CN108004326A - 基因检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程及分子生物学领域,提供一种基因检测试剂盒,包括用于对含待测位点的核酸片段进行特异性扩增的引物组,所述待测位点为CYP2C9基因上的rs1799853位点、rs1057910位点,VKORC1基因上的rs9923231位点中的至少一种,所述引物组包括rs1799853引物组、rs1057910引物组、rs9923231引物组中的至少一种。本发明还提供了一种基因检测方法。本发明的试剂盒通过采用特异性扩增引物组对含上述待测位点的核酸片段进行扩增,使得对CYP2C9基因和VKORC1基因突变的检测灵敏度高、假阳性率低;本发明的试剂盒采用第二代高通量基因测序技术进行检测,使得检测周期短,通量高。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程及分子生物学领域,更具体地说,涉及一种基因检测试剂盒及检测方法。
背景技术
华法林(warfarin)是香豆素类口服抗凝血药,目前被广泛应用于多种疾病的抗凝以及预防和治疗血栓栓塞中,但是因为华法林的有效血药浓度范围狭窄,剂量偏小会降低治疗血栓形成的效果,剂量偏大则会增大出血的风险,甚至引发大出血等副作用。已知与华法林的药效学和药动学相关的基因达30余种,细胞色素2C9(CYP2C9)和微生物K环氧化物还原酶复合物(VKORC1)基因的多态性是影响华法林用量个体差异最主要的遗传因素。通过对患者的基因CYP2C9、VKORC1进行检测,得到特定位点的基因型,以基因检测结果作为中间结果的信息的方法,不属于疾病的诊断方法;以基因型的检测结果来确定华法林需求的维持剂量,就可以实现个体化用药,既可避免剂量不够造成血栓,又可防止剂量过大引起出血并发症。
目前常用的CYP2C9基因和VKORC1基因突变检测方法主要有Taqman荧光探针法。但Taqman荧光探针法灵敏度低、假阳性率高、耗时较长,通量小。
因此,需要一种新的检测CYP2C9基因和VKORC1基因突变的试剂盒及检测方法,使得对CYP2C9基因和VKORC1基因突变的检测灵敏度高、假阳性率低,且检测周期短,通量高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因检测试剂盒及检测方法,旨在解决现有技术中CYP2C9基因和VKORC1基因检测灵敏度低、假阳性率高、周期长,通量小的技术问题。
一种基因检测试剂盒,包括用于对含待测位点的核酸片段进行特异性扩增的引物组,所述待测位点为CYP2C9基因上的rs1799853位点、rs1057910位点,VKORC1基因上的rs9923231位点中的至少一种,所述引物组包括rs1799853引物组、rs1057910引物组、rs9923231引物组中的至少一种;
所述rs1799853引物组用于特异性扩增含rs1799853位点的核酸片段,包括rs1799853上游引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4,以及rs1799853下游引物SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8;
所述rs1057910引物组用于特异性扩增含rs1057910位点的核酸片段,包括rs1057910上游引物SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12,以及rs1057910下游引物SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16;
所述rs9923231引物组用于特异性扩增含rs9923231位点的核酸片段,包括rs9923231上游引物SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20,以及rs9923231下游引物SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24。
优选的,所述基因检测试剂盒还包括接头,所述接头包括接头A、接头B、接头C、接头D、接头E、接头F中的至少一种;所述接头A由SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成;所述接头B由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28组成;所述接头C由SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30组成;所述接头D由SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32组成;所述接头E由SEQ ID NO:33和SEQ IDNO:34组成;所述接头F由SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36组成。
优选的,所述基因检测试剂盒还包括测序引物,所述测序引物包括对含rs1799853位点的文库分子进行测序的测序引物SEQ ID NO:37、对含rs1057910位点的文库分子进行测序的测序引物SEQ ID NO:38、对含rs9923231位点的文库分子进行测序的测序引物SEQID NO:39中的至少一种。
优选的,所述测序引物的5’末端经过磷酸化修饰。
本发明还提供了一种基因检测方法,包括以下步骤:
A、利用扩增引物组,分别对含待测位点的样本进行扩增,得扩增产物;所述待测位点为CYP2C9基因上的rs1799853位点、rs1057910位点,VKORC1基因上的rs9923231位点中的至少一种,所述引物组包括rs1799853引物组、rs1057910引物组、rs9923231引物组中的至少一种;
所述rs1799853引物组用于特异性扩增含rs1799853位点的核酸片段,包括rs1799853上游引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4,以及rs1799853下游引物SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8;
