CN110343743B - 用于鉴定根尖牙乳头干细胞的引物组、试剂、试剂盒、应用和鉴定方法 - Google Patents

用于鉴定根尖牙乳头干细胞的引物组、试剂、试剂盒、应用和鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于鉴定根尖牙乳头干细胞的引物组、试剂、试剂盒、应用和鉴定方法，涉及生物技术领域，本发明提供的用于鉴定根尖牙乳头干细胞的引物组，包括用于检测NPC1的引物和/或用于检测HMGA1的引物。通过本发明提供的用于检测NPC1的引物和/或用于检测HMGA1的引物对待测生物样品进行检测，能够准确、有效地鉴定根尖牙乳头干细胞。此外，本发明提供的引物组还具有特异性强、灵敏度高的优点，且扩增能力稳定，能够简便、快速、准确地实现对根尖牙乳头干细胞的鉴定，对于根尖牙乳头干细胞的分离鉴定和牙科组织工程具有较高参考价值，适于推广应用。

Description

用于鉴定根尖牙乳头干细胞的引物组、试剂、试剂盒、应用和 鉴定方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于鉴定根尖牙乳头干细胞的引物组、试剂、试剂盒、应用和鉴定方法。
背景技术
牙齿由暴露的覆盖有牙釉质的牙冠和不可见插入颌骨的牙根组成，其中有牙髓组织。牙根向下延伸进入牙龈，牙髓沿着牙根也向下，并从未闭合的牙根中伸出长成根尖牙乳头。2006年，Sonoyama等人首次从18-20岁成年志愿者第三磨牙的根尖乳头中分离出具有干细胞特性的细胞群，与载体(hydroxyapatite/tricalcium phosphate，HA/TCP)结合后，实现了免疫缺陷小鼠的牙本质再生，他们将这种细胞群称为根尖乳头干细胞(apicalpapilla stem cell，SCAP)。SCAP与乳牙牙髓干细胞(SHED)相比，成骨能力和成神经样能力相类似，细胞增殖能力强2-3倍，但是成脂能力比较弱。SCAPs表达成骨标志物，且钙累计明显高于牙囊泡干细胞(DFSCs)。
干细胞的鉴定一般是通过标志物的检测和鉴定，除此之外还需要进行增殖实验，成骨成脂分化潜能测定等。但是检测需要的花费较高，仪器依赖大，还需较高的实验条件和专业人员及相关技术，满足不了现有大部分医疗机构和科研院所的需求。为了提高分离鉴定牙科组织工程中常用的根尖牙乳头干细胞和牙囊干细胞的区分效率，降低细胞鉴定和区分的成本，改进医疗应用和科学研究流程，提升干细胞利用效率，需要开发一种简单有效的检测方法。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种用于鉴定根尖牙乳头干细胞的引物组，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供一种包含上述引物组的试剂，以缓解现有技术中缺少快速有效且成本较低的对根尖牙乳头干细胞进行确认的手段的技术问题。
本发明的第三个目的在于提供一种包含上述引物组的试剂盒，以缓解现有技术中缺少快速有效且成本较低的对根尖牙乳头干细胞进行确认的手段的技术问题。
本发明的第四个目的在于提供上述引物组、试剂或试剂盒在鉴定根尖牙乳头干细胞，和/或检测待测样品中是否含有根尖牙乳头干细胞中的应用。
本发明的第五个目的在于提供一种鉴定根尖牙乳头干细胞的方法，能够为根尖牙乳头干细胞的鉴定和检测提供快速有效的手段。
本发明提供了一种用于鉴定根尖牙乳头干细胞的引物组，所述引物组包括用于检测NPC1的引物和/或用于检测HMGA1的引物；
所述用于检测NPC1的引物包括名称为NPC1-F和NPC1-R的单链DNA；
所述NPC1-F包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述NPC1-R包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测HMGA1的引物包括名称为HMGA1-F和HMGA1-R的单链DNA；
所述HMGA1-F包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述HMGA1-R包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。
进一步地，所述引物组包括用于检测NPC1的引物和用于检测HMGA1的引物；
优选地，所述NPC1-F包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述NPC1-R包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述HMGA1-F包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述HMGA1-R包括如SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种用于鉴定根尖牙乳头干细胞的试剂，所述试剂包括上述的引物组。
