CN107904312A - 检测pml基因突变的方法、引物和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测PML基因突变的引物和方法，其包括(i)扩增PML基因所有外显子序列的引物；(ii)采用Sanger测序技术和测序引物。本发明可快速地将体内PML基因所有外显子中的突变检测出来。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测与急性早幼粒白血病(APL)发生有关的PML基因突变的引物、方法和试剂盒。
背景技术
急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)是一种起病凶险的恶性血液病，单纯依赖化疗，患者复发率高，总体生存较差。APL在中国人群中的发病率较其他人群高，可高达AML的17％～25.3％。APL的分子遗传学标志是PML-RARA融合基因的形成，产生的PML-RARA融合蛋白不仅是APL的分子标志，而且在APL发病中起关键作用。PML-RARA融合蛋白可以与维甲酸受体(RXR)结合，中断正常的维甲酸信号通路，抑制基因转录，阻滞粒细胞分化，最终导致APL的发生。近来研究表明PML-RARA的降解在APL白血病干细胞(leukemia-initiating cell,LIC)的清除中起着重要的作用。
PML基因位于15号染色体，包含10个外显子，属于TRIM家族。PML选择性剪接产生了不同分子量的亚型：PMLI是最长的亚型，由882个氨基酸组成，最短的亚型是PMLVIIb，仅有435个氨基酸构成。RBCC/TRIM结构域存在于所有的PML亚型中，由外显子1～3编码。RBCC结构域有一个末端环指结构域(R)、两个B-box结构域(B1和B2)和一个α螺旋卷曲螺旋结构域组成。PML蛋白具有多种生物学活性，包括抗病毒活性、肿瘤抑制作用、参与祖细胞分化、调节基因转录、诱导细胞凋亡等等。有研究表明PML的降解对于慢性粒细胞白血病(CML)静止期LIC的清除有重要作用。PML的类泛素化促进前髓细胞白血病核小体(PML-NBs)形成，从而促进PML依赖的肿瘤抑制效应。
三氧化二砷(As203)治疗可以使APL患者达到完全缓解，能够选择性地作用于PML-RARA和PML，导致蛋白降解。As203能够促进PML的核基质转移、SUMO化修饰和降解，在6h左右能够促进PML-NBs的增大；对于APL细胞，As203在12h左右能够促使PML-NBs重新形成，24h左右能够促使PML-RARA的降解。有研究显示As203对PML-RARA有类似的生物学效应，而对RARA则没有作用，这也说明PML-RARA融合蛋白中的PML部分是As203的直接作用靶点。
2014年最新版美国权威指南NCCN(National Comprehensive Cancer Network)和我国急性早幼粒细胞白血病诊治指南均新增维甲酸+砷剂作为APL患者的一线选择推荐。黄晓军课题组在一项研究中首次发现4个新的PML突变位点——A216T/S214L/L217F/S220G，并提出砷剂耐药时PML突变存在一个“突变热点区(C202-S220)”，该热点突变区位于PML基因的外显子3，即RBCC结构域中的B2结构域。文献报道指出，A216V、S214L、A216T对砷剂治疗具有强耐受，L217F、S220G对砷剂治疗表现弱耐受。这些发现完善了人们对APL患者砷剂耐药机制的认识。
因此，对PML基因多态性的检测，将有助于APL患者在砷剂治疗过程中进行耐药监测，从而及时调整治疗方案，提高治愈率，减少复发，在临床上具有重要的意义，有望实现APL的分层治疗和个性化治疗，并为下一步克服耐药的研究提供靶点。
发明内容
本发明的目的在于提供检测PML基因突变的引物，所述引物包括：至少一对扩增引物用于扩增PML基因，所述至少一对扩增引物选自
PML-Exon1-F/PML-Exon1-R、PML-Exon2-F/PML-Exon2-R、
PML-Exon3-F/PML-Exon3-R、PML-Exon4-F/PML-Exon4-R、
PML-Exon5/6-F/PML-Exon5/6-R、PML-Exon7-F/PML-Exon7-R、
PML-Exon8-F/PML-Exon8-R、PML-Exon9-F/PML-Exon9-R、
PML-Exon10-F/PML-Exon10-R，其碱基序列为：
PML-Exon1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCTTTACCGTAAGTCAG
PML-Exon1-R：AACAGCTATGACCATGCAAATCCTCCGTTAGACCC
PML-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGCTTTTGGGACTTCTC
PML-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGCCTCTACCTGGTACTTGGA
PML-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGATAGTGCCTTTGGC
PML-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGCTGTGCCCTGGAACCTAA
PML-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCACTCTAATGCCACCTC
PML-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGGACCTCAAACCCATCTCAG
PML-Exon5/6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAAAGGAGGTGATGTGATGG
PML-Exon5/6-R：AACAGCTATGACCATGGGTGAGACTGCCTTGGAG
PML-Exon7-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATAGATAAGGCACAGCAAGA
PML-Exon7-R：AACAGCTATGACCATGCCCTGGGACCTGAAATGG
PML-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAATCCCTGACGCTTGGTT
PML-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGGGCTCTGCCTGCACTTCT
PML-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCTATCCCACCACAACC
PML-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGCGGCCTTGGAGTAGATGC
PML-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCCTCTTTGGCACATTA
