JP4557347B2 - 特定の塩基配列を有する標的核酸の検出またはその核酸量の測定方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の塩基配列を有する標的核酸を検出しまたは該標的核酸量を測定する方法に関し、特に、特定の塩基配列を有する標的核酸を高感度および高精度に測定できる改良方法を提案するものである。
【0002】
【従来の技術】
特定の塩基配列を有する標的核酸を検出しまたその核酸量を測定するために、従来これまでに、サザンブロット(Southern blotting)、ノーザンブロット法(Northern blotting)およびリボヌクレアーゼプロテクションアッセイ(Rib−onuclease protection assay)などの種々の方法が提案され、用いられてきた。しかし、これら方法は、感度の低さ、操作の煩雑さおよび定量の正確さなどの点で不十分であるという問題があった。そこで、これら問題点を解決するため、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR、polymerase chain reaction)法、NA−SBA(Nucleic Acid Sequence−Based Amplification)法、TMA法などの様々な核酸増幅法が開発されている。特に、PCR法などは、最近、種々の変形法が編み出され、急速な進歩を遂げている。
また一方、近年、標的核酸の検出の容易化を図るべく検出機器の開発もいろいろと進み、核酸の増輻系を用いずに標的核酸を検出するマイクロアレーやDNAチップと呼ばれる技術などが開発されてきた。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これら標的核酸量の測定系を用いても、標的核酸量の測定の精密度は、なお低い状態にある。この問題を解決するために、試薬性能の向上や実験工程の改良など、種々の対策が進められてきたが、低い精密度の原因は末だに解明されておらず、低い精密度に対する根本的な解決策は、今のところ見出されていないのが現状である。
したがって、従来、特定の塩基配列を有する標的核酸を高感度および高精度に測定できる方法の開発が求められていた。
【0004】
本発明は、上述した従来の事情を考慮してなされたものであって、その課題とするところは、特定の塩基配列を有する標的核酸の量を、直接または増幅系を用いて測定するにあたって、より高感度、より高精度およびより広領域の測定を可能にする有用な改良方法を提供することにある。
また、本発明の他の課題は、特定の塩基配列を有する標的核酸の高感度、高精度および広領域の測定に適している、該標的核酸およびそれに対する内部標準物質の溶解液、希釈液、反応液もしくは保存液を提供することにある。
本発明のその他の課題は、特許請求の範囲を含む明細書の記載を参照することにより、理解される。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の技術的課題を解決するべく鋭意研究した結果、特定の塩基配列を有する標的核酸およびこの標的核酸に対する内部標準物質(competitor核酸等)の溶解液、希釈液、反応液もしくは保存液に、その特定の塩基配列を有する標的核酸およひ標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない核酸(例えばDNA重合体、RNA重合体など)を添加し、そしてその共存系の下で、公知の核酸増幅法例えばPCR法、NASBA法などを利用して特定の塩基配列を有する標的核酸量の測定を行なうと、従来よりも著しく、より高感度、より高精度およびより広領域の測定が可能になることを見い出し、本発明を完成した。
【0006】
したがって、本発明は、より明確には、特定の塩基配列を有する標的核酸を検出しまたは該標的核酸量を測定する方法において、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の溶解液、希釈液、反応液もしくは保存液に、前記特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない核酸を添加することを特徴とする、特定の塩基配列を有する標的核酸の検出またはその核酸量の測定方法に関する。
また、本発明は、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない核酸が添加されている、前記特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の溶解液、希釈液、反応液もしくは保存液の、特定の塩基配列を有する標的核酸を検出しまたは該標的核酸量を測定するための使用に関する。
さらに、本発明は、特定の塩基配列を有する標的核酸を検出しまたは該標的核酸量を測定するために、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の溶解液、希釈液、反応液もしくは保存液に添加して使用される、前記特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない核酸に関する。
【0007】
【発明の実施の形態】
本発明は、特定の塩基配列を有する標的核酸を検出しまたは該標的核酸量を測定する方法に関する。従って、本発明は、従来これまでに開発された、特定の塩基配列を有する標的核酸の検出方法全般に、例えばサザンブロット法(Southern blotting)、ノーザンブロット法(Northern blotting)およびリボヌクレアーゼプロテクションアッセイ(Ribonuclease protection assay)およびDNAチップアーレーなどに適用されうる。また、本発明は、従来これまでに開発された、特定の塩基配列を有する標的核酸の測定(増幅)方法全般に、例えばポリメラーゼ連鎖反応法(PCR、polymerase chain reaction)、リガーゼ連鎖反応法(LCR)、自己配列複製法(3SR)、逆転写−PCR法(RT−PCR)、Q−ベータレプリカーゼ増幅系、NASBA(Nucleic Acid Sequence−Based Amplification)法、およびTMA法などに適用されうる。
