AT9142U1 - Verfahren zur genetischen diagnose von hämochromatose sowie sonden zur genetischen diagnose von hämochromatose - Google Patents
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Abstract
Erfindungsgemäß wird bei einem Verfahren zur Diagnose von Hämochromatose eine biologische Probe auf Vorliegen einer C ? G Mutation am Nukleotid 750 des TFR2-Gens untersucht. Erfindungsgemäße Sonden sind fähig mit dem TFR2-Gen im Bereich des Nukleotids 750 bei Vorliegen einer C ? G Mutation zw. mit den entsprechenden Bereichen der transkripierten RNA zu hybridisieren.
Description
2 AT 009 142 U1
Die Erfindung betrifft Verfahren zur genetischen Diagnose von Hämochromatose sowie Sonden zur genetischen Diagnose von Hämochromatose. Hämochromatose ist durch eine Störung im Eisenstoffwechsel des menschlichen Körpers ge-5 kennzeichnet, die zu einer Eisenüberladung führt. Das überschüssige Eisen lagert sich in einer Vielzahl von Organen ab und verursacht irreversible Schäden und daraus resultierende Krankheiten. Da die klinischen Symptome der Hämochromatose oft erst im Alter von 40, 50 oder mehr Jahren auftreten, dann aber schon irreversible Organschäden vorliegen können, gibt es viele Befürworter einer präsymptomatischen Diagnostik. Umso mehr als durch regelmäßigen io Aderlass das übermäßig aufgenommene Eisen einfach entfernt werden kann. Für die genetische Diagnose von Hämochromatose wurde bisher im HFE-Gen auf zwei Mutationen untersucht, nämlich C282Y und H63D. 15 D,ie H63D Mutation ist eine C —> G Mutation im Codon 63 und verwandelt die Aminosäure 63 von Histidin in Asparaginsäure. Da die Häufigkeit dieser Mutation bei der allgemeinen Bevölkerung hoch ist, ist ihre Rolle in Bezug auf die Diagnose von Hämochromatose unsicher.
Ein weitaus besseres Kriterium für die Diagnose von Hämochromatose ist die C282Y Mutation, 20 die in 65 bis 95% der Betroffenen gefunden wird. Sie ist eine G -► A Mutation am Nukleotid 845 des open reading frame des HFE-Gens, die die Aminosäure 282 von Cystein in Tyrosin verwandelt. Der Anteil jener Hämochromatose-Patienten, welche keine C282Y Mutation tragen, variiert und ist z.B. in Italien höher als in nordeuropäischen Ländern. Es ist daher wichtig, neben den bekannten Mutationen jene genetischen weiteren Ursachen im HFE-Gen und in anderen 25 Genen zu finden, welche in Patienten zur Eisenüberladung führen können.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, weitere Möglichkeiten zu finden, genetische Ursachen für Hämochromatose zu diagnostizieren. 30 Die im Folgenden angeführten Nukleotidpositionen entsprechen der Nomenklatur von Feder et al (1996) A novel MHC dass l-like gene is mutated in patients with hereditary haemochromato-sis, Nature Genet. 13, 399-408.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass eine biologische Probe auf Vorliegen einer C->G Muta-35 tion am Nukleotid 750 des open reading frame des TFR2 (Transferrin Receptor 2)-Gens untersucht wird. Diese Mutation bewirkt die Umwandlung der Aminosäure Tyrosin in ein Stopcodon.
Als biologische Probe kann dabei Blut, Gewebs-Biopsie, Mundhöhlenabstrich, Fruchtwasser etc. verwendet werden, wobei die biologische Probe, je nach Auswahl des an sich bekannten 40 Untersuchungsverfahrens, ebenfalls bekannten Vorbehandlungen unterworfen wird.