PML-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGAGAAGGAGACCCTGGAGC。
进一步地，还包括一对测序引物M13F和M13R，其碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
本发明的目的还在于提供一种检测PML基因突变的方法，包括以下步骤：
(1)提取样本中的DNA；
(2)利用至少一对扩增引物对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；
(3)利用一对测序引物对(2)中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的碱基序列；
(4)将(3)中的碱基序列与PML基因外显子野生型参考序列进行比较，确定突变位点是否存在，所述至少一对扩增引物选自PML-Exon1-F/PML-Exon1-R、
PML-Exon2-F/PML-Exon2-R、PML-Exon3-F/PML-Exon3-R、
PML-Exon4-F/PML-Exon4-R、PML-Exon5/6-F/PML-Exon5/6-R、
PML-Exon7-F/PML-Exon7-R、PML-Exon8-F/PML-Exon8-R、
PML-Exon9-F/PML-Exon9-R、PML-Exon10-F/PML-Exon10-R；所述一对测序引物选自M13F和M13R，其碱基序列为：
PML-Exon1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCTTTACCGTAAGTCAG
PML-Exon1-R：AACAGCTATGACCATGCAAATCCTCCGTTAGACCC
PML-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGCTTTTGGGACTTCTC
PML-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGCCTCTACCTGGTACTTGGA
PML-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGATAGTGCCTTTGGC
PML-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGCTGTGCCCTGGAACCTAA
PML-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCACTCTAATGCCACCTC
PML-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGGACCTCAAACCCATCTCAG
PML-Exon5/6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAAAGGAGGTGATGTGATGG
PML-Exon5/6-R：AACAGCTATGACCATGGGTGAGACTGCCTTGGAG
PML-Exon7-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATAGATAAGGCACAGCAAGA
PML-Exon7-R：AACAGCTATGACCATGCCCTGGGACCTGAAATGG
PML-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAATCCCTGACGCTTGGTT
PML-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGGGCTCTGCCTGCACTTCT
PML-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCTATCCCACCACAACC
PML-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGCGGCCTTGGAGTAGATGC
PML-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCCTCTTTGGCACATTA
PML-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGAGAAGGAGACCCTGGAGC；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
本发明的目的还在于一种检测PML基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR扩增反应液、测序体系试剂，其中，检测体系PCR扩增反应液包括至少一对扩增引物，所述测序体系试剂包括一对测序引物，所述至少一对扩增引物选自PML-Exon1-F/PML-Exon1-R、PML-Exon2-F/PML-Exon2-R、
PML-Exon3-F/PML-Exon3-R、PML-Exon4-F/PML-Exon4-R、
PML-Exon5/6-F/PML-Exon5/6-R、PML-Exon7-F/PML-Exon7-R、
PML-Exon8-F/PML-Exon8-R、PML-Exon9-F/PML-Exon9-R、
PML-Exon10-F/PML-Exon10-R；所述一对测序引物选自M13F和M13R，其碱基序列为：
PML-Exon1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCTTTACCGTAAGTCAG
PML-Exon1-R：AACAGCTATGACCATGCAAATCCTCCGTTAGACCC
PML-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGCTTTTGGGACTTCTC
PML-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGCCTCTACCTGGTACTTGGA
PML-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGATAGTGCCTTTGGC
PML-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGCTGTGCCCTGGAACCTAA
PML-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCACTCTAATGCCACCTC
PML-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGGACCTCAAACCCATCTCAG
PML-Exon5/6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAAAGGAGGTGATGTGATGG
PML-Exon5/6-R：AACAGCTATGACCATGGGTGAGACTGCCTTGGAG