所述rs1057910引物组用于特异性扩增含rs1057910位点的核酸片段,包括rs1057910上游引物SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12,以及rs1057910下游引物SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16;
所述rs9923231引物组用于特异性扩增含rs9923231位点的核酸片段,包括rs1057910上游引物SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20,以及rs9923231下游引物SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24;
B、在所述扩增产物上连接接头,得到文库分子;
C、采用第二代高通量基因测序技术对所述文库分子进行测序,确定待测位点的基因型。
优选的,所述步骤A包括以下步骤:
A1、采用第一rs1799853引物组扩增CYP2C9基因2号等位基因区域,得第一rs1799853扩增产物;采用第一rs1057910引物组扩增CYP2C9基因3号等位基因区域,得第一rs1057910扩增产物;采用第一rs9923231引物组扩增VKORC1基因启动子区域,得第一rs9923231扩增产物;所述第一rs1799853引物组包括第一rs1799853上游引物SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2,以及第一rs1799853下游引物SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6;所述第一rs1057910引物组包括第一rs1057910上游引物SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10,以及第一rs1057910下游引物SEQID NO:13或SEQ ID NO:14;所述第一rs9923231引物组包括第一rs9923231上游引物SEQ IDNO:17或SEQ ID NO:18,以及第一rs9923231下游引物选自SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22;
A2、以第一rs1799853扩增产物为模板,采用第二rs1799853引物组扩增含rs1799853位点的片段,得第二rs1799853扩增产物;以第一rs1057910扩增产物为模板,采用第二rs1057910引物组扩增含rs1057910位点的片段,得第二rs1057910扩增产物;以第一rs9923231扩增产物为模板,采用第二rs9923231引物组扩增含rs9923231位点的片段,得第二rs9923231扩增产物;所述第二rs1799853引物组包括第二rs1799853上游引物SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4,以及第二rs1799853下游引物SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8;所述第二rs1057910引物组包括第二rs1057910上游引物SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12,以及第二rs1057910下游引物SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16;所述第二rs9923231引物组包括第二rs9923231上游引物SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20,以及第二rs9923231下游引物SEQ IDNO:23或SEQ ID NO:24。
优选的,所述步骤B中还包括向第二rs1799853扩增产物、第二rs1057910扩增产物、第二rs9923231扩增产物中的至少一种中加入USER酶进行切割的步骤,所述第二扩增产物经USER酶切割形成第一粘性末端。
优选的,所述接头包括接头A、接头B、接头C、接头D、接头E、接头F中的至少一种;所述接头A由SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成;所述接头B由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28组成;所述接头C由SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30组成;所述接头D由SEQ ID NO:31和SEQID NO:32组成;所述接头E由SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34组成;所述接头F由SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36组成。
优选的,步骤C中用于对含rs1799853位点的文库分子进行测序的测序引物为SEQID NO:37;对含rs1057910位点的文库分子进行测序的测序引物为SEQ ID NO:38;对含rs9923231位点的文库分子进行测序的测序引物为SEQ ID NO:39。
优选的,所述测序引物的5’末端经过磷酸化修饰。
本发明提供的一种基因检测试剂盒,采用特异性PCR扩增引物组对含待测位点的片段进行扩增,降低了扩增多个靶位点的可能性,提高了对待测位点扩增的特异性和灵敏度,降低了假阳性率;同时,采用第二代高通量基因测序技术,使得对待测位点的检测周期短,通量高。
附图说明
图1为第三实施例中文库分子的PAGE胶电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。
本发明提出第一实施例,一种基因检测试剂盒,包括用于对含待测位点的核酸片段进行特异性扩增的引物组,所述待测位点为CYP2C9基因上的rs1799853位点、rs1057910位点,VKORC1基因上的rs9923231位点中的至少一种,所述引物组包括rs1799853引物组、rs1057910引物组、rs9923231引物组中的至少一种;