本发明还提供了一种用于鉴定根尖牙乳头干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组，或试剂；
优选地，所述试剂盒还包括内参基因及内参引物。
本发明还提供了上述的用于鉴定根尖牙乳头干细胞的引物组、试剂或试剂盒在如下(a)和/或(b)中的应用：
(a)鉴定或辅助鉴定根尖牙乳头干细胞；
(b)检测待测样品中是否含有根尖牙乳头干细胞。
另外，本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定根尖牙乳头干细胞的方法，所述方法包括：
以待测生物样品的基因组DNA为模板，利用上述的用于鉴定根尖牙乳头干细胞的引物组、试剂或试剂盒进行荧光定量PCR反应，根据基因的相对表达水平，确定所述待测生物样品是否为根尖牙乳头干细胞；
当所述基因的表达水平显著高时，所述待测生物样品为根尖牙乳头干细胞。
进一步地，所述待测生物样品的基因组DNA包括从所述待测生物样品中提取总RNA并反转录得到的cDNA。
进一步地，所述荧光定量PCR反应的条件包括：预变性95℃反应10min；变性95℃反应10s；退火60℃反应30s；延伸72℃反32s；变性到延伸循环40次；
优选地，所述荧光定量PCR反应完成后，进行溶解程序得到溶解曲线，所述溶解程序的条件包括：依次按照95℃反应15s、60℃反应1min、95℃反应15s和60℃反应15s。
进一步地，所述荧光定量PCR反应的体系包括：引物组溶液1μL，UltraSYBRMixture 18μL和模板基因组DNA 1μL。
进一步地，所述用于鉴定根尖牙乳头干细胞的引物组的浓度至少为2pmol/μL，优选为2-5pmol/μL，更优选为2pmol/μL。
本发明提供的用于鉴定根尖牙乳头干细胞的引物组，包括用于检测NPC1的引物和/或用于检测HMGA1的引物。本发明的发明人发现，NPC1和HMGA1在根尖牙乳头干细胞中具有显著高表达特性，因此，NPC1和HMGA1可以作为区分鉴定根尖牙乳头干细胞的标志物分子使用，通过本发明提供的用于检测NPC1的引物和/或用于检测HMGA1的引物对待测生物样品进行检测，能够准确、有效地鉴定根尖牙乳头干细胞。此外，本发明提供的引物组还具有特异性强、灵敏度高的优点，可检测浓度低至1ng/mL的DNA，且扩增能力稳定，能够简便、快速、准确地实现对根尖牙乳头干细胞的鉴定，对于根尖牙乳头干细胞的分离鉴定和牙科组织工程具有较高参考价值，适于推广应用。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定根尖牙乳头干细胞的方法，以待测生物样品的基因组DNA为模板，利用本发明提供的引物组进行荧光定量PCR反应，根据基因的相对表达水平，即可确定所述待测生物样品是否为根尖牙乳头干细胞。该方法快捷简便，能在很短时间内鉴定根尖牙乳头干细胞，且不需要昂贵复杂的仪器和操作，只需要实验室和医疗结构常备的荧光定量PCR仪，临床应用范围广，并且，应用本发明提供的引物组进行检测，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、检测周期短且结果直观等优点，能够为根尖牙乳头干细胞的鉴定和检测提供快速有效的手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的在DFSCs和SCAPs中HMGA1的相对表达量的结果图；
图2为本发明实施例1提供的在DFSCs和SCAPs中NPC1的相对表达量的结果图；
图3为本发明实施例2提供的在DFSCs和SCAPs中HMGA1的TMT定量相对表达水平的结果图；
图4为本发明实施例2提供的在DFSCs和SCAPs中NPC1的TMT定量相对表达水平的结果图。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
本发明的发明人通过蛋白组学研究，发现NPC1和HMGA1在根尖牙乳头干细胞中具有显著高表达特性，可以作为区分鉴定根尖牙乳头干细胞的标志物分子使用。基于此，本发明提供了一种用于鉴定根尖牙乳头干细胞的引物组，所述引物组包括用于检测NPC1的引物和/或用于检测HMGA1的引物；
所述用于检测NPC1的引物包括名称为NPC1-F和NPC1-R的单链DNA；
