN2A、CDKN2B、TERT、EGFR、H3F3A、chr7/chr10、1p/19q、ATRX、TP53、HIST1H3B、HIST1H3C、BRAF等基因的全外显子区域及启动子区域进行检测，制作成本较低、覆盖涉及基因可有效对成人胶质瘤进行分型诊断和预后评估，具有广阔的应用前景。

Description

一种成人脑胶质瘤分子分型NGS panel及其应用

技术领域

本发明涉及医学检测领域，具体涉及利用一种成人脑胶质瘤分子分型NGS panel及其应用。

背景技术

二代测序(Next-generation sequencing，NGS)又称为高通量测序(High-throughput sequencing)，是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。是对于传统的一代sanger测序的一次创新。二代测序已经成为目前肿瘤基因检测的主要检测技术。与其他检测技术相比，优势明显：

1.检测范围广：传统的Sanger测序仅限于检测基因的错义突变和小插入和缺失。而对于一些大片段缺失如胶质瘤的EGFRVIII突变涉及的2-7号外显子的缺失的检测是无法检测的。而NGS技术在探针设计和生信流程搭建过程中进行一定的部署，可以检测这些大片段缺失。

2.检测费用低：NGS检测技术可以设计一款探针，该款探针可以涵盖多个基因，可以一个平台一次检测多个基因，不涉及多个平台、多次测序，节约成本。

3.测序通量大：二代测序最显著的特征是高通量,一次性能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序。

脑胶质瘤是神经外科最常见的原发性颅内恶性肿瘤，呈浸润性生长，侵袭性强，极易复发，严重影响患者的生存期和生存质量。胶质瘤最早根据肿瘤的组织形态学分类进行分型，可以分为少突胶质细胞瘤、星形细胞瘤等各个亚型。而随着分子生物学与分子遗传学技术在包括胶质瘤的各类肿瘤研究中的应用，已发现一系列对诊断、鉴别诊断及指导分子靶向治疗有实用价值的生物学标志，并根据生物学标志的不同，初步提出了胶质瘤的分子分型。

2016年版世界卫生组织(WHO)中枢神经系统肿瘤分类首次在组织学病理的基础上使用分子病理来进行胶质瘤分类，胶质瘤也正式进入分子诊断时代。在2016年WHO中枢神经系统分类中推荐胶质瘤检测如IDH、1p/19q、H3F3A等分子标志物，根据检测的分子标志物进行分子分型(图一)。而由于这些分子标志物的纳入也出现了一些新的分子亚型，对胶质瘤患者进行更精准分型。随后中国也推出了关于胶质瘤的共识—《2018年胶质瘤诊疗规范》。提出了分子诊断在胶质瘤分型中的应用。

随着对胶质瘤的进一步研究，胶质瘤的更多分子标志物被发现，新的指南也对胶质瘤进行新推荐。cIMPACT-NOW更新以及2021版WHO中枢神经系统肿瘤分类中也是根据胶质瘤的研究提出新的分子标志物检测推荐，同时根据这些新的分子标志物对原有的胶质瘤分型提出了一定的改变，在2021版WHO中枢神经系统肿瘤分类和cIMPACT-NOW更新5中提出IDH突变型的星形细胞瘤作为一个独立亚型，但会根据微血管增生和坏死以及CDKN2A/B纯合缺失进行分级(WHO 2，3，4级)；在2021版WHO中枢神经系统肿瘤分类和cIMPACT-NOW更新3中提出IDH野生型的成人弥漫性星形细胞瘤根据分子特征(TERT启动子突变、EGFR扩增，7号染色体扩增联合10号染色体缺失)的单变异或共变异可以直接分为IDH野生型的胶质母细胞瘤。

对于指南共识推荐检测的胶质瘤的分子标志物可以通过多种不同的技术进行检测。但都具有一定的弊端：

1.预后评估局限性：目前已经有文献研究表明不同位点的IDH突变的预后不同，尤其在星形细胞瘤中IDH(R132H)突变较其他位点突变预后更好。但IDH基因的免疫组化抗体目前只有针对IDH1(R132H)位点，不能检测IDH1(R132S)、IDH2(R172)等位点，这对于胶质瘤的预后评估就会具有一定的局限性。