所述rs1799853引物组用于特异性扩增含rs1799853位点的核酸片段,包括rs1799853上游引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4,以及rs1799853下游引物SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8;
所述rs1057910引物组用于特异性扩增含rs1057910位点的核酸片段,包括rs1057910上游引物SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12,以及rs1057910下游引物SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16;
所述rs9923231引物组用于特异性扩增含rs9923231位点的核酸片段,包括rs9923231上游引物SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20,以及rs9923231下游引物SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24。
本方案提供的基因检测试剂盒,包括特异性扩增引物组,该特异性扩增引物组能够特异性扩增含待测位点的核酸片段,降低了扩增非目的片段的可能性,从而使得对待测位点检测的灵敏度高,假阳性率低。
优选的,所述试剂盒还包括接头,所述接头包括接头A、接头B、接头C、接头D、接头E、接头F中的至少一种;所述接头A由SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成;所述接头B由SEQID NO:27和SEQ ID NO:28组成;所述接头C由SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30组成;所述接头D由SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32组成;所述接头E由SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34组成;所述接头F由SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36组成。其中,所述接头A上含有标签序列ACGT;所述接头B上含有标签序列TGCA;所述接头C上含有标签序列GTAC;所述接头D上含有标签序列CATG;所述接头E上含有标签序列AGTC;所述接头F上含有标签序列CAGT。当在同一体系中对多个待测序位点进行测序时,采用含有不同标签序列的接头与含不同待测序位点的扩增产物连接,在测序过程中通过检测标签序列,能够在测序过程中区分样品;本方案设计的接头序列由于5’末端不含磷酸基团,不会发生自连,从而提高了接头与扩增产物之间的连接效率;且接头序列中组合的六种标签序列在后续检测过程中碱基识别简单,易于区分;标签序列长度为4bp,降低了设计和检测难度。
优选的,所述SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:35的5’末端上含有生物素标记,且生物素标记被预先固定在含链霉亲和素或亲和素的磁珠上。利用该生物素标记,可以在步骤B结束后,很方便的将含待测位点和接头的核酸片段分离出来。
需要说明的是,本发明提供的试剂盒,对不同待测位点的扩增步骤为分开进行,对多个含不同待测位点的扩增产物可以混合在一起同时进行测序。当采用本发明的试剂盒在同一体系中同时对同一样本的多个不同待测位点进行检测时,与含不同待测位点的核酸片段连接的接头,其上的标签序列可以相同,也可以不同。当接头上的标签序列不同时,可以通过对接头标签序列的检测来区分待测位点,当接头上的标签序列相同时,可以通过所使用的测序引物的不同来区分待测位点。
当采用本发明的试剂盒对在同一体系中同时对不同样本的同一待测位点进行检测时,由于在测序过程中使用的测序引物是相同的,因此需要采用含不同标签序列的接头分别连接不同的样本,通过对标签序列进行测序,无需对样本进行多次测序即可有效区分不同样本的测序结果。
优选的,所述试剂盒还包括测序引物,所述测序引物包括用于检测rs1799853位点的rs1799853测序引物SEQ ID NO:37,用于检测rs1057910位点的rs1057910测序引物SEQID NO:38,用于检测rs9923231位点中的rs9923231测序引物SEQ ID NO:39中的至少一种。本方案设计的测序引物,在测序过程中连接在待测位点附近区域,使得在测序过程中,仅需较少次数的测序即可确定待测位点的基因型。
优选的,所述测序引物的5’末端经磷酸化修饰。本方案的测序引物适用于采用连接测序法对待测位点进行检测,本方案使得测序探针可连接在测序引物的5’末端。
本发明提出第二实施例,一种基因检测方法,包括以下步骤:
A、利用扩增引物组,分别对含待测位点的样本进行扩增,得扩增产物;所述待测位点为CYP2C9基因上的rs1799853位点、rs1057910位点,VKORC1基因上的rs9923231位点中的至少一种,所述引物组包括rs1799853引物组、rs1057910引物组、rs9923231引物组中的至少一种;
所述rs1799853引物组用于特异性扩增含rs1799853位点的核酸片段,包括rs1799853上游引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4,以及rs1799853下游引物SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8;
所述rs1057910引物组用于特异性扩增含rs1057910位点的核酸片段,包括rs1057910上游引物SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12,以及rs1057910下游引物SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16;
