KR970007025B1 - 잡종화에 의한 대립연쇄반복 dna의 동정방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음

Description

잡종화에 의한 대립연쇄반복 DNA의 동정방법
본 발명은 잡종화(Hybridization)에 의한 대립연쇄반복 DNA의 동정방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 대립연쇄반복의 크기별로 하나씩 모은 표준 대립연쇄반복 DNA와 표지된 검체 대립연쇄반복 DNA를 잡종화시킨 다음, 표지된 물질이 나타내는 성질을 이용하여 검체 대립연쇄반복 DNA와 동종인 표준대립연쇄반복 DNA를 색출하는 대립연쇄반복 DNA와 동종인 표준대립연쇄반복 DNA를 색출하는 대립연쇄반복 DNA의 동정방법에 관한 것이다.
인간을 포함한 대부분 유핵생물의 게놈(genome)은 필수적인 유전정보를 기록하고 있는 염기배열(DNA sequence) 및 아무런 의미를 가지지 않는 비정보성 염기배열로 구성되어 있다. 비정보성 염기배열 가운데는 적게는 몇 개부터 많게는 수십개의 염기배열이 하나의 반복 단위가 되어 되풀이 되어 나타나는 연쇄반복(VNTR : variable number of tandem repeat)부분이 있는데, 특히 사람의 게놈에는 이러한 연쇄반복을 나타내는 지점(locus)이 많이 있다.
한편, 한 연쇄반복좌(VNTR locus)에 나타나는 서로 다른 길이, 즉 반복 횟수가 다른 연쇄반복을 대립연쇄반복(allele)이라 하는데, 연쇄반복에 있어서 반복단위의 염기배열, 길이 및 반복 횟수 등이 아무런 유전적 의미가 없기 때문에, 서로 다른 연쇄 반복의 보유자가 받는 도태압(selection pressure)은 영에 가까우리라고 추정되며, 한종 적게는 한 집단내에 많은 수으 대립연쇄반복이 존재한다. 따라서, 개개인은 연쇄반복좌에서 이형접합체(heterozygote)일 확률이 높으며, 또한 혈연이 아닌 다른 사람의 대립연쇄반복의 조합도 다를 확률이 높다. 그러나, 혈연 간에는 대립연쇄반복 역시 부모로부터 오는 것이기 때문에, 멘델(Mendel)의 법칙에 의한 대립연쇄반복의 유전과 공유현상을 볼 수 있다.
대립연쇄반복은 그 폭넓은 다형성으로 인하여 응용 유전학에 널리 이용되고 있다. 예를 들면, 대립연쇄반복을 추적하므로써, 가족의 혈연 관계를 확립할 수 있으며, 혈액으로부터 특징 개인을 찾아낼 수도 있고, 가계의 유전병을 연구할 수 있다.
DNA 지문뜨기(DNA finger printing)는 마치 지문 대조와 같이 사건 현장에 남겨진 생체 파편에서 얻은 DNA와 용의자 DNA간의 대립연쇄반복의 조합이 동일한가를 검사하는 것이다. 구미에서는 1985년 이래 수 만건의 사건이 이러한 분석을 바탕으로 하여 해결된 바 있으며, 국내에도 1992년 대검찰청에 유전자감식실이 설립되어 이러한 분석을 수행하고 있다.
연쇄반복에 의한 절편다형성은 인간의 게놈에만 국한되어 나타나는 것이 아니라, 일반적으로 유핵생물이라고 일컬어지고 있는, 세균을 제외한 모든 생물에서 이러한 현상이 발견되기 때문에, 연쇄반복은 농·축산업 분야에도 널리 이용되고 있다. 이를 태면, 종래에는 불가능하거나 복잡하고 어려웠던 각종 가축이나 야생동물의 가계 추적 또는 개체판별이 연쇄반복을 이용하여 용이해졌으며, 앞으로는 농작물의 개체 판별도 가능하여 곡물, 수목의 육종에도 크게 기여할 것으로 믿어지고 있다.