PML-Exon7-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATAGATAAGGCACAGCAAGA
PML-Exon7-R：AACAGCTATGACCATGCCCTGGGACCTGAAATGG
PML-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAATCCCTGACGCTTGGTT
PML-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGGGCTCTGCCTGCACTTCT
PML-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCTATCCCACCACAACC
PML-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGCGGCCTTGGAGTAGATGC
PML-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCCTCTTTGGCACATTA
PML-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGAGAAGGAGACCCTGGAGC；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，所述检测体系PCR扩增反应液还包括2×PCR Buffer、dNTPs和KOD FXDNA Polymerase。
进一步地，所述测序体系试剂还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。
进一步地，所述测序纯化液包括核酸外切酶I和牛小肠碱性磷酸酶。
进一步地，所述试剂盒还包括空白对照品。
本发明的有益效果：(1)本发明设计了扩增PML基因全部10个外显子序列的引物，并且通过加接头，使所有9对引物的PCR产物均可以用一种测序引物进行测序；(2)采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系，通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳，此外，PML基因的突变类型种类繁多且遍布整个基因，因此本发明所述引物既能将所述PML全外显子序列都扩增出来，也保证无论这些外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况；(3)相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度，这是因为荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大；(4)基于PML不同外显子的序列特征，本发明让PML基因的外显子5和外显子6共用一对扩增引物，即利用一对扩增引物PML-Exon5/6-F和PML-Exon5/6-R将PML基因的外显子5和外显子一起扩增，而不用分别针对外显子5和外显子6设计一对扩增引物，这不仅能够降低设计的扩增引物数量，而且还能有效地节省检测试剂用量和检测成本。
附图说明
图1为PML基因在人染色体上定位图。
图2～10为9对引物扩增PML基因10个外显子的PCR产物电泳图，M为Marker DL2000，1～16为送检的血液样本1～16号。
图11～19分别为样本1的PML基因第1～10号外显子野生型测序截图。
图11显示是样本1的PML基因1号外显子野生型测序截图。
图12显示是样本1的PML基因2号外显子野生型测序截图。
图13显示是样本1的PML基因3号外显子野生型测序截图。
图14显示是样本1的PML基因4号外显子野生型测序截图。
图15显示是样本1的PML基因5、6号外显子野生型测序截图。
图16显示是样本1的PML基因7号外显子野生型测序截图。
图17显示是样本1的PML基因8号外显子野生型测序截图。
图18显示是样本1的PML基因9号外显子野生型测序截图。
图19显示是样本1的PML基因10号外显子野生型测序截图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
一种检测PML基因突变的引物，所述引物是针对PML全部外显子设计的，包括：
(1)扩增PML基因第1外显子序列的引物：
PML-Exon1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCTTTACCGTAAGTCAG
PML-Exon1-R：AACAGCTATGACCATGCAAATCCTCCGTTAGACCC；
(2)扩增PML基因第2外显子序列的引物：
PML-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGCTTTTGGGACTTCTC
PML-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGCCTCTACCTGGTACTTGGA；
(3)扩增PML基因第3外显子序列的引物：
PML-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGATAGTGCCTTTGGC
PML-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGCTGTGCCCTGGAACCTAA；
(4)扩增PML基因第4外显子序列的引物：
PML-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCACTCTAATGCCACCTC
PML-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGGACCTCAAACCCATCTCAG；
(5)扩增PML基因第5/6外显子序列的引物：
PML-Exon5/6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAAAGGAGGTGATGTGATGG
PML-Exon5/6-R：AACAGCTATGACCATGGGTGAGACTGCCTTGGAG；
(6)扩增PML基因第7外显子序列的引物：
PML-Exon7-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATAGATAAGGCACAGCAAGA
PML-Exon7-R：AACAGCTATGACCATGCCCTGGGACCTGAAATGG；
(7)扩增PML基因第8外显子序列的引物：
PML-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAATCCCTGACGCTTGGTT
PML-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGGGCTCTGCCTGCACTTCT。
(8)扩增PML基因第9外显子序列的引物：