所述rs9923231引物组用于特异性扩增含rs9923231位点的核酸片段,包括rs9923231上游引物SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20,以及rs9923231下游引物SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24;
B、在所述扩增产物上连接接头,得到文库分子;
C、采用第二代高通量基因测序技术对所述文库分子进行测序,确定待测位点的基因型。
本发明提供的基因检测方法,采用对待测位点进行特异性扩增的引物组扩增含待测位点的核酸片段,提高了对待测位点检测的灵敏度,降低检测的假阳性率。
优选的,所述步骤A包括以下步骤:
A1、采用第一rs1799853引物组扩增CYP2C9基因2号等位基因区域,得第一rs1799853扩增产物;采用第一rs1057910引物组扩增CYP2C9基因3号等位基因区域,得第一rs1057910扩增产物;采用第一rs9923231引物组扩增VKORC1基因启动子区域,得第一rs9923231扩增产物;所述第一rs1799853引物组包括第一rs1799853上游引物SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2,以及第一rs1799853下游引物SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6;所述第一rs1057910引物组包括第一rs1057910上游引物SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10,以及第一rs1057910下游引物SEQID NO:13或SEQ ID NO:14;所述第一rs9923231引物组包括第一rs9923231上游引物SEQ IDNO:17或SEQ ID NO:18,以及第一rs9923231下游引物选自SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22;
A2、以第一rs1799853扩增产物为模板,采用第二rs1799853引物组扩增含rs1799853位点的片段,得第二rs1799853扩增产物;以第一rs1057910扩增产物为模板,采用第二rs1057910引物组扩增含rs1057910位点的片段,得第二rs1057910扩增产物;以第一rs9923231扩增产物为模板,采用第二rs9923231引物组扩增含rs9923231位点的片段,得第二rs9923231扩增产物;所述第二rs1799853引物组包括第二rs1799853上游引物SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4,以及第二rs1799853下游引物SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8;所述第二rs1057910引物组包括第二rs1057910上游引物SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12,以及第二rs1057910下游引物SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16;所述第二rs9923231引物组包括第二rs9923231上游引物SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20,以及第二rs9923231下游引物SEQ IDNO:23或SEQ ID NO:24。
本方案通过设计两对PCR扩增引物组,对含待测位点的核酸片段进行两轮特异性扩增,能够有效确保第二扩增产物中没有因引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染,降低了扩增多个靶位点的可能性,增加了扩增的特异性和灵敏度。
优选的,所述步骤B中还包括向第二rs1799853扩增产物、第二rs1057910扩增产物、第二rs9923231扩增产物中的至少一种中加入USER酶进行切割的步骤,所述扩增产物经USER酶切割产生第一粘性末端。由于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中均含有CGGU片段,通过PCR扩增得到第二扩增产物后,USER酶切割第二扩增产物G和U之间的磷酸二酯键,形成5’末端含有磷酸基团的第一粘性末端,该第一粘性末端有利于在后续反应过程中连接接头。
优选的,所述接头含有第二粘性末端,所述第二粘性末端与扩增产物的第二粘性末端完全互补配对。接头通过第二粘性末端与扩增产物的第一粘性末端互补配对连接,提高了连接效率。
优选的,所述接头与第二粘性末端相对的末端上含有生物素标记,且被预先固定在含链霉亲和素或亲和素的磁珠上。利用该生物素标记,可以在步骤B结束后,很方便的将含待测位点和接头的核酸片段分离出来。
需要说明的是,本发明检测方法的扩增步骤为在不同反应体系中分开进行的,对多个含不同待测位点的扩增产物可以混合在一起同时进行测序。当采用本发明的基因检测方法在同一体系中同时对同一样本的多个不同待测位点进行检测时,与含不同待测位点的核酸片段连接的接头,其上的标签序列可以相同,也可以不同。当接头上的标签序列不同时,可以通过对接头标签序列的检测来区分待测位点,当接头上的标签序列相同时,可以通过所使用的测序引物的不同来区分待测位点。
当采用本发明的基因检测方法对在同一体系中同时对不同样本的同一待测位点进行检测时,由于在测序过程中使用的测序引物是相同的,因此需要采用含不同标签序列的接头分别连接不同的样本,通过对标签序列的测序区分不同的样本,无需对样本进行多次测序即可有效区分不同样本的测序结果。
所述接头上含有标签序列,当在同一体系中对多个待测序位点进行测序时,采用含有不同标签序列的接头与含不同待测序位点的扩增产物连接,在测序过程中通过检测标签序列,能够在测序过程中区分样品。