연쇄반복은 분자생물학의 여러 가지 기술의 발전에 의해 쉽게 측정될 수 있는데, 간단하게도 DNA를 제한효서(restriction enzyme)로 절단하여 연쇄반복이 있는 부분의 절편 길이를 아가로스 젤(agarose gel)상에서 전기영동(electrophoresis)함으로써 측정할 수 있다. 이러한 경우에는 연쇄반복의 반복 횟수가 제한효소에 의한 절편 길이의 변화로 나타나기 때문에, 제한절편다형성(RFLP : restriction fragment length polymorphism)이라고 부른다. 제한절편다형성보다 감도가 높고 실험 방법이 간편하여 근래 각광을 받고 있는 것은 증폭절편다형성(AMP-FLP : amplified fragment length polymorphism)이다. 이것은 특정 염기배열의 양쪽과 잡종화할 수 있도록 올리고 뉴클레오티드를 합성한 다음, DNA중합효소 및 전기 합성 올리고뉴클레오티드를 이용하여 특정 염기배열을 되풀이 복제시키는 중합효소 연쇄반응(PCR : polymerase chain reaction)을 이용하는 것이다. 복제로 증폭된 절편은 제한절편다형성의 경우와마찬가지로 전기영동에 의해 크기를 측정하여 대립연쇄반복을 동정(identification)한다.
증폭절편다형성에 의한 대립연쇄반복의 동정은 제한절편다형성의 경우보다 실험이 간단하고 대립연쇄반복간의 길이 차이가 분명히 나타나 대립연쇄반복법의 구분이 쉽지만, 흔히 대상 연쇄방복이 아닌 DNA가 증폭되며 적정 증폭 조건을 확립하는데 많은 시간과 노력이 필요한다는 단점을 가지고 있었다. 또한, 절편 길이의 다형성을 측정하기 위하여 전기영동의 과정을 거쳐야 하기 때문에, 시간이 많이 걸리고 자동화가 어렵다는 단점을 지니고 있었다.
이에, 본 발명자는 대립연쇄반복을 신속하면서도 정확히 간단하게 판별할 수 있는 방법을 찾아내고자 예의 연구노력한 결과, 놀라웁게도 대립연쇄반복들이 반복 횟수의 차이가 있을 때 상호 잡종화가 거의 일어나지 않는다는 현상을 발견하였으며, 이러한 발견을 기초로 다수의 표본으로부터 선택한 각종 크기의 대립연쇄반복 DNA를 모은 표준대립연쇄반복 DNA와 표지된 검체 대립연쇄반복 DNA를 잡종화시킴으로써, 각각의 대립연쇄반복의 종류를 간단하면서도 신속, 정확히 판별하는 것이 가능함을 실험적으로 입증하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 잡종화에 의한 대립연쇄반복 DNA의 동정방법을 제공하는 것이다.
제1도는 연쇄반복좌 D8S306의 염기서열을 나타낸다.
제2도는 12종의 표준대립연쇄반복 DNA를 나타낸다.
제3도는 바이오틴으로 표지 증폭된 검체의 대립연쇄반복 DNA를 나타낸다.
제4도는 표준연쇄반복 DNA와 검체 대립연쇄반복 DNA와의 잡종화를 나타내는 그림이다.
제5도는 다공형 잡종화기롤 사용하여 12종의 표준대립연쇄반복 DNA중에서 검체의 대립연쇄반복 DNA와 동종인 1과 9를 판별하는 모식도를 나타내는 그림이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명에 따라 잡종화에 의해 대립연쇄반복을 판별하기 위하여는 다음의 세가지 단계를 거친다.
