KR20070036139A - 황 함유 화합물을 생산하는 미생물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하나 이상의 유형의 황 함유 화합물을 생산하는 미생물 및 하나 이상의 유형의 황 함유 화합물을 미생물에서 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 L-메티오닌 또는 L-시스테인을 생산하는 미생물 및 L-메티오닌 또는 L-시스테인을 코리네박테리움 글루타미쿰에서 생산하는 방법에 관한 것이다.
코리네박테리움 글루타미쿰, 황 함유 화합물, L-메티오닌, L-시스테인
Description
본 발명은 하나 이상의 황 함유 화합물을 생산하는 미생물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에서 L-메티오닌 또는 L-시스테인을 생산하는 방법에 관한 것이다.
아미노산은 동물 및 인간의 영양에 첨가제로서 다양한 목적으로 사용된다. 예를 들면, 글루타메이트는 전형적으로 향미 강화제로 사용된다. 메티오닌은 식품으로 섭취해야 하는 필수 아미노산이다. 메티오닌, 및 시스테인과 같은 다른 황 함유 아미노산 양쪽 모두는 단백질 생합성에 필수적일 뿐 아니라 글루타티온, S-아데노실메티오닌 및 바이오틴과 같은 다양한 대사산물에 대한 전구체로 작용하고, 또한 다양한 세포 과정에서 메틸기 공여체로 작용한다.
아미노산 소비는 현재 세계적으로 2백만 톤이 넘는 것으로 추정되고 있다. 글루타메이트와 같은 아미노산 또는 주로 L-리신, L-메티오닌 및 L-트레오닌으로 이루어진 사료 첨가제의 연간 수요는 아미노산 당 1백만 톤을 넘는 것으로 추정된다. 약품에 사용되는 아미노산의 연간 수요 만으로도 15,000톤에 달한다(문헌[Kusumoto, I. (2001), J. Nutr., 131, 2552-2555] 참조).
지난 세기 초에는, 아미노산을 주로 화학적으로 또는 추출에 의해 생산하였으나, 현재 예를 들면, 글루타메이트와 같은 특정 아미노산의 생산은 주로 발효 공정에 의해 수행된다. 여기서, 예를 들면, 대장균(Escherichia coli) 및 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 특정 미생물이 아미노산의 발효 생산에 특히 적합한 것으로 밝혀졌다. 발효에 의한 아미노산의 생산은 특히, 천연적으로 사용가능한 L-아미노산만이 독점적으로 생산된다는 이점을 갖는 반면, 화학적 합성으로부터는 대개 라세미 혼합물이 형성되어 종종 시간 및 비용 집약적 가공을 필요로 한다.
특히, 식품, 사료, 화장품 및 제약 산업을 비롯한 많은 공업 분야에서 사용되는 메티오닌, 호모시스테인, S-아데노실메티오닌, 글루타티온, 시스테인, 바이오틴, 티아민, 리포산 등과 같은 소위 황 함유 화합물에 대한 수요가 존재한다. 황 함유 미세 화학물질로도 지칭되는 이러한 물질은 유기산, 단백질생성 및 비단백질생성 아미노산, 비타민 및 보조인자를 포함한다.
앞서 언급한 황 함유 화합물을 생산하는 데 대장균 및 C. 글루타미쿰과 같은 미생물을 사용하려는 시도가 있었다. 황 함유 화합물은 매우 중요하기 때문에, 특히 상기 미생물의 생산 방법을 개선하려는 시도는 예를 들면, 교반 및 산소 공급, 영양 배지의 조성 등과 같은 기술적 발효 수단에 의해 이루어졌다.
이외에도, 전형적인 균주 선택에 의해 해당 비돌연변이 야생형보다 상당히 큰 규모로 상기 황 함유 화합물을 생산하는 상기 미생물의 돌연변이체 균주를 개발하려는 시도가 이루어졌다.
이때, 대장균 또는 C. 글루타미쿰과 같은 미생물을 특히, 메티오닌 및 시스 테인과 같은 황 함유 아미노산의 공업적 대규모 발효 생산에 사용하는 것은 어려운 것으로 밝혀졌다. 그러나, 이러한 아미노산 자체, 그 중에서도, 앞서 언급한 황 함유 화합물 중 몇 가지에 대한 전구체 화합물에 대한 강한 요구가 존재한다.
