CN110358824A - 一种检测他克莫司药物个体化用药基因检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测他克莫司药物个体化用药基因检测试剂盒，包括以下成分：CYP3A5*3（‑253‑1A>G）和POR（1508C>T）位点区域PCR扩增与测序引物2对，PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、DNA测序试剂；测序引物为：CYP3A5*3（‑253‑1A>G）位点：正向引物TGCCCTTGCAGCATTTAG，反向引物ACACCCAGGAAGCCAGAC；POR（1508C>T）位点：正向引物GGTGGTTGTGGAGTACGAGA，反向引物CGCTCCTGGATGAAGCCTAT。本次试剂盒用于CYP3A5*3（‑253‑1A>G）和POR（1508C>T）基因分型检测，通过该项目检测可以明确个体药物代谢类型（正常代谢型/慢代谢型），调整用药剂量，提高药物疗效，降低药物毒副作用，实现个体化治疗。

Description

一种检测他克莫司药物个体化用药基因检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种检测他克莫司药物个体化用药基因检测试剂盒。
背景技术
钙神经素抑制剂他克莫司是从链霉菌的代谢物中分离得到的一种大环内酯类抗生素，于1989年用于临床。它主要是通过特异性抑制神经钙调磷酸酶活性，从而阻滞T细胞激活过程，同时也有环孢霉素所不具备的T细胞依赖性抗体的生成，阻滞细胞因子的转录，呈现双重的免疫抑制作用。他克莫司主要用于肝脏或肾脏移植术后的移植物排斥反应。然而由于他克莫司治疗窗窄，药代学个体差异大，按常规剂量进行给药，部分患者由于给药剂量过低引起“免疫抑制不足”，或者给药剂量过高造成“免疫抑制过度”导致感染及肝脏毒性等不良反应。
研究表明，20％-95％的药物反应和个体差异是由遗传因素引起的。他克莫司主要由细胞色素P450酶代谢，其表达量及活性与编码酶的基因多态性有一定关系。肝脏酶CYP3A5酶活性的变化影响他克莫司的代谢速率，CYP3A5*3/*3会引起前体mRNA可变性剪接，产生不稳定蛋白，携带该基因型的患者不表达CYP3A5代谢酶，使他克莫司药物在体内的代谢为慢代谢型，药物在体内不断蓄积而产生严重的不良反应。CYP450氧化还原酶(POR)是定位于内质网上的一种重要的黄素蛋白，负责甾醇激素、胆固醇、胆酸、维生素及临床上超过80％药物的氧化代谢。编码人POR基因具有很强的基因多态性，目前已有800个POR单核苷酸多态性和48个等位基因位点，其中突变频率最高的是POR*28，中国裔美国人为36.7％。有研究表明，POR*28基因突变能够显著增加CYP3A5表达者他克莫司的代谢。
现有技术主要存在如下技术问题：缺少一种针对中国人群的、且检测灵敏度高准确率高的他克莫司个体化用药基因检测试剂盒。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种检测他克莫司药物个体化用药基因检测试剂盒，以解决上述背景技术中的问题。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：一种检测他克莫司药物个体化用药基因检测试剂盒，包括以下成分：CYP3A5*3(-253-1A>G)和POR(1508C>T)位点区域PCR扩增与测序引物2对，PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、DNA测序试剂；测序引物为：CYP3A5*3(-253-1A>G)位点：正向引物TGCCCTTGCAGCATTTAG，反向引物ACACCCAGGAAGCCAGAC；POR(1508C>T)位点：正向引物GGTGGTTGTGGAGTACGAGA，反向引物CGCTCCTGGATGAAGCCTAT。
所述PCR扩增试剂包括dNTP、Taq DNA聚合酶。
所述PCR产物纯化试剂包括SAP酶、ExoI酶。
所述DNA测序试剂包括BigDye mix、EDTA溶液、乙醇溶液、Hi-Di溶液。
一种检测他克莫司药物个体化用药基因检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
步骤(1)提取样本的基因组DNA；
步骤(2)CYP3A5*3(-253-1A>G)和POR(1508C>T)位点区域PCR扩增；
步骤(3)PCR产物纯化：每个反应体系总体积为5.6μL，PCR产物4μL，再加入1.6μLSAP酶混合物，反应条件为37℃下45min，85℃下15min；