PML-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCTATCCCACCACAACC
PML-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGCGGCCTTGGAGTAGATGC；
(9)扩增PML基因第10外显子序列的引物：
PML-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCCTCTTTGGCACATTA
PML-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGAGAAGGAGACCCTGGAGC；
特别地，所述引物还包括一对测序引物M13F和M13R，所述测序碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
一种检测PML基因突变的试剂盒，包括
(1)检测体系PCR反应液；
(2)测序体系试剂；
检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；扩增PML基因的至少一对扩增引物，所述至少一对扩增引物选自PML-Exon1-F(10μM)/PML-Exon1-R(10μM)、PML-Exon2-F(10μM)/PML-Exon2-R(10μM)、PML-Exon3-F(10μM)/PML-Exon3-R(10μM)、PML-Exon4-F(10μM)/PML-Exon4-R(10μM)、PML-Exon5/6-F(10μM)/PML-Exon5/6-R(10μM)、PML-Exon7-F(10μM)/PML-Exon7-R(10μM)、PML-Exon8-F(10μM)/PML-Exon8-R(10μM)、PML-Exon9-F(10μM)/PML-Exon9-R(10μM)、PML-Exon10-F(10μM)/PML-Exon10-R(10μM)，其中，这些扩增引物的序列为：
PML-Exon1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCTTTACCGTAAGTCAG
PML-Exon1-R：AACAGCTATGACCATGCAAATCCTCCGTTAGACCC
PML-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGCTTTTGGGACTTCTC
PML-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGCCTCTACCTGGTACTTGGA
PML-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGATAGTGCCTTTGGC
PML-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGCTGTGCCCTGGAACCTAA
PML-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCACTCTAATGCCACCTC
PML-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGGACCTCAAACCCATCTCAG
PML-Exon5/6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAAAGGAGGTGATGTGATGG
PML-Exon5/6-R：AACAGCTATGACCATGGGTGAGACTGCCTTGGAG
PML-Exon7-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATAGATAAGGCACAGCAAGA
PML-Exon7-R：AACAGCTATGACCATGCCCTGGGACCTGAAATGG
PML-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAATCCCTGACGCTTGGTT
PML-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGGGCTCTGCCTGCACTTCT
PML-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCTATCCCACCACAACC
PML-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGCGGCCTTGGAGTAGATGC
PML-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCCTCTTTGGCACATTA
PML-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGAGAAGGAGACCCTGGAGC。
测序体系试剂包括：测序纯化液，包括0.6U核酸外切酶I(ExoI)和1.2U小牛肠碱性磷酸酶(CIP)；EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)：一对测序引物M13F(3.2μm)和M13R(3.2μm),以及Bigdye Terminator V3.1(购买自美国AppliedBiosystems公司)，其中，这对测序引物的序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
优选地，该试剂盒还包括血液DNA抽提试剂。所述血液DNA抽提试剂，可自行配制，也可从市场上购买，如购买天根生物科技有限公司购买的血液DNA抽提试剂。
优选地，该试剂盒还包括空白对照品。空白对照品为2μl生理盐水或不加任何物质。
实施例2
血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液样本中的组织DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中，获得样本DNA溶液。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份19μl分装：
X＝19μl反应液×(n份标本+1份空白对照品)
n为检测标本数。
(3)加样：将(1)中获得的样本DNA溶液以及空白对照品各取1μL分别加入反应管中。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。PCR扩增反应条件如表1所示。测体系PCR扩增反应液配制方法如表2所示。用于PCR扩增的每对引物的相关性质如表3所示。
表1.PCR扩增反应条件
表2.检测体系PCR扩增反应液配制
注：表中的PrimerF/PrimerR选自PML-Exon1-F/PML-Exon1-R、