本発明者は、本発明は特に、NASBA法、逆転写−PCR法、を利用して特定の塩基配列を有する標的核酸の測定を行なう場合に有効、有用である点を確認している。NASBA法による場合、フォワード側プライマーおよびリバース側プライマーの他、逆転写酵素、RNase、RNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ、そして核酸の原料となるデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドが用いられる。DNA依存性DNAポリメラーゼを有する逆転写酵素を使用すると、1種類の酵素で逆転写酵素とDNAポリメラーゼとを兼用できる。好ましい濃度範囲はそれぞれ、逆転写酵素は0.01〜100U/μL、RNaseHは0.0001〜0.1U/μL、RNAポリメラーゼは0.1〜100U/μL、そして両ヌクレオチドは0.1〜100mMである。NASBA法は、基本的に、これら成分および標的核酸を含む反応液を41℃前後の最適反応温度にて、通常80分〜100分間インキュベートするだけでよく、大変簡便である。
なお、NASBAによる測定は、日本臨床検査自動化学会会誌Vol.20に掲載されたハイブリダイゼーション装置等を用いて行なうことができる。
【0008】
本発明は、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質(例えばcompetitor核酸)の溶解液、希釈液、反応液もしくは保存液に、前記特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対するcompetitor核酸等の内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない核酸、つまりその検出または増幅反応に直接関わるプライマー、プローブまたはヌクレオチド以外の核酸を添加し、そして、その併存系において、上述の知られた検出・測定法に従い、特定の塩基配列を有する標的核酸の検出・測定を行なうものである。
本発明において使用される‘特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない核酸’とは、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応を妨げないだけでなく、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応におそらく間接的に関与し(その関与の詳細な機構は現在のところ不明である。)、それらの反応を鋭敏に進行させまたは急速に増大させるような核酸を指し、例えば標的核酸の種類にも依るが、そのような性質を持ったDNA重合体とかRNA重合体などが該当する。特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接関わるプライマー、プローブまたはヌクレオチドなどは、上記の核酸に該当しない。‘直接には関らない核酸’としては、例えば、標的核酸が白血病遺伝子WT1 RNAであって、内部標準物質としてWT1 competitor RNAを用いるとき、本実施例で示すような酵母RNAが該当しかつ好適である。
本発明における‘特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない核酸’は、通常もしくは好ましくは1ng/μL以上の濃度で使用される。
したがって、本発明の主題は、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない核酸を、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の溶解液、希釈液、反応液もしくは保存液に添加し、この併存系で行なうところの特定の塩基配列を有する標的核酸の検出またはその核酸量の測定方法に関する。
また、本発明の他の主題は、特定の塩基配列を有する標的核酸を検出しまたは該標的核酸量を測定するために、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない核酸が添加されている、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の溶解液、希釈液、反応液もしくは保存液を使用することに関する。
さらに、本発明は、特定の塩基配列を有する標的核酸を検出しまたは該標的核酸量を測定するために利用される、上記の特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない核酸を主題とする。
【0009】
【実施例】
以下、本発明の最良の実施形態と思われる実施例を説明することにより、本発明をより明確なものにする。
【0010】
実施例1
competitive NASBA法を用いたWT1 RNAの測定
1)WT1 standard RNA(WT)の合成
NASBA増幅領域を含む白血病遺伝子WT1 cDNAの一部をpSP64(promega)に組み込んだプラスミド(pWT628)を用いて合成WT1 stand−ard RNA(WT)をin vitro合成した。即ち、プラスミドpWT628を制限酵素処理してcDNAの3’末端で切断して linear fragmentとし、その後、MEGAscript kitsを用いてRNAを合成した。プラスミド精製・RNA合成は適当な回数(2〜3回)繰返され、得られたRNAは変性ゲル電気泳動で転写産物長を確認し、これとともに合成RNAのコピー数は260nmの吸光度から算出した。