步骤(4)DNA测序反应，每个反应的体系为总体积10μL，PCR酶解产物1μL、BigDyemix(Bigdye、5×seq)2.2μL和测序引物0.5μL，加水补足10μL；反应条件为96℃1min，进行33个循环的96℃10sec，56℃10sec，60℃2.5min；反应结束后每管内加入2.5μL EDTA，30μL100％乙醇，盖好，震荡4次，避光静置15min，3860rpm，25℃下离心40min，吸弃上层液体；加入100μL 70％预冷乙醇，盖好，3860rpm，25℃下离心15min，吸弃上层液体；让酒精在室温挥发干净，加入8μL Hi-Di溶解DNA；在PCR仪上变性：95℃下4min，冰上静置4min；放入测序仪中。
所述步骤(2)中CYP3A5*3(-253-1A>G)和POR(1508C>T)位点区域使用引物序列PCR扩增，每个反应体系为总体积16μL，包含Taq酶混合液7.5μL(dNTP、l0×PCR反应缓冲液、MgCl2)、去离子水5.5μL、引物对(l0uM)1μL、基因组DNA(100ng/ul)1ul；反应条件为95℃15min，进行14个循环(-0.5℃/循环)的94℃30sec，63℃30sec，72℃45sec；然后进行30个循环的94℃30sec，56℃30sec，72℃45sec，最后进行72℃10min；
所述Taq酶混合液包括dNTP、l0×PCR反应缓冲液、MgCl2，引物对浓度为10μM，基因组DNA浓度为100ng/μL。
所述步骤(3)中SAP酶混合物包括SAP酶、ExoI酶、去离子水。
与已公开技术相比，本发明存在以下优点：本次试剂盒用于CYP3A5*3(-253-1A>G)和POR(1508C>T)基因分型检测，通过该项目检测可以明确个体药物代谢类型(正常代谢型/慢代谢型)，调整用药剂量，提高药物疗效，降低药物毒副作用，实现个体化治疗。
附图说明
图1为CYP3A5*3(-253-1A>G)位点无突变对比示意图。
图2为POR(1508C>T)位点无突变对比示意图。
图3为CYP3A5*3(-253-1A>G)位点存在突变对比示意图。
图4为POR(1508C>T)位点存在突变对比示意图。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、创作特征、工作流程、使用方法达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以两个元件内部的连通，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种检测他克莫司药物个体化用药基因检测试剂盒，包括以下成分：
(1)CYP3A5*3(-253-1A>G)和POR(1508C>T)位点扩增和测序引物2对，每条引物1OD，引物序列参见表1；
(2)PCR扩增试剂：Taq酶混合液15μL(dNTP、l0×PCR反应缓冲液、MgCl2)；
(3)PCR产物纯化试剂：3.2μL SAP酶混合物(SAP酶、ExoI酶、去离子水)；
(4)测序试剂：4.4μL BigDye mix(Bigdye、5×seq)、5μL EDTA、60μL乙醇溶液(100％)、200μL乙醇溶液(70％)、16μL Hi-Di。
本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
实施例2
一种检测他克莫司药物个体化用药基因检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)提取样本的基因组DNA；
(2)CYP3A5*3(-253-1A>G)和POR(1508C>T)位点的PCR扩增
针对CYP3A5*3(-253-1A>G)和POR(1508C>T)位点按照表1设计引物进行PCR扩增。每个反应体系为总体积16μL，包含Taq酶混合液7.5μL(dNTP、l0×PCR反应缓冲液、MgCl2)、去离子水5.5μL、引物对(l0uM)1μL、基因组DNA(100ng/ul)1ul；反应条件为95℃15min，进行14个循环(-0.5℃/循环)的94℃30sec，63℃30sec，72℃45sec；然后进行30个循环的94℃30sec，56℃30sec，72℃45sec，最后进行72℃10min；
(3)PCR产物纯化
每个反应体系为总体积5.6μL。PCR产物4μL，再加入1.6μL SAP酶混合物(SAP酶、ExoI酶、去离子水)。反应条件为37℃45min，85℃15min。
(4)DNA测序反应
每个反应的体系为总体积10μL，PCR酶解产物1μL、BigDye mix(Bigdye、5×seq)2.2μL和测序引物0.5μL，加水补足10μL。反应条件为96℃1min，进行33个循环的96℃10sec，56℃10sec，60℃2.5min。
反应结束后每管内加入2.5μL EDTA，30μL100％乙醇，盖好，震荡4次，避光静置15分钟，3860rpm，25℃离心40min，吸弃上层液体；加入100μL 70％预冷乙醇，盖好，3860rpm，25℃离心15min，吸弃上层液体；让酒精在室温挥发干净，加入8μL Hi-Di溶解DNA；在PCR仪上变性：95℃4min，冰上静置4min。放入测序仪中。
(5)结果分析