PML-Exon2-F/PML-Exon2-R、PML-Exon3-F/PML-Exon3-R、PML-Exon4-F/PML-Exon4-R、PML-Exon5/6-F/PML-Exon5/6-R、PML-Exon7-F/PML-Exon7-R、PML-Exon8-F/PML-Exon8-R、PML-Exon9-F/PML-Exon9-R、PML-Exon10-F/PML-Exon10-R。PCR所用KOD FOX由TOYOBO公司提供，引物PrimerF和PrimerR由上海英潍捷基公司合成。
表3.PCR扩增时每对扩增引物的相关性质
(5)电泳：对(4)中的扩增产物进行电泳，电泳条件为1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，25min。电泳结束后，进行凝胶成像系统观察。
如图2～10所示，即取16例血液样本以PML-Exon1-F/PML-Exon1-R、
PML-Exon2-F/PML-Exon2-R、PML-Exon3-F/PML-Exon3-R、
PML-Exon4-F/PML-Exon4-R、PML-Exon5/6-F/PML-Exon5/6-R、
PML-Exon7-F/PML-Exon7-R、PML-Exon8-F/PML-Exon8-R、
PML-Exon9-F/PML-Exon9-R、PML-Exon10-F/PML-Exon10-R引物扩增后所得产物的电泳图谱。本发明扩增的片段长度分别为490bp、572bp、589bp、320bp、927bp、338bp、258bp、275bp、474bp，通过电泳图的分析表明本发明所述
PML-Exon1-F/PML-Exon1-R、PML-Exon2-F/PML-Exon2-R、
PML-Exon3-F/PML-Exon3-R、PML-Exon4-F/PML-Exon4-R、
PML-Exon5/6-F/PML-Exon5/6-R、PML-Exon7-F/PML-Exon7-R、
PML-Exon8-F/PML-Exon8-R、PML-Exon9-F/PML-Exon9-R、
PML-Exon10-F/PML-Exon10-R扩增有效，且条带单一。
(6)Sanger测序：
取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照表4所示的程序进行纯化：
表4
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照表5的体系进行混合：
表5
测序反应程序如表6所示：
表6
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15l无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50 l70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl Hi-Di后进行变性试验。变性程序：
变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断：分别将测序结果与PML野生型参考序列(Genbank：NC_000015.10)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取16例的临床样本(样本编号为1～16)按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。每份样本加入检测体系PCR反应液中1μl。电泳结果如图2～10所示，表明本发明所述引物PML-Exon1-F/PML-Exon1-R、
PML-Exon2-F/PML-Exon2-R、PML-Exon3-F/PML-Exon3-R、
PML-Exon4-F/PML-Exon4-R、PML-Exon5/6-F/PML-Exon5/6-R、
PML-Exon7-F/PML-Exon7-R、PML-Exon8-F/PML-Exon8-R、
PML-Exon9-F/PML-Exon9-R、PML-Exon10-F/PML-Exon10-R对这16例血液样本能有效扩增，且条带单一。
样本1的部分检测结果如图11、12、13、14、15、16、17、18、19所示。从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了，能够扩增出PML基因全部10个外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确地扩增出PML基因全外显子，无论是野生型还是突变型。
序列表
<110> 南昌艾迪康医学检验实验室有限公司
<120> 检测PML基因突变的方法、引物和试剂盒
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtcc gctttaccgt aagtcag 37
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacagctatg accatgcaaa tcctccgtta gaccc 35
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtaaaacga cggccagtgg gcttttggga cttctc 36
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacagctatg accatgcctc tacctggtac ttgga 35
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtaaaacga cggccagtca ggatagtgcc tttggc 36
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aacagctatg accatgctgt gccctggaac ctaa 34
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgtaaaacga cggccagtgc actctaatgc cacctc 36
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacagctatg accatggacc tcaaacccat ctcag 35
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgtaaaacga cggccagtaa aggaggtgat gtgatgg 37
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aacagctatg accatgggtg agactgcctt ggag 34
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgtaaaacga cggccagtat agataaggca cagcaaga 38
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aacagctatg accatgccct gggacctgaa atgg 34