첫째, 표준대립연쇄반복 DNA를 제조하는 것이다. 연쇄반복좌에 따라 조금씩 다르나 한 연쇄반복좌당 몇 개 내지 수십개의 대립연쇄반복이 인간을 포함한 유핵생물의 게놈에 나타나며, 서로 다른 집단이나 인종은 대개 대립연쇄반복의 종류보다는 각 대립연쇄반복의 출현빈도에 있어서 차이를 보이고 있다. 다수의 표본을 검사하여, 유핵생물 DNA의 어떤 한 연쇄반복좌에 있어서 그 대립연쇄반복의 크기별로 DAN를 하나씩 선정하여 모아 표준대립연쇄반복 DNA로 한다.
둘째, 검체의 대립연쇄반복 DNA를 제조하고 표시하는 것이다. 해당 연쇄반복좌를 포함하는 유핵생물 DNA를 분리한 다음, PCR반응으로 DNA증폭하면서 증폭시에 방사성 동위원소를 삽입하거나, 바이오틴(biotin)이나 딕옥시게닌(Digoxygenin)등 항체에 의해 인지될 수 있는 물질을 삽입시켜 표지된 검체 대립연쇄반복 DNA를 제조한다.
셋째, 표준대립연쇄반복 DNA에 표지된 검체 DNA를 잡종화시키고, 검체 DNA의 표지를 통해 동종인 표준대립연쇄반복 DNA를 찾아내는 것이다. 상기에서 제조된 표준대립연쇄반복 DNA와 표지 검체 DNA를 잡종화시킨 다음, 방사성 조사 또는 항체에 결합된 2차 물질에 의한 발광반응을 통해, 검체의 대립연쇄반복 DNA와 동종인 표준대립연쇄반복 DNA를 색출한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 잡종화에 의한 대립연쇄반복 DNA의 동정방법은, 대량으로 제조될 수 있는 표준대립연쇄반복 DNA를 막에다 고착시키고, 방사성 동위원소 또는 발광유도물질이 표지된 검체 DNA를 부착시키고 발광물질의 위치를 읽음으로써 대립연쇄반복의 타입을 판별하기 때문에, 전기영동에 의한 동정방법에 비해 판별과정을 크게 간소화시킬 수 있다. 예를 들면, 검체의 DNA가 종래의 증폭 절편다형성 또는 제한절편다형성에 의한 전기영동에서 하나의 띠를 나타낸다면, 본 발명의 잡종화에 의한 대립연쇄반복 DNA의 동정방법에서는 단지 하나의 표준대립연쇄반복 DNA와 잡종화할 것이고, 두개의 띠를 나타낼 경우에는 두 개의 표준 DNA와 잡종화할 것이다.
아울러, 이 방법에 의하면, PCR 반응을 이용하여 선택적으로 검체의 DNA를 증폭한 다음 표준연쇄반복 DNA와 잡종화시키기 때문에, 두차계의 선별과정을 겪게되는 바, 대립연쇄반복의 동정 신뢰도를 향상시킬 수 있다. 또한, 상술한 본 발명의 동정방법에 있어서, 잡종화 과정은 실상 되풀이되는 반응물의 첨가와 세척의 과정이기 때문에, 자동화가 가능하여 머지 않은 장래에 연쇄반복의 측정은 완전히 자동화될 것이며, 이에 따라 본 발명에 의한 동정방법은 종래의 방법들을 대체할 수 있는 더욱 더 경제적이고도 간편한 방법으로 정착될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 특히 본 발명의 취지에 따라 연쇄반복좌는 현재 법의학적인 동정검사와 혈연의 판벌에 가장 널리 이용되고 있는 STR(short tandem repeat)이라 불리우는 것 중의 하나인 D8S306(하기 실시예에서 사용)에 한하지 않고, 반복단위가 2개 염기로 된 연쇄반복좌(예를 들면, M9D5)에서부터 반복단위가 70개 염기로 된 연쇄반복좌(예를 들면, D17S5)에 이르기까지 여러가지가 이용될 수 있다.
