CN105039528A

CN105039528A - 同时检测xrcc1、ercc、gstp1和gstm1基因多态性的引物与方法

Info

Publication number: CN105039528A
Application number: CN201510384563.XA
Authority: CN
Inventors: 赵薇薇; 胡昌明; 燕启江; 郭周萍
Original assignee: Guangzhou Kingmed Diagnostics Central Co Ltd; Guangzhou Medical University
Current assignee: Guangzhou Kingmed Diagnostics Central Co Ltd; Guangzhou Medical University
Priority date: 2015-06-30
Filing date: 2015-06-30
Publication date: 2015-11-11

Abstract

本发明提供一种同时检测XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot？PCR引物。本发明属于生物检测技术领域，本发明提供的引物可以实现XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性的特异性检测，不会发生交叉反应，准确性好。

Description

同时检测 XRCC1 、 ERCC 、 GSTP1 和 GSTM1 基因多态性的引物与方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种同时检测XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性的引物与方法。

背景技术

铂类抗癌药物, 包括顺铂、卡铂和奥沙利铂等，是目前临床应用中对多种癌症具有较高活性的抗癌药物，主要通过引起细胞内DNA损伤来清除癌细胞。

X线修复交叉互补基团1(XRCC1)，位于人类染色体19q13.2-13.3，大小为33 kb。切除修复交叉互补基因1(ERCC1)，为人类DNA损伤修复基因，位于染色体19q13.2-13.3。切除修复交叉互补基因2(ERCC2)，参与核苷酸切除修复和基因转录，在DNA损伤修复中起着重要作用。谷胱甘肽S转移酶P1(GSTP1)，谷胱甘肽S转移酶(GST)是体内最重要的Ⅱ相代谢酶，通过直接结合化学致癌物或通过与谷胱甘肽结合而发挥解毒功能，可降解外源性化合物毒性。GSTM1纯合缺失（GSTM1_Loss）可导致酶活性丧失或降低，从而增强机体对某些毒物或致癌物的敏感性。

现有研究数据显示，XRCC1_R399Q R/R，R/Q和Q/Q基因型频率分别约为55%，37%，8%；ERCC1_C118T C/C，C/T，T/T基因型频率分别约为52.6%，43.1%，4.2%；ERCC2_L751Q K/K，K/Q，Q/Q基因型频率分别约为84.92%，15.08%，0%；GSTP1_I105V Ile/Ile（I/I），Ile/Val（I/V），Val/Val（V/V）基因型频率分别为57.4%，35.9%，6.7%。此外，GSTM1基因多态性在不同地区、不同种族的人群间有着不同的分布频率，GSTM1_Loss基因型频率在华人群体中分布较高。

因此，通过XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1基因多态性的检测，有助于预测铂类药物化疗的预后，在帮助指导用药和个性化治疗方面具有重要意义。现有技术缺少一种特异性好、灵敏度高、可实现多个位点同时检测的XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1基因多态性检测引物及其方法。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种同时检测XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性的引物与方法，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，实现了XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1基因多态性的同时检测。本发明同时检测的位点包括XRCC1_R399Q：c.1196A>G(p.Gln399Arg)(SNP：rs25487)，ERCC1_C118T：c.354T>C(p.Asn118=)(SNP：rs11615)，ERCC2_L751Q：c.2251A>C(p.Lys751Gln)(SNP：rs13181)，GSTP1_I105V：c.313A>G(p.Ile105Val)(SNP：rs1695)，GSTM1_Loss：GSTM1基因缺失。

本发明提供一种同时检测XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对XRCC1_R399Q的上游引物5’-TCTGACTCCCCTCCAGATT-3’(SEQ ID NO.1)和下游引物5’-GCCCCTCAGATCACACCTA-3’(SEQ ID NO.2)，针对ERCC1_C118T的上游引物5’-TCCAGAACACTGGGACATGA-3’(SEQ ID NO.3)和下游引物5’-TCCCTATTGATGGCTTCTGC-3’(SEQ ID NO.4)，针对ERCC2_L751Q的上游引物5’-GGCAAGACTCAGGAGTCACC-3’(SEQ ID NO.5)和下游引物5’-CCCTCTCCCTTTCCTCTGTT-3’(SEQ ID NO.6)，针对GSTP1_I105V的上游引物5’-ACCCCAGGGCTCTATGGGAA-3’(SEQ ID NO.7)和下游引物5’-TGAGGGCACAAGAAGCCCCT-3’(SEQ ID NO.8)以及针对GSTM1_Loss的上游引物5’-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3’(SEQ ID NO.9)和下游引物5’-CTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3’(SEQ ID NO.10)；所述SNaPshot PCR引物包括：针对XRCC1_R399Q的SNaPshot PCR引物5’-CGTCGGCGGCTGCCCTCCC-3’(SEQ ID NO.11)，针对ERCC1_C118T的SNaPshot PCR引物5’-TTTTTTTTAGGGGCAATCCCGTACTGAAGTTCGTGCGCAA-3’(SEQ ID NO.12)，针对ERCC2_L751Q的SNaPshot PCR引物5’-TTTTTTTAGCAGCTAGAATCAGAGGAGACGCTG-3’(SEQ ID NO.13)，针对GSTP1_I105V的SNaPshot PCR引物5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGTGGAGGACCTCCGCTGCAAATAC-3’(SEQ ID NO.14)以及针对GSTM1_Loss的SNaPshot PCR引物5’- TTTTCATCATAGACGAGAAAATCTACAA -3’(SEQ ID NO.15)。

