CN109337970A - 检测nat2基因突变分型的引物、试剂盒和方法 - Google Patents

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吴鹏飞
王淑
王淑一
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Abstract

本发明公开了一种检测与异烟肼等药物代谢有关的NAT2(N‑acetyltransferase 2,NAT2)基因突变分型的引物和方法，其包括扩增检测核苷酸序列的2对引物；采用PCR扩增技术和Sanger测序技术。本发明可快速地将NAT2基因突变分型检测出来，并可判断其代谢表型。利用本发明完成的检测结果准确，在抗结核治疗时，可结合患者NAT2基因型的不同或代谢表型实施个体化治疗方案。

Description

检测NAT2基因突变分型的引物、试剂盒和方法
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测与异烟肼等药物代谢有关的NAT2基因分型的引物和方法。
背景技术
结核病(TB)是由结核分枝杆菌引起的以肺部病变为主的慢性传染性疾病。近年来其发病率在全球范围内都有升高的趋势。在WHO推荐的标准抗结核化疗方案中，异烟肼是不可替代的一线抗结核药，其常见的不良反应有肝损伤、胃肠道反应和皮疹等。抗结核药物诱导的肝损伤(anti-tuberculosisdrug-induced hepatotoxicity,ATDH)在结核病标准治疗中发生率约为2％～28％，是结核患者停止化疗的最常见原因之一。ATDH如果没有及时发现并停止用药，将导致患者肝衰竭甚至死亡。
异烟肼为胺类化合物，在体内通过N-乙酰基转移酶2(N-acetyltransferase 2,NAT2)代谢，最终产生无毒的乙酰肼及二乙酰肼。N-乙酰基转移酶2由NAT2基因编码，是药物二相代谢酶，催化乙酰基团从乙酰CoA转移到其作用底物芳香胺及杂环胺类物质上，在人体对芳香胺类及杂环类物质的活化和(或)灭活以及某些药物的代谢过程中起着重要的作用。
NAT2基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)可引起相应代谢酶含量或酶活性的改变，从而影响个体的药物代谢能力。NAT2基因多态性由其编码区的点突变所造成，根据野生型与突变型的组合形成不同的基因型：野生纯合的快乙酰型、野生突变杂合的中间型、突变纯合的慢乙酰型。研究发现快代谢型患者中极少出现药物性肝损伤，慢代谢型患者较易出现药物性肝损伤。
因此，在抗结核治疗时，结合患者NAT2基因型的不同或代谢表型实施个体化治疗方案：对慢代谢型患者，在治疗初期减少异烟肼的用量，可减少药物不良反应，提高患者依从性；对快代谢型患者，则适当增加异烟肼剂量，可提高早期疗效。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测NAT2基因突变分型的引物，采用PCR技术，可用于快速检测结核病患者NAT2基因分型并判断患者的代谢表型。
检测NAT2基因突变分型的引物，其特征在于所使用的扩增引物和测序引物均为：
NAT2-1-F：CGAGGAAATCAAATGCTAAAG
NAT2-1-R：GCTCTCTCCTGATTTGGTCC
NAT2-2-F：AGGATCAGCCTCAGGTGC
NAT2-2-R：TTTTATGGATGAAAGTATTTGATG。
本发明还提供了检测NAT2基因突变分型的试剂盒，包括
①血液样本DNA抽提试剂；
②检测体系PCR扩增反应试剂；包括扩增引物
③测序体系试剂；包括测序引物；
④阳性对照品和阴性对照品。
其中，扩增引物和测序引物碱基序列均为：
NAT2-1-F：CGAGGAAATCAAATGCTAAAG
NAT2-1-R：GCTCTCTCCTGATTTGGTCC
NAT2-2-F：AGGATCAGCCTCAGGTGC
NAT2-2-R：TTTTATGGATGAAAGTATTTGATG。
本发明最后提供了检测NAT2基因突变分型的方法，包括以下步骤：
(1)抽提外周血中的基因组DNA；
(2)以步骤1中提取的DNA为模板进行PCR扩增；
(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；
(4)将测序结果与标准序列进行比对，确定NAT2的基因分型及代谢表型。
其中步骤2中的PCR扩增引物和步骤3中的测序引物的碱基序列均为：
NAT2-1-F CGAGGAAATCAAATGCTAAAG
NAT2-1-R GCTCTCTCCTGATTTGGTCC
NAT2-2-F AGGATCAGCCTCAGGTGC
NAT2-2-R TTTTATGGATGAAAGTATTTGATG
有益效果：本发明设计了扩增NAT2基因核苷酸序列的引物。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。NAT2基因分型很多，涉及的基因多态性位点也较多，本发明所述引物可将目前有报道的突变位点全部检测出来。相比较荧光定量PCR法及限制性酶切片段长度多态性(RFLP)法降低了检测的成本和难度。本发明的2对引物涵盖了NAT2基因有报道的全部分型，使得后续测序时的上下游引物均能测出目的片段，一定程度上保证了测序的准确性。
附图说明
图1为2对扩增引物的电泳图，M为Marker DL 2000，1-11为送检的临床样本，电泳结果显示引物扩增有效，且电泳条带单一。(a)：NAT2-1电泳结果；(b)：NAT2-2电泳结果。
图2为NAT2基因部分阳性测序截图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
一种检测NAT2基因突变分型的引物，其碱基序列为：
NAT2-1-F CGAGGAAATCAAATGCTAAAG
NAT2-1-R GCTCTCTCCTGATTTGGTCC
NAT2-2-F AGGATCAGCCTCAGGTGC
NAT2-2-R TTTTATGGATGAAAGTATTTGATG
一种检测NAT2基因全外显子的试剂盒，包括
(1)基因组DNA抽提试剂；
(2)检测体系PCR反应液；
(3)测序体系试剂；
其中，基因组DNA提取所用试剂盒由北京天根生化科技有限公司提供；PCR扩增反应液所用KOD FOX由TOYOBO公司提供；引物由通用生物公司合成。
检测体系PCR扩增反应液包括：
PCR反应程序如下：
实施例2
骨髓/血液/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的基因组DNA：1)抽取300μL血液加入900μL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5min，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，瞬时离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离心去除管盖内的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12，000rpm离心30s，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12，000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各XμL，每人份19μL分装：
X＝19μL反应液×(n份标本+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：加入检测体系PCR反应液中1μL DNA；空白对照加1μL生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：
PCR扩增体系试剂配制方法如下：
其中，PCR扩增引物序列为：
NAT2-1-F CGAGGAAATCAAATGCTAAAG
NAT2-1-R GCTCTCTCCTGATTTGGTCC
NAT2-2-F AGGATCAGCCTCAGGTGC
NAT2-2-R TTTTATGGATGAAAGTATTTGATG
(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，35min，凝胶成像系统观察。
如图1所示，即为11例血液样本以相应的引物扩增后所得产物的电泳图谱。通过电泳图的分析表明本发明所述扩增有效，且条带单一。
(6)Sanger测序：
取9PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
其中，测序引物序列同PCR扩增引物序列。
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μL 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μL无水乙醇，漩涡混匀；13000rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μL 70％乙醇，漩涡混匀；13000rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl Hi-Di后进行变性试验。
变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断：分别将测序结果与NAT2基因参考序列(Genbank：NG_009567.1)进行比对，根据突变情况对结果进行基因分型和代谢表型判断。基因分型和代谢表型判断参考NCBI：http://nat.mbg.duth.gr/Human％20NAT2％20alleles_2013.htm。
实施例3
取11例临床样本，按实施例1和例2的试剂和方法提取基因组DNA、配制试剂、扩增和测序。样本加入检测体系PCR反应液中1μL，阴性对照为ddH2O。电泳结果如图1所示，表明本发明所述引物对血液样本能有效扩增，且条带单一。
根据测序结果将样本进行基因分型及代谢表型判断，标本1、3、4、5、10和11的基因型均为NAT2*12A，判定为快代谢型；标本2和标本7为NAT2*6C/*12B，标本8为NAT2*7C/*12B，均为中间代谢型；标本6和标本9有两个慢代谢型突变位点，判定为慢代谢型，结果如下表所示
本发明可快速地将NAT2基因突变分型检测出来，并可判断其代谢表型。利用本发明完成的检测结果准确，在抗结核治疗时，可结合患者NAT2基因型的不同或代谢表型实施个体化治疗方案。
序列表
<110> 杭州艾迪康医学检验中心有限公司
<120> 检测NAT2基因突变分型的引物、试剂盒和方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgaggaaatc aaatgctaaa g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctctctcct gatttggtcc 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggatcagcc tcaggtgc 18
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttttatggat gaaagtattt gatg 24