所述NPC1-F包括如SEQ ID NO.1(5’-GCAGGCCTACCAGAGAGATG-3’)所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述NPC1-R包括如SEQ ID NO.2(5’-GCACCTCTGACACAGCAAAA-3’)所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测HMGA1的引物包括名称为HMGA1-F和HMGA1-R的单链DNA；
所述HMGA1-F包括如SEQ ID NO.3(5’-CCCCGAGGTCTCTTAGGT GT-3’)所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述HMGA1-R包括如SEQ ID NO.4(5’-AAAAGGACGGCACTGAG AAG-3’)所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。
通过本发明提供的用于检测NPC1的引物和/或用于检测HMGA1的引物对待测生物样品进行检测，能够准确、有效地鉴定根尖牙乳头干细胞。此外，本发明提供的引物组还具有特异性强、灵敏度高的优点，且扩增能力稳定，能够简便、快速、准确地实现对根尖牙乳头干细胞的鉴定，对于根尖牙乳头干细胞的分离鉴定和牙科组织工程具有较高参考价值，适于推广应用。
需要说明的是，NPC1，即NPC细胞内胆固醇转运蛋白1(intracellularcholesterol transporter 1)，参与低密度脂蛋白转运到溶酶体，帮助低密度脂蛋白水解成游离胆固醇释放。HMGA1，即高迁移率族蛋白A1(High mobility group AT hook protein1)，参与基因转录的调节，以及癌细胞的转移过程。
本文中，“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如A和/或B包括(A和B)和(A或B)，引物组包括用于检测NPC1的引物和/或用于检测HMGA1的引物指的是，本发明提供的用于鉴定根尖牙乳头干细胞的引物组可以仅包括用于检测NPC1的引物、或者仅包括用于检测HMGA1的引物，或者同时包括用于检测NPC1的引物和用于检测HMGA1的引物。由于NPC1和HMGA1在根尖牙乳头干细胞中均具有显著高表达特性，因此单独检测NPC1或单独检测HMGA1都能够达到鉴定根尖牙乳头干细胞的目的。
本发明中的术语“同一性”指的是序列之间的相似性。“同一性”包括与本发明所述的SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列具有至少80％(例如可以为，但不限于80％、82％、85％、88％、90％、92％、95％或者更高)同一性的核苷酸序列。
本发明对各引物对之间的配比没有要求，例如可以为但不限于1:1、1:1.2或1:1.5，可以根据实际使用情况进行调整。
在一些优选的实施方式中，所述引物组包括用于检测NPC1的引物和用于检测HMGA1的引物；
优选地，所述NPC1-F包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述NPC1-R包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述HMGA1-F包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述HMGA1-R包括如SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列。
当本发明提供的引物组包含用于检测NPC1的引物和用于检测HMGA1的引物，同时检测NPC1和HMGA1时，对牙根尖乳头干细胞的鉴定结果更加准确。
本发明还提供了一种用于鉴定根尖牙乳头干细胞的试剂，所述试剂包括上述的引物组。
本发明还提供了一种用于鉴定根尖牙乳头干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组或试剂。
基于本发明提供的引物组相同的发明构思，本发明还提供了试剂或试剂盒，因此，本发明提供的试剂或试剂盒具有与本发明提供的引物组全部的有益效果，在此不再赘述。
在一些优选的实施方式中，本发明提供的试剂盒中还包括内参基因及内参引物。
需要说明的是，在本发明中内参引物与内参基因相对应，对内参基因不做特别的限定，凡是在各组织和细胞中表达相对恒定的，能够起到内部参照作用的基因均可，例如可以为，但不限于GADPH或β-Actin等。
本发明还提供了上述的引物组、试剂或试剂盒在如下(a)和/或(b)中的应用：
(a)鉴定或辅助鉴定根尖牙乳头干细胞；