采用上述技术方案，本发明提供的同时检测XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性的引物，可以实现XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1基因多态性的特异性检测，不会发生交叉反应，准确性好。

优选地，所述PCR扩增引物中，XRCC1_R399Q、ERCC1_C118T、ERCC2_L751Q、GSTP1_I105V和GSTM1_Loss的引物浓度比为1：1：1：1：1；所述SNaPshot PCR引物中，XRCC1_R399Q、ERCC1_C118T、ERCC2_L751Q、GSTP1_I105V和GSTM1_Loss的引物浓度比为1：1：1：1：1。

相应地，本发明还提供一种同时检测XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性的方法，包括如下步骤：A）提取DNA样品；B）采用权利要求1或2中所述的PCR扩增引物进行多重PCR扩增，对扩增产物进行纯化；C）采用权利要求1或2中所述的SNaPshot PCR引物进行SNaPshot PCR扩增，对扩增产物进行纯化；D）毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。

优选地，所述步骤A）中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。

优选地，所述步骤B）中的多重PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：58℃ 30s；阶段4：72℃ 1min；阶段5：返回到阶段2，29个循环；阶段6：72℃ 5min；阶段7：25℃ 保温。即，Step 1：98°C for 3minutes；Step 2：98°C for 10 seconds；Step 3：58°C for 30 seconds；Step 4：72°C for 1 minute；Step 5：Go to step 2，29 times；Step 6：72°C for 5 minutes；Step 7：25°C forever。

所述步骤C）中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括：阶段1：96℃ 10s；阶段2：55℃ 5s；阶段3：60℃ 30s；阶段4：返回到阶段1，25个循环；阶段5：4℃ 保温。即，Step 1：96°C for10seconds；Step 2：55°C for 5 seconds；Step 3：60°C for 30seconds；Step 4：Go to step 1，25 times；Step 5：4°C forever。

优选地，所述步骤D）中，采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。

此外，本发明还提供同时检测XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性的引物在制备检测XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性试剂中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种同时检测XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性的引物，引物的特异性好，不会发生交叉反应，准确性好，实现了XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1基因多态性的同时检测，提高了检测效率。此外，本发明还提供了一种同时检测XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性的SNaPshot法，通过使用特异性的PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，可以为铂类药物的临床用药提供指导。

附图说明

图1 本发明提供的XRCC1/ERCC1基因引物的扩增片段。

图2 本发明提供的ERCC2/GSTP1/GSTM1基因引物的扩增片段。

图3 XRCC1/ERCC1基因引物扩增产物的部分测序图。

图4 ERCC2/GSTP1/GSTM1基因引物扩增产物的部分测序图。

图5 样品的XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1基因多态性检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例一 引物

发明人针对XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1的基因多态性位点，设计了大量引物，通过引物反应条件的优化和比较，筛选出了特异性好、不会发生交叉反应且PCR反应条件非常接近的引物。本发明提供的引物包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物，PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物是相对应的。本发明提供的所有引物序列均通过UCSC数据库比对，无已知SNP位点。

实施例二 引物的特异性

将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting，XRCC1_R399Q引物扩增片段位于chr19: 44055651-44055888，长度为238bp；ERCC1_C118T引物扩增片段位于chr19: 45923504-45923722，长度为219bp；ERCC2_L751Q引物扩增片段位于chr19: 45854837+45855007，长度为171bp；GSTP1_I105V引物扩增片段位于chr11: 67352602-67352777，长度为176bp；GSTM1_Loss引物扩增片段位于chr1: 110232920-110233138，长度为219bp；结果如图1至图2所示，所有引物的扩增片段均覆盖了相应的检测位点，无其它同源基因。

使用表1中PCR扩增引物分别对检测样品进行扩增及Sanger测序，测序结果显示，各引物扩增片段与XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1基因参考序列吻合，结果如图3至图4所示。使用表1中SNaPshot PCR引物，SNaPshot法进行检测，结果如图5所示。从图5可知，各产物峰的相对位置及测序反应掺入的碱基与预期相符，且无其它干扰峰。