2.投入成本高：对于指南推荐检测的基因具有不同的检测技术，不同的检测技术需要运用不同的试验器材、设备、试剂，总体投入成本过高。

3.浪费样本量：不同的检测平台需要的不同的样本量，多个技术平台检测的总样本量较大，对于患者的样本量造成一定的浪费。

基于2016年WHO中枢神经系统肿瘤分类中胶质瘤推荐检测基因和文献中报道的胶质瘤预后相关分子标志物开发一款胶质瘤中型panel，基于该panel检测的分子结果与胶质瘤病理诊断结果比较分析发现，大部分患者的病理诊断结果与分子检测结果相符，但也出现部分患者的分子诊断结果不明，如对于胶质母细胞瘤患者约有24％的患者未检出分子标志物(TERT基因启动子突变、EGFR基因扩增)。所以对于胶质瘤尤其是胶质母细胞瘤患者基于现有panel仍然无法进行精准分型，评估预后。

发明内容

为了弥补现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种可对成人脑胶质瘤进行精准分型及预后评估的panel，更为具体的，本发明提供如下的技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种基于二代测序技术的成人脑胶质瘤分子分型panel，其中，所述panel针对IDH1、IDH2、CDKN2A、CDKN2B、TERT、EGFR、H3F3A、chr7/chr10、1p/19q、ATRX、TP53、HIST1H3B、HIST1H3C、BRAF2等基因的全外显子区域及启动子区域进行检测。

在一种实施方式中，所述panel包括用于检测上述基因的探针序列。

本发明的第二个方面，提供一种用于成人脑胶质瘤预后评估的试剂盒，所述试剂盒包括上述panel。

本发明的第三个方面，提供一种上述成人脑胶质瘤分子分型panel在用于制备诊断成人脑胶质瘤分子分型的产品中的应用。

本发明的第四个方面，提供一种上述成人脑胶质瘤分子分型panel在用于制备成人脑胶质瘤预后评估的产品中的应用。

在一种实施方式中，上述产品为试剂盒。

本发明相对于现有技术获得了如下有益的技术效果：

1.本发明所提供的Panel针对检测的基因是基于指南推荐以及通过大量文献筛选，结合现有胶质瘤panel的缺陷筛选获得的，仅针对14个基因进行检测即可实现对成人脑胶质瘤的精准分型，在保障高精准度的同时最大化降低检测成本；

2.本发明所提供的Panel中加入了可用于评估预后效果的基因位点，在检测患者肿瘤分型的同时可对其预后效果进行评估，为肿瘤治疗策略的制定提供依据。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明panel检测流程图；

图2为基于NGS检测分析结果利用R语言软件绘制的不同亚型胶质瘤人群分布图；

图3为利用本发明panel检测的星形细胞瘤病例的IDH分型。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1候选基因的筛选

为了更好的对胶质瘤患者进行分子分型，评估预后，基于指南推荐以及现有胶质瘤panel的缺陷，结合文献，选择如下基因设计胶质瘤NGS panel检测试剂盒，该panel包括胶质瘤相关基因如下表1所示。

表1

实施例2利用成人胶质瘤NGS panel对样品的检测方法

收集来自华山医院的129例具有病理报告的临检样本(少突胶质细胞瘤n＝26；星形细胞瘤n＝27；胶质母细胞瘤n＝68；弥漫中线胶质瘤n＝7)样本，其中年龄范围是5-77岁，中位年龄是48岁。进行试剂盒探针数据分析。这129例样本的提取、建库、测序的质控均合格，同时对每个基因进行测序深度统计，这些样本中除TERT启动子外的基因的测序深度均超过500。通过高通量测序平台对组织和白细胞对照样本DNA进行测序，实验流程如图1所示。

实施例3结果分析

1.样本的检出结果分析(如图2所示)：

1)在26例病理诊断为少突胶质细胞瘤中均检出IDH热点突变和1p/19q的联合共缺失变异；

2)在68例胶质母细胞瘤病例中有3例检出了BRAF V600E突变，这一分子标志物是一类特殊的胶质母细胞瘤亚型-上皮样胶质母细胞瘤，预后较其他胶质母细胞瘤较好，基于分子诊断结果可以对胶质母细胞瘤进行进一步分子分型，评估患者预后；在12％(8/68)的胶质母细胞瘤中出现IDH基因热点突变，经过进一步分析，8例样中都含有星形细胞瘤的分子标志物ATRX基因变异，根据分子诊断结果与病理诊断结果综合分析，这8例患者定义为IDH突变的星形细胞瘤；