실시예 1 : 표준대립연쇄반복 DNA의 제조
절편다형성을 전기영동으로 조사해 보면, 한 연쇄반복좌에 대해 하나 또는 둘이상의 DNA절편이 나타나는 것을 알 수 있는 바, 이것은 상동염색체 상의 연쇄반복좌에 존재하는 대립연쇄반복의 길이가 같을 수도 있고 다를 수도 있음을 의미한다.
따라서, 어떤 한 연쇄반복좌의 표준대립연쇄반복 DNA를 제조하기 위하여, 수십인 내지 수백인의 DNA를 제한효소로 절단하고 전기영동으로 조사해 보면, 집단내에 나타나는 대부분의 대립연쇄반복을 나타내는 띠들을 얻을 수 있는데, 이것들 중에서 각 크기를 대표하는 대립연쇄반복 DNA를 하나씩 선정하여 플라스키드(plasmid)에 클로닝하였다. 이것이 바로 해당 연쇄반복좌에서의 표준대립연쇄반복 DNA가 되며, 이 표준대립연쇄반복 DNA를 포함하는 플라스미드 DNA 혹은 플라스미드 상에서 증폭된 DNA가 잡종화의 표준으로 사용되었다.
제1도는 본 실시예에서 사용된 반복단위가 aaag인 연쇄반복좌 D8S306의 염기서열을 나타낸다.
제2도는 연쇄반복좌 D8S306에서 나타나는 대립연쇄반복 DNA의 각 크기를 대표하는 12종의 표준대립연쇄반복 DNA를 나타낸다.
실시예 2 : 검체 대립연쇄반복 DNA의 제조
검체 대립연쇄반복 DNA는 사람의 DNA를 추출 분리한 다음, PCR 반응으로 DNA 증폭하여 제조하였다. 이때, 잡종화에 의한 대립연쇄반복 DNA의 판별을 단순화시키기 위하여, 다음과 같은 방법으로 검체 대립연쇄반복 DNA를 표지하였다 : DNA 증폭시에 디옥시뉴클레오타이드와 함께 바이오틴(biotin)이나 딕옥시게닌(Digoxygenin, Boehringer Mannheim, Germany)과 같은 항체에 의해 인지될 수 있는 물질이 결합된 dUTP(deoxyuridine triphosphate)를 첨가하였다. 그 결과, 우라실이 주형 DNA의 아데닌(adenine) 염기에 대하여 상보적인 타이민(thymine) 염기를 일부 대치하여, 새로 생기는 DNA에 포함되었다. 따라서, 증폭된 검체의 대립연쇄반복 DNA는 DNA상에 바이오틴이나 딕옥시게닌을 가지게 되었다.
제3도는 증폭된 검체의 대립연쇄반복 DNA에 바이오틴이 삽입된 검체 DNA를 타나내다. 제3도에서 보듯이, 검체의 대립연쇄반복 DNA는 제2도의 12종 표준대립연쇄반복 DNA 중에서 1번과 9번 대립연쇄반복 DNA에 해당함을 알 수 있었다.