优选的,所述接头包括接头A、接头B、接头C、接头D、接头E、接头F中的至少一种;所述接头A由SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成;所述接头B由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28组成;所述接头C由SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30组成;所述接头D由SEQ ID NO:31和SEQID NO:32组成;所述接头E由SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34组成;所述接头F由SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36组成。其中,所述接头A上含有标签序列ACGT;所述接头B上含有标签序列TGCA;所述接头C上含有标签序列GTAC;所述接头D上含有标签序列CATG;所述接头E上含有标签序列AGTC;所述接头F上含有标签序列CAGT。本方案设计的接头序列不会发生自连,从而提高了接头与扩增产物之间的连接效率;且接头序列中组合的六种标签序列在后续检测过程中碱基识别简单,易于区分;标签序列长度为4bp,降低了设计和检测难度。
优选的,所述第二代高通量基因测序技术包括但不仅限于连接测序法或合成测序法。
优选的,步骤C中对含rs1799853位点的文库分子进行测序的测序引物为SEQ IDNO:37;对含rs1057910位点的文库分子进行测序的测序引物为SEQ ID NO:38;对含rs9923231位点的文库分子进行测序的测序引物为SEQ ID NO:39。本方案设计的测序引物,在测序过程中连接在待测位点附近区域,使得在测序过程中,仅需较少次数的测序即可确定待测位点的基因型。
优选的,所述测序引物的5’末端经磷酸化修饰。本方案的测序引物尤其适用于采用连接测序法,在测序过程中,测序探针连接在该测序引物5’末端。
本发明提供了第三实施例,一种基因检测方法,以人类全血基因组样本为模板,按以下步骤建立反应体系:
A1、分别配制一个扩增CYP2C9基因2号等位基因区域核酸片段、一个扩增CYP2C9基因3号等位基因区域核酸片段、一个扩增VKORC1基因启动子区域核酸片段的共3个PCR扩增反应体系;按以下配比配制各反应体系:50ng/μL的人类全血DNA分子1.0μL;2×long Taq Mix(深圳华因康基因科技有限公司生产)10μL;10μM的上游引物0.4μL;10μM的下游引物0.4μL;8.2μL去离子水;混匀并离心。然后将离心管置于PCR仪中,设置反应程序:94℃条件下持续5分钟;94℃条件下持续20秒,57℃条件下持续20秒,72℃条件下持续20秒,一共30个循环;72℃条件下持续5分钟;PCR反应完成后,得到第一扩增产物。其中,用于特异性扩增CYP2C9基因2号等位基因区域的引物组为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2;用于特异性扩增CYP2C9基因3号等位基因区域的引物组为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6;用于特异性扩增含VKORC1基因启动子区域的引物组为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
A2、分别配制一个扩增包含rs1799853位点的CYP2C9基因2号等位基因区域、一个扩增包含rs1057910位点的CYP2C9基因3号等位基因区域、一个扩增包含rs9923231位点的VKORC1基因启动子区域共3个PCR扩增反应体系;按以下配比配制各反应体系:稀释100倍的第一扩增产物1.0μL;2×long Taq Mix 10μL;10μM的上游引物0.4μL;10μM的下游引物0.4μL;8.2μL去离子水;混匀并离心。将离心管置于PCR仪中,设置反应程序:94℃条件下持续5分钟;94℃条件下持续20秒,57℃条件下持续20秒,72℃条件下持续20秒,一共35个循环;72℃条件下持续5分钟;PCR反应完成后,得到第二扩增产物。其中,用于特异性扩增包含rs1057910位点的CYP2C9基因2号等位基因区域的引物组为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4;用于特异性扩增包含rs1057910位点的CYP2C9基因3号等位基因区域的引物组为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6;用于特异性扩增包含rs9923231位点的VKORC1基因启动子区域的引物组为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
B、针对上述第二扩增产物,分别配制切割-连接反应体系如下:第二扩增产物20μL,T4连接酶缓冲液8μL,T4 DNA连接酶 1μL,USER酶 2μL,0.2μmol/mL的预先固定在磁珠上的F接头1μL。上述反应体系在25℃条件下反应10分钟,反应完成后,将离心管置于磁力架上,分离去除上清,加入50μL的TE缓冲液反复清洗2次,得到吸附在磁珠上的含有接头以及待检测位点的核酸片段的文库分子。其中,本实施例中各切割-连接反应体系中的接头分别为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成的接头A,由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28组成的接头B,由SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30组成的接头C。
如图1所示,对含接头和待测位点的文库分子进行PAGE胶电泳图检测,图1中泳道0为分子大小标记物,泳道1至3为含rs1799853位点的文库分子,泳道4至6为含rs1057910位点的文库分子,泳道7至9为含rs9923231位点的文库分子,其分别在122bp、46bp、135bp附近出现目标条带,与理论预期文库分子大小完全相符,说明本发明的扩增引物组可以很好的扩增含待测位点的核酸片段。
C、将步骤B得到的文库分子,点样至异硫氰基修饰的载样片上,于37℃固定1h。采用深圳华因康基因科技有限公司的高通量基因测序仪Pstar ⅡA,以连接测序法进行测序,确定rs1799853位点为T,为突变型;rs1057910位点为A,为野生型;rs9923231位点为R,为杂合子。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州康昕瑞基因健康科技有限公司