(b)检测待测样品中是否含有根尖牙乳头干细胞。
当待测生物样品为未知细胞时，利用本发明提供的引物组、试剂或试剂盒进行检测，并通过检测结果判断待测生物样品是否为根尖牙乳头干细胞，能够达到鉴定根尖牙乳头干细胞的目的。
当待测生物样品为多细胞混合培养物或代谢物等未知样品时，利用本发明提供的引物组、试剂或试剂盒进行检测，并通过检测结果判断待测细胞是否为根尖牙乳头干细胞，能够达到检测待测样品中是否含有根尖牙乳头干细胞的目的。
另外，本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定根尖牙乳头干细胞的方法，所述方法包括：
以待测生物样品的基因组DNA为模板，利用上述的用于鉴定根尖牙乳头干细胞的引物组、试剂或试剂盒进行荧光定量PCR反应，根据基因的相对表达水平，确定所述待测生物样品是否为根尖牙乳头干细胞；
当所述基因的表达水平显著高时，所述待测生物样品为根尖牙乳头干细胞。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定根尖牙乳头干细胞的方法，快捷简便，能在很短时间内鉴定根尖牙乳头干细胞，且不需要昂贵复杂的仪器和操作，只需要实验室和医疗结构常备的荧光定量PCR仪，临床应用范围广，并且，应用本发明提供的引物组进行检测，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、检测周期短且结果直观等优点，能够为根尖牙乳头干细胞的鉴定和检测提供快速有效的手段。
可以理解的是，“基因的表达水平显著高”指的是，通实时荧光定量分析后，基因水平2^-ΔCt值大于等于0.1，或者相对于对照组，所述基因的2^-ΔΔCt值大于1.5。
需要说明的是，鉴定或辅助鉴定指的是，本发明提供的方法可以直接作为鉴定根尖牙乳头干细胞的方法，也可以配合其他鉴定方法或仪器，作为辅助鉴定方法使用。
本发明中待测生物样品例如可以为，但不限于细胞。
优选地，用GAPDH作为内参基因组(ΔCt)将Ct值标准化，将每个样品的Ct值相对于内参基因组进行标准化，并使用2-ΔΔCt方法计算相对表达水平。
在一些优选的实施方式中，所述待测生物样品的基因组DNA包括从所述待测生物样品中提取总RNA并反转录得到的cDNA。
需要说明的是，对从待测生物样品中提取总RNA的方法不做限定，例如可以使用Trizol法进行提取，也可以使用试剂盒产品进行提取；同样地，对反转录的方法和条件也不做限定，可以使用市售的常规试剂盒及相匹配的条件进行反转录。
在一些优选的实施方式中，所述荧光定量PCR反应的条件包括：预变性95℃反应5-10min；变性95℃反应10-30s；退火60℃反应30-60s；延伸72℃反20-60s；变性到延伸循环30-40次；
优选地，所述荧光定量PCR反应的条件包括：预变性95℃反应10min；变性95℃反应10s；退火60℃反应30s；延伸72℃反32s；变性到延伸循环40次。
通过对荧光定量PCR反应的条件进行进一步的调整和优化，能够使得检测灵敏度更高，检测结果更加准确。
优选地，所述荧光定量PCR反应完成后，进行溶解程序得到溶解曲线，所述溶解程序的条件包括：依次按照95℃反应15s、60℃反应1min、95℃反应15s和60℃反应15s。
当选择上述条件进行荧光定量PCR反应并生成溶解曲线时，结果特异性更强，鉴定结果更加准确。
在一些优选的实施方式中，所述荧光定量PCR反应的体系包括：引物组溶液1-2μL，UltraSYBR Mixture 8-47μL和模板基因组DNA 1μL。
当选择上述反应体系进行荧光定量PCR反应时，能够在保证结果准确性的同时，有效降低成本。
具体地，所述荧光定量PCR反应的体系包括：引物组溶液1μL，UltraSYBR Mixture8μL和模板基因组DNA 1μL；或者，
所述荧光定量PCR反应的体系包括：引物组溶液1μL，UltraSYBR Mixture 18μL和模板基因组DNA 1μL；或者，
所述荧光定量PCR反应的体系包括：引物组溶液2μL，UltraSYBR Mixture 47μL和模板基因组DNA 1μL。
在一些优选的实施方式中，所述用于鉴定根尖牙乳头干细胞的引物组的浓度至少为2pmol/μL，例如可以为，但不限于2pmol/μL、3pmol/μL、5pmol/μL或8pmol/μL，优选为2-5pmol/μL，更优选为2pmol/μL。
当用于鉴定根尖牙乳头干细胞的引物组的浓度至少为2pmol/μL时，引物相对于模板DNA是过量的，能够保证鉴定结果的准确性和有效性。当用于鉴定根尖牙乳头干细胞的引物组的浓度至少2pmol/μL时，能够在保证结果准确性的同时，有效降低成本。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明实施例中用到的主要试剂信息如下：