实施例二 XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1 基因多态性的检测

提取EDTA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANamp Blood DNA Kit（购自Tiagen，货号：DP318）的说明书，将DNA样品稀释至100ng/μL，备用。

配制PCR扩增引物混合物，XRCC1_R399Q、ERCC1_C118T、ERCC2_L751Q、GSTP1_I105V和GSTM1_Loss的引物浓度比为1：1：1：1：1，XRCC1_R399Q的引物浓度为5pmol/uL，震荡混匀，PCR扩增采用Q5^™热启动超保真2X Master Mix（购自NEB公司，货号：M0494L），反应体系如表2所示。多重PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：58℃ 30s；阶段4：72℃ 1min；阶段5：返回到阶段2，29个循环；阶段6：72℃ 5min；阶段7：25℃ 保温。PCR扩增结束后，取2.0μL ExoSAP-IT（购自Affymetrix，货号：78205）和3.0μL ddH₂O，混匀，加入PCR扩增产物2.0μL，混匀微离心；在PCR仪中进行酶切反应，程序：37℃，15 min；80℃，15min；4℃，保温。

配置SNaPshot PCR引物混合物，XRCC1_R399Q、ERCC1_C118T、ERCC2_L751Q、GSTP1_I105V和GSTM1_Loss的引物浓度比为1：1：1：1：1，XRCC1_R399Q的引物浓度为5pmol/uL，震荡混匀，采用SNaPshot^®Multiplex Kit（购自ABI 公司，货号4323151）进行扩增，反应体系如表3所示。SNaPshot PCR反应条件包括：阶段1：96℃ 10s；阶段2：55℃ 5s；阶段3：60℃ 30s；阶段4：返回到阶段1，25个循环；阶段5：4℃ 保温。

在SNaPshot PCR产物中加入1.0μL SAP酶，按照以下程序进行反应：37℃，60min；75℃，15min；4℃，保温。反应完毕后，毛细管电泳技术进行检测，对检测结果采用GENEMAPPERID V4.1软件进行分析，确定SNP位点及其基因型，结果如图5所示。

实施例三 检测 XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1 基因多态性的方法的特异性

本检测方法的特异性定义为阴性符合率。本检测将XRCC1_R399Q G/G基因型的检出定义为阴性结果，ERCC1_C118T C/C基因型的检出定义为阴性结果，ERCC2_L751Q A/A基因型的检出定义为阴性结果，GSTP1_I105V A/A基因型的检出定义为阴性结果，GSTM1未缺失基因型的检出定义为阴性结果。

采用本发明提供的SNaPshot法对9例样品进行检测，同时采用ARMS法或Sanger测序法进行验证。SNaPshot法的检测结果与ARMS法或Sanger测序法的结果相符，如表4所示。本检测方法的特异性为100%。

实施例四 检测 XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1 基因多态性的方法的灵敏度和准确性

本检测方法的灵敏度定义为阳性符合率。采用本发明提供的SNaPshot法对19例样品进行检测，同时采用ARMS法或Sanger测序法进行验证。SNaPshot测序法的检测结果与ARMS法或Sanger测序法的结果相符，如表5所示。本检测方法的灵敏度和准确度高。

本检测以XRCC1_R399Q多态性位点为例验证本检测的检测下限。样品A与样品B按1：9，2：8，3：7，4：6，5：5比例混合后进行检测，其中，样品A XRCC1 R399Q基因型为A/A(突变型)，样品B XRCC1 R399Q基因型为G/G(野生型)。结果如表6所示，XRCC1基因突变型与野生型比例为1：9(突变型比例为10%)时本检测方法也能检测到突变型。XRCC1_R399Q多态性为胚系突变，在杂合基因型G/A中突变等位基因为50%，因此，本检测的检测灵敏度100%。

实施例五 检测 XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1 基因多态性的方法的精密度

本检测方法的精密度定义为对样品进行重复检测得到同一结果的能力。本检测进行了人员间、不同时间、不同仪器、同一标本不同孔间的对比实验，结果如表7a和7b所示，所有结果均显示一致，本检测精密度为100%。其中，位点1：XRCC1_R399Q(G>A)；位点2：GSTM1缺失；位点3：ERCC2_L751Q(A>C)；位点4：ERCC1_C118T(C>T)；位点5：GSTP1_I105V( A>G)。

因此，本发明所提供的引物和检测方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了XRCC1/ERCC1/ERCC2/GSTP1/GSTM1进行准确分型鉴定问题，发挥PCR-SNaPshot PCR对所述基因位点基因分型结果精确、高通量操作的特点，有助于预测铂类药物化疗的预后，减少不良反应，在帮助指导用药和个性化治疗方面具有重要意义。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州金域医学检验中心有限公司、广州医科大学