실시예 3 : 표준대립연쇄반복 DNA와 검체 대립연쇄반복 DNA의 잡종화 및 검출
DNA잡종화를 위하여, 우선 실시예 1에서 제조한 표준대립연쇄반복 DNA를 다공형의 잡종화기(雜種化器)에 설치된 나일론(nylon)이나 나이트로셀룰로스(nitrocellulose) 막에 한 구멍당 한 종류씩 고착시켰다. 그런 다음, 고착되지 않은 DNA를 세척하고, 실시예 2에서 제조한 증폭된 검체의 대립연쇄반복 DNA를 가하여 잡종화시켰다. 접종화 후, 잡종화되지 못한 DNA를 세척해 버리고, 마지막으로 바이오틴(또는 딕오시게닌)을 인지하는 항체(이 항체에는 알카린포스파테이즈(alkaline phosphatase)가 결합되어 있음)를 공급하였다. 이때, 항체는 바이오틴(또는 딕오시게닌)만을 인지하여 부착되며, 이 항체에 결합된 알카린포스테이즈도 간접적으로 바이오틴(또는 딕옥시게닌)에 부착된다. 이어, 부착되지 않은 항체를 세척해내고, 반응물질 AMPPD(disodium3-(4-methoxyspiro{1,2-dioxetane-3,2',-tricyclo[3.3.1.13,7]decan-4-yl)phenyl phosphate)를 첨가하면, 알카린포스파테이즈 이를 분해하면서 발광시키므로, 검체 DNA가 잡종된 표준대립연계반복 DNA가 ELISA 발색으로 감지되었다. 이때, 감지되는 알카린포스파테이즈의 위치는 증폭된 검체의 DNA가 잡종화된 표준대립연쇄 반복 DNA의 위치가 되기 때문에, 즉각적으로 검체의 대립연쇄반복의 종류를 동정할 수 있게 되었다.
제4도는 검체의 대립연쇄반복 DNA가 표준대립연쇄반복 DNA 중에서 정확히 같은 길이, 즉 같은 수의 반복을 갖는 DNA(1번과 9번 대립연쇄반복 DNA)와만 잡종화를 이루게 됨을 나타낸다. 제5도는 실제로 다공성의 잡종화기를 이용하여 검체의 대립연쇄반복 DNA와 표준대립연쇄반복 DNA의 잡종화를 수행하고, 그를 판별한 경우의 모식도를 나타낸다.
이상에시 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명의 잡종화에 의한 대립연쇄반복 DNA의 동정방법은 대량으로 마련될 수 있는 표준대립연쇄반복 DNA를 막에다 고착시키고, 방사성 동위원소 또는 발광유도물질이 표시된 검체 DNA를 부착시킴으로써, 검체의 연쇄반복 절편다형성을 신속, 정확하면서도 간단히 판별하는 방법이다. 따라서, 본 발명의 방법은 법의학적인 개인의 동정, 친자 관계의 확인 및 유전병의 연구 등에 널리 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 각종 가축이나 야생동물의 가계 추적 또는 개체판별과 농작물의 개체 판별도 용이하게 화는 획기적인 검정방법이다.

Claims (3)

  1. (i) 유핵생물 DNA의 어떤 한 연쇄반복좌에 있어서 그 대립연쇄반복의 크기별로 대표 DNA를 하나씩 선정하여 모아 표준대립연쇄반복 DNA를 제조하는 단계;(ii) 해당 연쇄반복좌를 포함하는 유핵생물 DNA를 분리한 다음, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)으로 DNA 증폭하면서 증폭시에 방사성 동위원소를 삽입하거나, 항체에 의해 인지될 수 있는 물질을 삽입시켜, 표지된 검체 대립연쇄반복 DNA를 제조하는 단계, 및; (iii) 전기 (i)단계에서 제조된 표준대립연쇄반복 DNAS에, (ii)단계에서 제조된 표지 검체 DNA를 잡종화(hybridization)시킨 다음, 방사성 조사 또는 항체에 결합된 2차 물질에 의한 발광반응을 통해, 검체의 대립연쇄반복 DNA와 동종인 표준대립연쇄반복 DNA를 색출하는 단계를 포함하는 잡종화에 의한 대립연쇄반복 DNA의 동정방법.
  2. 제1항에 있어서, 항체에 의해 인지될 수 있는 물질은 바이오틴(biotin) 또는 딕옥시게닌(Digoxygenin)이고, 항체에 결합된 2차물질은 알카린포스파테이즈(alkalin phosphatase)인 것을 특징으로 하는 잡종화에 의한 대립연쇄반복 DNA의 동정방법.
  3. 제1항에 있어서, 연쇄반복좌는 반복단위가 2개 내지 70개 염기인 것을 특징으로 하는 잡종화에 의한 대립연쇄반복 DNA의 동정방법.
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