Figure BDA0002174420240000121
实施例1
1、总RNA提取
实验前，用RNA抑制剂处理操作环境。以下操作中，带口罩，对盛有枪头、离心管等的锥形瓶，将瓶口水平取物，之后立即盖好瓶口，以免环境污染。
1)倒去培养皿/瓶中的培养基，PBS洗2-3次，加入0.7mL Trizol溶液(红色)，用枪吹散贴附在培养皿/瓶上的细胞，直接转移到1.5mL离心管中，再在培养皿加入0.5mL的Trizol冲洗培养皿收获剩下未完全吹散下来的细胞，转移到同一离心管中，震荡后，室温静置5min。
2)直接加入200μL氯仿，漩涡震荡15s混匀后室温放置2-3min(加入氯仿可以使蛋白、DNA、脂类充分分离)。
3)4℃，12000rpm离心20min。
4)离心后，混合物分成三相，吸取上层水相(水相层的容量约为加入Trizol量的60％)约400μL(黄枪头吸取，其中溶有mRNA)至另一离心管(1.5mL)中，注意不要接触到中间相。
5)加入500μL(理论上与上步骤中吸取的上层水相等体积)异丙醇混匀(用枪吹匀即可)，室温放置10min。
6)4℃，12000rpm离心20min，RNA形成白色小团沉于管底，弃上清。
7)加入0.5-1.0mL无水乙醇，漂洗，倒掉，2次。
8)在室温环境，无菌操作台中，吹干5-10min。
9)用20μL DEPC处理水(无菌水)，吹匀。
10)测OD值定量RNA浓度和纯度，OD260/OD280要在1.8-2.0之间。
2、反转录PCR
得到该组织或细胞中的cDNA，计算2.5μg需要多大体积的样品，并按照总反应体积为10μL在1.5mL离心管中加样。加样表如下：
试剂 用量
cDNA 2.5μg
5×HifiScript RT MasterMix 2μL
RNase-free Water 补足到10μL
混匀反应液，瞬时离心后，37℃孵育15min条件下进行反转录。85℃保温5s以灭活逆转录酶活性，结束反应cDNA产物置冰上进行下一步PCR实验，余下的产物-80℃保存。
3、荧光定量PCR
在200μL PCR管配制反应体系：引物混合液1μL，UltraSYBR Mixture混合物18μL，模板cDNA 1μL，加盖密封，将上述反应放荧光定量PCR仪中，第一步预变性95℃反应10min；第二步变性95℃反应10s；第三步退火60℃反应30s；第四步延伸72℃反32s；第二步到第四步循环40次；进入溶解程序，依次进行95℃反应15s；60℃反应1min；95℃反应15s；60℃反应15s。
所述引物混合液含有如SEQ ID No.1-4所示的引物，其中，所有引物的浓度为2pmol/μl。
用GAPDH作为参考基因组(ΔCt)将Ct值标准化，并使用建立的基于效率的ΔΔCt方法将每个样品与进行比较，作图分析。
4、实例结果
结果如图1和图2所示，从结果图中可以看出，在本实施例中，表达水平高的为根尖牙乳头干细胞SCAP，低的为牙囊干细胞DFSC。
实施例2
加1mL裂解缓冲液于培养皿中裂解细胞，重悬细胞沉淀，冰上静置30min离心，在4℃下以10,000×g，10分钟。小心地分离上清液并转移到新管中。注意也不要吸取到上层的脂肪层和下层沉淀层。BCA蛋白质测定试剂盒测定上清液的蛋白质浓度。
将300μg蛋白转移到新的微量离心管中，用100mM TEAB调节至终体积100μL。加入1.5μL 1M DTT，56℃，1小时。加入8μL 1M IAA，室温避光45min。向反应液中加入50mMNH4HCO3加入2.5μg胰蛋白酶。在37℃下将样品酶解过夜。
向酶解后的样本中，加入FA至终浓度为0.1％，以酸化样品。在C18小柱(waters)中进行脱盐。步骤如下：
活化：乙腈活化洗2次，每次1mL；
平衡：0.1％FA洗2次，每次1mL；
上样：将酸化后的样品上样，反复3次；
脱盐：0.1％FA洗2次，每次1mL；
洗脱：用洗脱液(含50％乙腈，0.1％FA)洗脱，0.8-1mL洗脱。
干燥。不继续下一步时，可冻存于-80℃。
样本重新溶解于100μL 100mM TEAB溶液，混匀，静置10min。TMT标签+41μL无水乙腈，混匀，静置10min。样品+标签。(可以将样品加入到TMT管中)，混匀，室温孵育1h。每个小瓶中加入8μL 5％的羟胺，孵育15min，以终止反应。各取100μL于同一个1.5mL离心管中，混匀。
脱盐：样本重溶100μL 100mM TEAB溶液，混匀。再次脱盐，步骤如上。上机器进行LC-MS/MS检测。