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgtaaaacga cggccagtaa tccctgacgc ttggtt 36
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aacagctatg accatgggct ctgcctgcac ttct 34
<210> 15
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgtaaaacga cggccagtct gctatcccac cacaacc 37
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aacagctatg accatgcggc cttggagtag atgc 34
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgtaaaacga cggccagtgc cctctttggc acatta 36
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aacagctatg accatgagaa ggagaccctg gagc 34
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aacagctatg accatg 16
Claims (8)
1.检测PML基因突变的引物，其特征在于，包括：至少一对扩增引物用于扩增PML基因，所述至少一对扩增引物选自PML-Exon1-F/PML-Exon1-R、PML-Exon2-F/PML-Exon2-R、PML-Exon3-F/PML-Exon3-R、PML-Exon4-F/PML-Exon4-R、PML-Exon5/6-F/PML-Exon5/6-R、PML-Exon7-F/PML-Exon7-R、PML-Exon8-F/PML-Exon8-R、PML-Exon9-F/PML-Exon9-R、PML-Exon10-F/PML-Exon10-R，其碱基序列为：
PML-Exon1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCTTTACCGTAAGTCAG
PML-Exon1-R：AACAGCTATGACCATGCAAATCCTCCGTTAGACCC
PML-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGCTTTTGGGACTTCTC
PML-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGCCTCTACCTGGTACTTGGA
PML-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGATAGTGCCTTTGGC
PML-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGCTGTGCCCTGGAACCTAA
PML-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCACTCTAATGCCACCTC
PML-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGGACCTCAAACCCATCTCAG
PML-Exon5/6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAAAGGAGGTGATGTGATGG
PML-Exon5/6-R：AACAGCTATGACCATGGGTGAGACTGCCTTGGAG
PML-Exon7-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATAGATAAGGCACAGCAAGA
PML-Exon7-R：AACAGCTATGACCATGCCCTGGGACCTGAAATGG
PML-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAATCCCTGACGCTTGGTT
PML-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGGGCTCTGCCTGCACTTCT
PML-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCTATCCCACCACAACC
PML-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGCGGCCTTGGAGTAGATGC
PML-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCCTCTTTGGCACATTA
PML-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGAGAAGGAGACCCTGGAGC。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括一对测序引物M13F和M13R，其碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
3.一种检测PML基因突变的方法，包括以下步骤：
(1)提取样本中的DNA；
(2)利用至少一对扩增引物对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；
(3)利用一对测序引物对(2)中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的碱基序列；
(4)将(3)中的碱基序列与PML基因外显子野生型参考序列进行比较，确定突变位点是否存在，其特征在于，所述至少一对扩增引物选自PML-Exon1-F/PML-Exon1-R、PML-Exon2-F/PML-Exon2-R、PML-Exon3-F/PML-Exon3-R、PML-Exon4-F/PML-Exon4-R、PML-Exon5/6-F/PML-Exon5/6-R、PML-Exon7-F/PML-Exon7-R、PML-Exon8-F/PML-Exon8-R、PML-Exon9-F/PML-Exon9-R、PML-Exon10-F/PML-Exon10-R；所述一对测序引物选自M13F和M13R，其碱基序列为：
PML-Exon1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCTTTACCGTAAGTCAG
PML-Exon1-R：AACAGCTATGACCATGCAAATCCTCCGTTAGACCC
PML-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGCTTTTGGGACTTCTC
PML-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGCCTCTACCTGGTACTTGGA
PML-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGATAGTGCCTTTGGC
PML-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGCTGTGCCCTGGAACCTAA
PML-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCACTCTAATGCCACCTC
PML-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGGACCTCAAACCCATCTCAG
PML-Exon5/6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAAAGGAGGTGATGTGATGG
PML-Exon5/6-R：AACAGCTATGACCATGGGTGAGACTGCCTTGGAG
PML-Exon7-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATAGATAAGGCACAGCAAGA
PML-Exon7-R：AACAGCTATGACCATGCCCTGGGACCTGAAATGG
PML-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAATCCCTGACGCTTGGTT
PML-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGGGCTCTGCCTGCACTTCT
PML-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCTATCCCACCACAACC
PML-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGCGGCCTTGGAGTAGATGC
PML-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCCTCTTTGGCACATTA
PML-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGAGAAGGAGACCCTGGAGC；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
4.一种检测PML基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR扩增反应液、测序体系试剂，其中，检测体系PCR扩增反应液包括至少一对扩增引物，所述测序体系试剂包括一对测序引物，其特征在于，所述至少一对扩增引物选自PML-Exon1-F/PML-Exon1-R、PML-Exon2-F/PML-Exon2-R、PML-Exon3-F/PML-Exon3-R、PML-Exon4-F/PML-Exon4-R、PML-Exon5/6-F/PML-Exon5/6-R、PML-Exon7-F/PML-Exon7-R、PML-Exon8-F/PML-Exon8-R、PML-Exon9-F/PML-Exon9-R、PML-Exon10-F/PML-Exon10-R；所述一对测序引物选自M13F和M13R，其碱基序列为：
PML-Exon1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCGCTTTACCGTAAGTCAG
PML-Exon1-R：AACAGCTATGACCATGCAAATCCTCCGTTAGACCC
PML-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGCTTTTGGGACTTCTC
PML-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGCCTCTACCTGGTACTTGGA
PML-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGGATAGTGCCTTTGGC
PML-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGCTGTGCCCTGGAACCTAA
PML-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCACTCTAATGCCACCTC
PML-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGGACCTCAAACCCATCTCAG
PML-Exon5/6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAAAGGAGGTGATGTGATGG
PML-Exon5/6-R：AACAGCTATGACCATGGGTGAGACTGCCTTGGAG
PML-Exon7-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATAGATAAGGCACAGCAAGA
PML-Exon7-R：AACAGCTATGACCATGCCCTGGGACCTGAAATGG
PML-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAATCCCTGACGCTTGGTT
PML-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGGGCTCTGCCTGCACTTCT
PML-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCTATCCCACCACAACC
PML-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGCGGCCTTGGAGTAGATGC
PML-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCCTCTTTGGCACATTA
PML-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGAGAAGGAGACCCTGGAGC；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测体系PCR扩增反应液还包括2×PCR Buffer、dNTPs和KOD FX DNA Polymerase。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述测序体系试剂还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述测序纯化液包括核酸外切酶I和牛小肠碱性磷酸酶。
8.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括空白对照品。
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