2)WT1 competitor RNA(QA)の合成
増幅領域内の捕捉プローブ部分において結合配列だけがstandard RNAと異なるRNA合成用プラスミド(pWT628QA)を作製した。 competitor RNAの合成は、standard RNAの合成方法に従って行なった。合成RNAのコピー数は260nmの吸光度から算出した。
3)合成RNAの希釈
合成RNAは、102コピー/5μLまで0.1μg/μLの酵母RNA溶液(実施例)またはnuclease free water (比較例)によって希釈した。
4)competitiveNASBA
40μLのNASBA反応系に102コピーのstandard RNAと10 4 コピーのcompetitor RNAを加え増幅反応をNASBAで行なった。
増幅産物の測定を、DNAプロブ自動測定システムにてWT1/QA各捕捉用マイクロプレート並びに検出プレートを用いて行ない、各シグナルの対数比(log(WT/QA))を取り、回帰式から発現量(コピー/μg)を算出した。
5)結果
試験の結果を以下の表1に示す。同表に示された測定精度の値よりわかるように、酵母RNAを添加したWT1合成RNAの希釈液をNASBA増幅に用いた場合は、酵母RNAを添加していないWT1合成RNAの希釈液をNASBA増幅に用いた場合と比較して、格段により高い精度でWT1 RNAの測定を行ないうる。
【0011】
実施例2
competitiveNASBA法を用いたMDRI RNAの測定
1)MDR1 standard RNA(MDR)の合成
NASBA増幅領域を含むMDR1 cDNAの一部をpSP65(promega)に組み込んだプラスミド(pMDR94)を用いて合成MDR1 standard RNA(MDR)をin vitro合成した。即ち、プラスミドpMDR94を制限酵素処理してcDNAの3 末端で切断してlinearfragmentとし、その後、ME−GA script kitsを用いてRNAを合成した。プラスミド精製・RNA合成は適当な回数(2〜3回)繰返され、得られたRNAは変性ゲル電気泳動で転写産物長を確認し、これとともに合成RNAのコピー数は260nmの吸光度から算出した。
2)MDR1 competitor RNA(QA)の合成
増幅領域内の捕捉プローブ部分において結合配列だけがstandard RNAと異なるRNA合成用プラスミド(pMDR94QA)を作製した。competitor RNAの合成は、standard RNAの合成方法に従って行なった。合成RNAのコピー数は260nmの吸光度から算出した。
3)合成RNAの希釈
合成RNAは、102コピー/5μLまで0.1μg/μLの酵母RNA溶液(実施例)またはnuclease free water(比較例)によって希釈した。
4)competitiveNASBA
40μLのNASBA反応系に、102コピーまたは104コピーのstandard RNAと102コピーまたは104コピーのcompetitor RNAを加え、増幅反応をNASBAで行なった。増幅産物の測定を、DNA自動分析装置MarkI(東洋紡株式会社製)にてMDR1/QA各捕捉用マイクロプレート並びに検出プレートを用いて行ない、各シグナルの対数比(log(MDR/QA))を取り、回帰式から発現量(コピー/μg)を算出した。
5)結果
試験の結果を以下の表2に示す。同表に示された測定精度の値よりわかるように、酵母RNAを添加したMDR1合成RNAの希釈液をNASBA増幅に用いた場合は、酵母RNAを添加していないMDR1合成RNAの希釈液をNASBA増幅に用いた場合と比較して、格段により高い精度でMDR1 RNAの測定を行ないうる。
【0012】
【0013】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の方法によれば、特定の塩基配列を有する標的核酸の量を、直接または増幅系を用いて測定するにあたって、より高感度、より高精度およびより広領域の測定を可能になるという効果が得られる。
また、本発明によれば、特定の塩基配列を有する標的核酸の高感度、高精度および広領域の測定に適している、該標的核酸およびそれに対する内部標準物質の液体検体が提供される。
Claims (1)
- 特定の塩基配列を有する標的核酸を検出しまたは該標的核酸量を測定する方法において、特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の溶解液、希釈液、反応液もしくは保存液に、前記特定の塩基配列を有する標的核酸および該標的核酸に対する内部標準物質の検出または増幅反応に直接には関らない酵母RNAを用い、NASBA法によりRNA増幅をおこなうようにしたことを特徴とする、特定の塩基配列を有する標的核酸の検出またはその核酸量の測定方法。
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JPH04502552A (ja) * | 1988-08-31 | 1992-05-14 | アプロジェネックス,インク | ワン―ステップのインシチュハイブリッド形成分析法 |
WO1999061661A1 (fr) * | 1998-05-27 | 1999-12-02 | Bio Merieux | Procede d'amplification d'au moins une sequence nucleotidique particuliere et amorces de mise en oeuvre |
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2000
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