<120> 同时检测XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性的引物与方法

<130>

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> XRCC1_R399Q_F

tctgactccc ctccagatt 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> XRCC1_R399Q_R

gcccctcaga tcacaccta 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> ERCC1_C118T_F

tccagaacac tgggacatga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> ERCC1_C118T_R

tccctattga tggcttctgc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> ERCC2_L751Q_F

ggcaagactc aggagtcacc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> ERCC2_L751Q_R

ccctctccct ttcctctgtt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> GSTP1_I105V_F

accccagggc tctatgggaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> GSTP1_I105V_R

tgagggcaca agaagcccct 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> GSTM1_Loss_F

gaactccctg aaaagctaaa gc 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> GSTM1_Loss_R

cttgggctca aatatacggt gg 22

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> XRCC1_R399Q

cgtcggcggc tgccctccc 19

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> ERCC1_C118T

ttttttttag gggcaatccc gtactgaagt tcgtgcgcaa 40

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> ERCC2_L751Q

tttttttagc agctagaatc agaggagacg ctg 33

<210> 14

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> GSTP1_I105V

tttttttttt tttttttttt tgcgtggagg acctccgctg caaatac 47

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> GSTM1_Loss

ttttcatcat agacgagaaa atctacaa 28

Claims

1.一种同时检测XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性的引物，其特征在于：包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对XRCC1_R399Q的上游引物5’-TCTGACTCCCCTCCAGATT-3’和下游引物5’-GCCCCTCAGATCACACCTA-3’，针对ERCC1_C118T的上游引物5’-TCCAGAACACTGGGACATGA-3’和下游引物5’-TCCCTATTGATGGCTTCTGC-3’，针对ERCC2_L751Q的上游引物5’-GGCAAGACTCAGGAGTCACC-3’和下游引物5’-CCCTCTCCCTTTCCTCTGTT-3’，针对GSTP1_I105V的上游引物5’-ACCCCAGGGCTCTATGGGAA-3’和下游引物5’-TGAGGGCACAAGAAGCCCCT-3’以及针对GSTM1_Loss的上游引物5’-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3’和下游引物5’-CTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3’；所述SNaPshot PCR引物包括：针对XRCC1_R399Q的SNaPshot PCR引物5’-CGTCGGCGGCTGCCCTCCC-3’，针对ERCC1_C118T的SNaPshot PCR引物5’-TTTTTTTTAGGGGCAATCCCGTACTGAAGTTCGTGCGCAA-3’，针对ERCC2_L751Q的SNaPshot PCR引物5’-TTTTTTTAGCAGCTAGAATCAGAGGAGACGCTG-3’，针对GSTP1_I105V的SNaPshot PCR引物5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGTGGAGGACCTCCGCTGCAAATAC-3’以及针对GSTM1_Loss的SNaPshot PCR引物5’-TTTTCATCATAGACGAGAAAATCTACAA -3’。

2.根据权利要求1所述的同时检测XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性的引物，其特征在于：所述PCR扩增引物中，XRCC1_R399Q、ERCC1_C118T、ERCC2_L751Q、GSTP1_I105V和GSTM1_Loss的引物浓度比为1：1：1：1：1；所述SNaPshot PCR引物中，XRCC1_R399Q、ERCC1_C118T、ERCC2_L751Q、GSTP1_I105V和GSTM1_Loss的引物浓度比为1：1：1：1：1。

3.一种同时检测XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性的方法，其特征在于：包括如下步骤：A）提取DNA样品；B）采用权利要求1或2中所述的PCR扩增引物进行多重PCR扩增，对扩增产物进行纯化；C）采用权利要求1或2中所述的SNaPshot PCR引物进行SNaPshot PCR扩增，对扩增产物进行纯化；D）毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。

4.根据权利要求3所述的同时检测XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤A）中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。

5.根据权利要求3所述的同时检测XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤B）中的多重PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：58℃ 30s；阶段4：72℃ 1min；阶段5：返回到阶段2，29个循环；阶段6：72℃ 5min；阶段7：25℃ 保温。

6.根据权利要求3所述的同时检测XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤C）中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括：阶段1：96℃ 10s；阶段2：55℃ 5s；阶段3：60℃ 30s；阶段4：返回到阶段1，25个循环；阶段5：4℃ 保温。

7.根据权利要求3所述的同时检测XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤D）中，采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。

8.根据权利要求1或2所述的同时检测XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性的引物在制备检测XRCC1、ERCC、GSTP1和GSTM1基因多态性试剂中的用途。