Claims (3)

1.检测NAT2基因突变分型的引物，其特征在于所使用的扩增引物和测序引物均为：
NAT2-1-F：CGAGGAAATCAAATGCTAAAG
NAT2-1-R：GCTCTCTCCTGATTTGGTCC
NAT2-2-F：AGGATCAGCCTCAGGTGC
NAT2-2-R：TTTTATGGATGAAAGTATTTGATG。
2.检测NAT2基因突变分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括
①血液样本DNA抽提试剂；
②检测体系PCR扩增反应试剂；包括扩增引物
③测序体系试剂；包括测序引物；
④阳性对照品和阴性对照品。
其中，扩增引物和测序引物碱基序列均为：
NAT2-1-F：CGAGGAAATCAAATGCTAAAG
NAT2-1-R：GCTCTCTCCTGATTTGGTCC
NAT2-2-F：AGGATCAGCCTCAGGTGC
NAT2-2-R：TTTTATGGATGAAAGTATTTGATG。
3.检测NAT2基因突变分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)抽提外周血中的基因组DNA；
(2)以步骤1中提取的DNA为模板进行PCR扩增；其中扩增引物序列为：
NAT2-1-F：CGAGGAAATCAAATGCTAAAG
NAT2-1-R：GCTCTCTCCTGATTTGGTCC
NAT2-2-F：AGGATCAGCCTCAGGTGC
NAT2-2-R：TTTTATGGATGAAAGTATTTGATG；
(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；其中测序引物序列为：
NAT2-1-F：CGAGGAAATCAAATGCTAAAG
NAT2-1-R：GCTCTCTCCTGATTTGGTCC
NAT2-2-F：AGGATCAGCCTCAGGTGC
NAT2-2-R：TTTTATGGATGAAAGTATTTGATG；
(4)将测序结果与标准序列进行比对，确定NAT2的基因分型及代谢表型。
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