检测结果如图3和图4所示，从图中可以看出，在本实施例中，表达水平高的为根尖牙乳头干细胞SCAP，低的为牙囊干细胞DFSC。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 康妍葆(北京)干细胞科技有限公司
<120> 用于鉴定根尖牙乳头干细胞的引物组、试剂、试剂盒、应用和鉴定方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcaggcctac cagagagatg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcacctctga cacagcaaaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccccgaggtc tcttaggtgt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaaaggacgg cactgagaag 20

Claims (9)

1.引物组在区分根尖牙乳头干细胞和牙囊干细胞中的应用；
所述引物组包括用于检测NPC1的引物和用于检测HMGA1的引物；
其中NPC1-F如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，NPC1-R如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
HMGA1-F如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，HMGA1-R如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
2.一种区分根尖牙乳头干细胞和牙囊干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
以待测生物样品的基因组DNA为模板，利用权利要求1中所述的引物组进行荧光定量PCR反应，根据基因的相对表达水平，确定所述待测生物样品是否为根尖牙乳头干细胞；
当所述基因的表达水平显著高时，所述待测生物样品为根尖牙乳头干细胞，当所述基因的表达水平显著低时，所述待测生物样品为牙囊干细胞；
所述待测生物样品为根尖牙乳头干细胞和牙囊干细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述待测生物样品的基因组DNA包括从所述待测生物样品中提取总RNA并反转录得到的cDNA。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，荧光定量PCR反应的条件包括：预变性95℃反应5-10min；变性95℃反应10-30s；退火60℃反应30-60s；延伸72℃反20-60s；变性到延伸循环30-40次。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，荧光定量PCR反应完成后，进行溶解程序得到溶解曲线，所述溶解程序的条件包括：依次按照95℃反应15s、60℃反应1min、95℃反应15s和60℃反应15s。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，荧光定量PCR反应的体系包括：引物组溶液1-2μL，UltraSYBR Mixture 8-47μL和模板基因组DNA1μL。
7.根据权利要求2-6任一项所述的方法，其特征在于，引物组的浓度至少为2pmol/μL。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，引物组的浓度为2-5pmol/μL。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，引物组的浓度为2pmol/μL。
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Homo sapiens NPC intracellular cholesterol transporter 1 (NPC1), mRNA，Genbank，登录号：NM_000271.5;Chery J.等;《Genbank》;20190807;全文 *
SCAPs regulate differentiation of DFSCs during tooth root development in swine;Xiaoshan Wu等;《INT.J.MED.SCI.》;20180119;第15卷(第4期);291-299 *

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