对CYP3A5*3(-253-1A>G)和POR(1508C>T)位点进行直接测序，在测序仪上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果。将测定的各样本序列与GenBank数据库CYP3A5*3基因序列(NM_001291829.1)POR基因序(NM_00941.2)进行比较。
本发明可以通过CYP3A5*3(-253-1A>G)和POR(1508C>T)基因分型检测，使用关键技术为Sanger测序(准确率大于99.9％)，通过该项目检测可以明确个体药物代谢类型(正常代谢型/慢代谢型)，调整用药剂量，提高药物疗效，降低药物毒副作用，实现个体化治疗。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明的要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种检测他克莫司药物个体化用药基因检测试剂盒，其特征在于：包括以下成分：CYP3A5*3(-253-1A>G)和POR(1508C>T)位点区域PCR扩增与测序引物2对，PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、DNA测序试剂；测序引物为：CYP3A5*3(-253-1A>G)位点：正向引物TGCCCTTGCAGCATTTAG，反向引物ACACCCAGGAAGCCAGAC；POR(1508C>T)位点：正向引物GGTGGTTGTGGAGTACGAGA，反向引物CGCTCCTGGATGAAGCCTAT。
2.根据权利要求1所述的一种检测他克莫司药物个体化用药基因检测试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增试剂包括dNTP、Taq DNA聚合酶。
3.根据权利要求1所述的一种检测他克莫司药物个体化用药基因检测试剂盒，其特征在于：所述PCR产物纯化试剂包括SAP酶、ExoI酶。
4.根据权利要求1所述的一种检测他克莫司药物个体化用药基因检测试剂盒，其特征在于：所述DNA测序试剂包括BigDye mix、EDTA溶液、乙醇溶液、Hi-Di溶液。
5.一种检测他克莫司药物个体化用药基因检测试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤(1)提取样本的基因组DNA；
步骤(2)CYP3A5*3(-253-1A>G)和POR(1508C>T)位点区域PCR扩增；
步骤(3)PCR产物纯化：每个反应体系总体积为5.6μL，PCR产物4μL，再加入1.6μL SAP酶混合物，反应条件为37℃下45min，85℃下15min；
步骤(4)DNA测序反应，每个反应的体系为总体积10μL，PCR酶解产物1μL、BigDye mix(Bigdye、5×seq)2.2μL和测序引物0.5μL，加水补足10μL；反应条件为96℃1min，进行33个循环的96℃10sec，56℃10sec，60℃2.5min；反应结束后每管内加入2.5μL EDTA，30μL100％乙醇，盖好，震荡4次，避光静置15min，3860rpm，25℃下离心40min，吸弃上层液体；加入100μL 70％预冷乙醇，盖好，3860rpm，25℃下离心15min，吸弃上层液体；让酒精在室温挥发干净，加入8μL Hi-Di溶解DNA；在PCR仪上变性：95℃下4min，冰上静置4min；放入测序仪中。
6.根据权利要求5所述的一种检测他克莫司药物个体化用药基因检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤(2)中CYP3A5*3(-253-1A>G)和POR(1508C>T)位点区域使用引物序列PCR扩增，每个反应体系为总体积16μL，包含Taq酶混合液7.5μL(dNTP、l0×PCR反应缓冲液、MgCl2)、去离子水5.5μL、引物对(l0uM)1μL、基因组DNA(100ng/ul)1ul；反应条件为95℃15min，进行14个循环(-0.5℃/循环)的94℃30sec，63℃30sec，72℃45sec；然后进行30个循环的94℃30sec，56℃30sec，72℃45sec，最后进行72℃10min。
7.根据权利要求6所述的一种检测他克莫司药物个体化用药基因检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述Taq酶混合液包括dNTP、l0×PCR反应缓冲液、MgCl2，引物对浓度为10μM，基因组DNA浓度为100ng/μL。
8.根据权利要求5所述的一种检测他克莫司药物个体化用药基因检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤(3)中SAP酶混合物包括SAP酶、ExoI酶、去离子水。
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