<120> 基因检测试剂盒及检测方法
<130>
<160> 39
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agcttcctct ttcttgcctg 20
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cagcttcctc tttctt 16
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgguctcatg acgctgcgga at 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cggutcatga cgctgcggaa tt 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgagctaaca accaggactc a 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcttcacatg agctaacaa 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gatatggagt agggtcacc 19
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgatatggag tagggtc 17
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cccctgaatt gctacaacaa 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acccctgaat tgctacaaca 20
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cggutgatgc ggtccagaga tac 23
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cggucaggaa gagattgaac gt 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gggacttcga aaacatggag 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ggggacttcg aaaacatgga 20
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tggtggggag aaggtcaa 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aatgtcacag gtcactgc 18
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ctcagcctcc caagtagttt g 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tcagcctccc aagtagtttg 20
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cggutggcca ggcttgtctt aaac 24
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cgguttggcc aggcttgtct taaa 24
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gtgagaaaca gcatctggag a 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tgagaaacag catctggaga g 21
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tgggaagtca agcaagagaa 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ctgggaagtc aagcaagaga 20
<210> 25
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cctccctgca gtctctatgg gcacgtctgc tagtcgctga agtagtcggt 50
<210> 26
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ctacttcagc gactagcaga cgtgcccata gagactgcag gg 42
<210> 27
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
cctccctgca gtctctatgg gctgcactgc tagtcgctga agtagtcggt 50
<210> 28
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ctacttcagc gactagcagt gcagcccata gagactgcag gg 42
<210> 29
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
cctccctgca gtctctatgg gcgtacctgc tagtcgctga agtagtcggt 50
<210> 30
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ctacttcagc gactagcagg tacgcccata gagactgcag gg 42
<210> 31
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
cctccctgca gtctctatgg gccatgctgc tagtcgctga agtagtcggt 50