3)在60例IDH野生型的胶质母细胞瘤中，82％(49/60)患者检出胶质母细胞瘤的分子标志物TERT、EGFR、Chr7/10变异。其中31％(15/49)的患者检出TERT、EGFR、Chr7/10的单变异；在6％(3/49)患者只检出Chr7/10拷贝数变异。这表明了胶质瘤分子分型panel中的Chr7/10拷贝数的检测可以依据分子标志物对胶质瘤患者尤其是胶质母细胞瘤患者进行精准分型；

4)在27例病理诊断为星形细胞瘤的病例样本中，44％(12/27)的星形细胞瘤中出现IDH野生型，经过分析，在12例IDH野生型的星形细胞瘤中有3例是由H3 K27M变异，6例具有TERT、EGFR、Chr7/10变异中的其中一个(图2)，符合cIMPACT-NOW更新3中提到的IDH野生型的成人弥漫性星形细胞瘤根据分子特征(TERT启动子突变、EGFR扩增，7号染色体扩增联合10号染色体缺失)的单变异或共变异可以直接分为IDH野生型的胶质母细胞瘤。

5)在7例病理诊断为弥漫中线胶质瘤中均检出H3 K27M变异。

基于以上对不同病理诊断的胶质瘤进行胶质瘤NGS panel测序分析与比较，证明了胶质瘤NGS panel检测的分子标志物的诊断结果相对于病理诊断更为精准，说明在胶质瘤中分子分型优于组织分型，胶质瘤NGS panel可满足胶质瘤分子分型的需求。

2.检测方法一致性分析：

1)1p/19q分析：1p/19q联合共缺失是可以作为少突胶质细胞瘤分子标志物，用于诊断少突胶质细胞瘤。

在26例病理诊断为少突胶质细胞瘤的肿瘤样本进行金标准FISH平台验证，结果显示其中25例1p/19q发生联合共缺失；而通过胶质瘤NGS panel检测结果显示25例1p/19q发生联合共缺失，而1例无1p/19q发生联合共缺失，由此可见，FISH平台检测和胶质瘤NGSpanel检测1p/19q一致性为100％，而病理诊断容易发生诊断失误；

2)H3F3A分析：cIMPACT-NOW2更新要点建议胶质瘤生长在脑中线部位、肿瘤生长方式为弥漫性生长且分子检测有H3 K27M的患者，应该诊断为弥漫性中线脑胶质瘤。对7例病理诊断为弥漫中线胶质瘤样本进行H3 K27M突变的IHC平台验证，IHC平台检测和胶质瘤NGSpanel检测H3F3A一致性为100％。

3.检测方法差异性分析：

在胶质瘤尤其是低级别胶质瘤中常发生IDH突变。IDH基因的热点突变包括IDH1基因的R132H、R132S、R132L等以及IDH2基因的R172G、R172S等。目前在医院的病理科可以进行IDH的免疫组化检测，但免疫组化抗体只能检测出IDH R132H位点突变。

在本次收集的129例病例中，其中有两例医院病理诊断免疫组化检测IDH结果与胶质瘤NGS panel检测IDH结果存在差异，医院病理检测结果是IDH野生型的少突胶质细胞瘤，NGS panel检测显示是IDH2 R172突变，NGS检测IDH基因结果是IDH基因的热点突变，NGSpanel分子检测结果与医院组织学病理诊断(少突胶质细胞瘤)相一致。

综上可见，本发明开发的胶质瘤分子分型panel可以对胶质瘤对胶质瘤患者进行更精准的分子分型以及评估预后。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (7)

1.一种基于二代测序技术的成人脑胶质瘤分子分型panel，其特征在于，所述panel针对IDH1、IDH2、CDKN2A、CDKN2B、TERT、EGFR、H3F3A、chr7/chr10、1p/19q、ATRX、TP53、HIST1H3B、HIST1H3C、BRAF2等基因的全外显子区域及启动子区域进行检测。

2.如权利要求1所述的成人脑胶质瘤分子分型panel，其特征在于，所述panel包括用于检测上述基因片段的探针序列。

3.一种用于诊断成人脑胶质瘤分子分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的panel。

4.一种用于成人脑胶质瘤预后评估的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的panel。

5.如权利要求1或2所述的成人脑胶质瘤分子分型panel在用于制备诊断成人脑胶质瘤分子分型的产品中的应用。

6.如权利要求1或2所述的成人脑胶质瘤分子分型panel在用于制备成人脑胶质瘤预后评估的产品中的应用。

7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒。

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