Um zu unterscheiden, ob die Mutation heterozygot oder homozygot vorliegt, wird vorzugsweise die biologische Probe auch auf Vorliegen von Nukleinsäuren untersucht, deren TFR2-Gen die genannte Mutation nicht aufweist. 45
Die Untersuchung kann in an sich bekannter Weise durch Sequenzierung der aus der biologischen Probe erhaltenen Nukleinsäure durchgeführt werden oder die biologische Probe wird mit mindestens einer Sonde, die fähig ist, mit dem TFR2-Gen im Bereich des Nukleotids 750 bei Vorliegen der C -» G Mutation bzw. mit den entsprechenden Bereichen der transkripierten RNA so zu hybridisieren, in Kontakt gebracht und es wird überprüft, ob entsprechende Hybridisierungsprodukte vorliegen. Um zu unterscheiden, ob die Mutation heterozygot oder homozygot vorliegt, wird vorzugsweise die biologische Probe mit mindestens einer weiteren Sonde in Kontakt gebracht, die fähig ist, mit dem gleichen Bereich zu hybridisieren, wenn keine Mutation vorliegt. 55
Claims (8)
- 3 AT 009 142 U1 Alternativ kann die biologische Probe mittels Antikörper auf Vorliegen eines verkürzten TFR2-Proteins untersucht werden, wobei dieses verkürzte Protein durch Abbruch der Translation durch das Stopcodon entsprechend der C —> G Mutation am Nukleotid 750 des TFR2-Gens gebildet wird. Eine Untersuchung mittels Antikörper auf Vorliegen eines TFR2-Proteins her-5 kömmlicher Länge gibt Aufschluss, ob die Mutation heterozygot oder homozygot vorliegt. Derzeit werden eine Vielzahl von Verfahren zur Analyse von Mutationen verwendet, unter anderem RFLP (restriction fragment length polymorphism), PCR-SSP (PCR with sequence-specific primers), Allelespezifische Oligonukleotidhybridisierung, SSCP (single-strand conformation io polymorphism), DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis), OLA (oligonucleotide litigation assay), Echtzeit-Fluoreszenz-PCR und DNA Sequenzierung. Wenn RNA untersucht wird, kann das z.B. mittels sog. "NASBA" erfolgen oder es kann auch RNA mittels reverser Transkription in cDNA umgeschrieben werden, dann mit PCR ampflifiziert und anschließend charakterisiert werden. All diese bekannten Analyseverfahren können für das erfindungsgemäße Diagnosever-15 fahren herangezogen werden. / Die erfindungsgemäße Sonde zur Diagnose von Hämochromatose anhand einer Mutation im TFR2-Gen ist fähig mit dem TFR2-Gen im Bereich des Nukleotids 750, bei Vorliegen einer C —> G Mutation bzw. mit den entsprechenden Bereichen der transkripierten RNA zu hybridisie-20 ren. Ansprüche: 1. Verfahren zur Diagnose von Hämochromatose, dadurch gekennzeichnet, dass eine biolo gische Probe auf Vorliegen einer C —» G Mutation am Nukleotid 750 des TFR2-Gens untersucht wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe auch auf 30 Vorliegen von Nukleinsäuren untersucht wird, deren TFR2-Gen die genannten Mutationen nicht aufweist.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Untersuchung in an sich bekannter Weise durch Sequenzierung der aus der biologischen Probe erhaltenen 35 Nukleinsäure durchgeführt wird.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe mit mindestens einer Sonde, die fähig ist mit dem TFR2-Gen im Bereich des Nukleotids 750 bei Vorliegen der C —► G Mutation bzw. mit den entsprechenden Bereichen der transkripier- 40 ten RNA zu hybridisieren, in Kontakt gebracht wird und dass überprüft wird, ob entspre chende Hybridisierungsprodukte vorliegen.
- 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe mit mindestens einer weiteren Sonde in Kontakt gebracht wird, die fähig ist, mit dem gleichen 45 Bereich zu hybridisieren, wenn keine Mutation vorliegt.
- 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe mittels Antikörper auf Vorliegen eines verkürzten TFR2-Proteins untersucht wird, wobei dieses verkürzte Protein durch Abbruch der Translation durch das Stopcodon entsprechend der so C -* G Mutation am Nukleotid 750 des TFR2-Gens gebildet wird.
- 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe weiters mittels Antikörper auf Vorliegen eines TFR2-Proteins herkömmlicher Länge untersucht wird. 55 4 AT 009 142 U1
- 8. Sonde zur Diagnose von Hämochromatose, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde fähig ist mit dem TFR2-Gen im Bereich des Nukleotids 750 bei Vorliegen einer C —> G Mutation bzw. mit den entsprechenden Bereichen der transkripierten RNA zu hybridisieren. 5 Keine Zeichnung 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
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