<210> 32
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
ctacttcagc gactagcagc atggcccata gagactgcag gg 42
<210> 33
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
cctccctgca gtctctatgg gcagtcctgc tagtcgctga agtagtcggt 50
<210> 34
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ctacttcagc gactagcagg actgcccata gagactgcag gg 42
<210> 35
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
cctccctgca gtctctatgg gccagtctgc tagtcgctga agtagtcggt 50
<210> 36
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
ctacttcagc gactagcaga ctggcccata gagactgcag gg 42
<210> 37
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gtcctcaatg ctcctct 17
<210> 38
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gtatctctgg acctcgt 17
<210> 39
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ggtgcggtgg ctcacgc 17
Claims (10)
1.一种基因检测试剂盒,包括用于对含待测位点的核酸片段进行特异性扩增的引物组,其特征在于,所述待测位点为CYP2C9基因上的rs1799853位点、rs1057910位点,VKORC1基因上的rs9923231位点中的至少一种,所述引物组包括rs1799853引物组、rs1057910引物组、rs9923231引物组中的至少一种;
所述rs1799853引物组用于特异性扩增含rs1799853位点的核酸片段,包括rs1799853上游引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4,以及rs1799853下游引物SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8;
所述rs1057910引物组用于特异性扩增含rs1057910位点的核酸片段,包括rs1057910上游引物SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12,以及rs1057910下游引物SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16;
所述rs9923231引物组用于特异性扩增含rs9923231位点的核酸片段,包括rs9923231上游引物SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20,以及rs9923231下游引物SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24。
2.根据权利要求1所述的基因检测试剂盒,其特征在于,所述基因检测试剂盒还包括接头,所述接头包括接头A、接头B、接头C、接头D、接头E、接头F中的至少一种;所述接头A由SEQID NO:25和SEQ ID NO:26组成;所述接头B由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28组成;所述接头C由SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30组成;所述接头D由SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32组成;所述接头E由SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34组成;所述接头F由SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36组成。
3.根据权利要求1所述的基因检测试剂盒,其特征在于,所述基因检测试剂盒还包括测序引物,所述测序引物包括对含rs1799853位点的文库分子进行测序的测序引物SEQ IDNO:37、对含rs1057910位点的文库分子进行测序的测序引物SEQ ID NO:38、对含rs9923231位点的文库分子进行测序的测序引物SEQ ID NO:39中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的基因检测试剂盒,其特征在于,所述测序引物的5’末端经过磷酸化修饰。
5.一种基因检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
A、利用扩增引物组,分别对含待测位点的样本进行扩增,得扩增产物;所述待测位点为CYP2C9基因上的rs1799853位点、rs1057910位点,VKORC1基因上的rs9923231位点中的至少一种,所述引物组包括rs1799853引物组、rs1057910引物组、rs9923231引物组中的至少一种;
所述rs1799853引物组用于特异性扩增含rs1799853位点的核酸片段,包括rs1799853上游引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4,以及rs1799853下游引物SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8;
所述rs1057910引物组用于特异性扩增含rs1057910位点的核酸片段,包括rs1057910上游引物SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12,以及rs1057910下游引物SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16;
所述rs9923231引物组用于特异性扩增含rs9923231位点的核酸片段,包括rs1057910上游引物SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20,以及rs9923231下游引物SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24;
B、在所述扩增产物上连接接头,得到文库分子;
C、采用第二代高通量基因测序技术对所述文库分子进行测序,确定待测位点的基因型。
6.根据权利要求5所述的基因检测方法,其特征在于,所述步骤A包括以下步骤:
A1、采用第一rs1799853引物组扩增CYP2C9基因2号等位基因区域,得第一rs1799853扩增产物;采用第一rs1057910引物组扩增CYP2C9基因3号等位基因区域,得第一rs1057910扩增产物;采用第一rs9923231引物组扩增VKORC1基因启动子区域,得第一rs9923231扩增产物;所述第一rs1799853引物组包括第一rs1799853上游引物SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2,以及第一rs1799853下游引物SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6;所述第一rs1057910引物组包括第一rs1057910上游引物SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10,以及第一rs1057910下游引物SEQID NO:13或SEQ ID NO:14;所述第一rs9923231引物组包括第一rs9923231上游引物SEQ IDNO:17或SEQ ID NO:18,以及第一rs9923231下游引物选自SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22;
A2、以第一rs1799853扩增产物为模板,采用第二rs1799853引物组扩增含rs1799853位点的片段,得第二rs1799853扩增产物;以第一rs1057910扩增产物为模板,采用第二rs1057910引物组扩增含rs1057910位点的片段,得第二rs1057910扩增产物;以第一rs9923231扩增产物为模板,采用第二rs9923231引物组扩增含rs9923231位点的片段,得第二rs9923231扩增产物;所述第二rs1799853引物组包括第二rs1799853上游引物SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4,以及第二rs1799853下游引物SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8;所述第二rs1057910引物组包括第二rs1057910上游引物SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12,以及第二rs1057910下游引物SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16;所述第二rs9923231引物组包括第二rs9923231上游引物SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20,以及第二rs9923231下游引物SEQ IDNO:23或SEQ ID NO:24。
7.根据权利要求6所述的基因检测方法,其特征在于,所述步骤B中还包括向第二rs1799853扩增产物、第二rs1057910扩增产物、第二rs9923231扩增产物中的至少一种中加入USER酶进行切割的步骤,所述第二扩增产物经USER酶切割形成第一粘性末端。
8.根据权利要求5所述的基因检测方法,其特征在于,所述接头包括接头A、接头B、接头C、接头D、接头E、接头F中的至少一种;所述接头A由SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成;所述接头B由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28组成;所述接头C由SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30组成;所述接头D由SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32组成;所述接头E由SEQ ID NO:33和SEQID NO:34组成;所述接头F由SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36组成。
9.根据权利要求5所述的基因检测方法,其特征在于,步骤C中用于对含rs1799853位点的文库分子进行测序的测序引物为SEQ ID NO:37;对含rs1057910位点的文库分子进行测序的测序引物为SEQ ID NO:38;对含rs9923231位点的文库分子进行测序的测序引物为SEQID NO:39。
10.根据权利要求9所述的基因检测方法,其特征在于,所述测序引物的5’末端经过磷酸化修饰。
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LAKSHMI MAHADEVAN等: "Prevalence of genetic variants associated with cardiovascular disease risk and drug response in the Southern Indian population of Kerala", 《INDIAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS》 * |
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