아마도, 메티오닌 및 시스테인의 생산을 유도하는 생합성 또는 대사 경로가 지금까지 미생물에서 메티오닌 및 시스테인을 공업적 규모로 발효 생산하는 것이 경제적 이익이 없다고 밝혀졌던 이유인 듯하다. 대장균에서 시스테인 및 메티오닌을 생합성하는 것은 일반적으로 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Voet and Voet(1995) Biochemistry, John Wiley and Sons, Inc. USA] 참조). 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 메티오닌 및 시스테인의 생합성은 집중 연구 대상이고, 최근 뒤케르트(Ruekert) 등의 문헌[Ruekert et al. (2003), J. of Biotechnology, 104, 213-228], 뿐만 아니라 리(Lee) 등의 문헌[Lee et al. (2003), Appl. Microbiol. Biotechnol., 62, 459-467]에 기재되었다.
메티오닌 생합성의 핵심 단계는 황을 탄소 스캐폴드(scaffold)로 혼입시키는 것이다. 통상, 황 공급원은 미생물에 의해 섭취되고 활성화되고 감소되어야 하는 술페이트이다. 이 단계는 각 Mol의 메티오닌에 대해 7 Mol ATP 및 8 Mol NADPH를 소비한다(문헌[Neidhardt et al. (1990) Physiology of the bacterial cell: a molecular approach, Sunderland, Massachusetts, USA, Sinauer Associates, Inc.] 참조). 따라서, 메티오닌은 그 생산이 세포로부터 가장 많은 양의 에너지를 필요로 하는 아미노산이다.
따라서, 메티오닌을 생산하는 미생물은 메티오닌, 뿐만 아니라 시스테인의 생산에 대해 엄격한 조절 하에서 이루어지는 대사 경로를 발현시켰다. 이는 세포가 충분한 양의 메티오닌을 생산하는 경우 예를 들면, 피드백 조절 기전에 의해, 메티오닌을 사용하는 대사 경로의 활성은 감소 조절된다는 것을 의미한다.
이는, 지금까지 메티오닌이, 비록 추후 메티오닌의 L형과 D형의 거울상이성체 분리를 필요로 하지만 공업적 규모로 화학적으로 독점 생산될 수 있는 유일한 아미노산이 되게 하였다.
따라서, 코리네박테리움 글루타미쿰의 메티오닌 생산 변이체에 대해서는 거의 공지된 바가 없다. 이러한 돌연변이체는 1975년 동정되었다(문헌[Kase et al. (1975) Agric. Biol. Chem., 39, 153-160] 참조). 그러나, 여기에 기재된 균주는 미생물에서 메티오닌을 공업적으로 생산하기 위한 것이 아니다. 그 후, 어떠한 개선도 없었다.
지금까지, 메티오닌의 생산을 증가시키는 미생물을 생산하기 위한 선행 기술의 접근은 메티오닌 및 다른 황 함유 화합물의 생합성 경로에 관련된 유전자를 동정한 데 이어서, 해당 기능에 의존하는 유전자의 과발현 또는 억제에 의해 메티오닌 또는 다른 화합물의 생산을 증가시키는 것에 집중되었다.
이러한 시도는 예를 들면, WO 02/10209에 기재되었다. 여기서, 이 문헌이 단순히 기재하고 있는, 예를 들면, 메티오닌의 생산을 증가시키는 개개의 유전자를 과발현 또는 억제하는 것은 문제가 있는 것으로 밝혀졌다. 이 방식에서, 다른 조절 기전은 그대로 두면서 통상 예를 들면, 메티오닌의 생합성의 오직 한 합성 단계에 대한 조절 기전만을 탈활성화시키는 경우, 황 함유 화합물의 생산 증가는 오직 제한적으로 달성될 수밖에 없다(또한, 리 등의 도 3, 상기 참조). 따라서, 통상 앞서 언급한 조절 기전은 황 함유 화합물의 생합성에 관련된 개개의 유전자의 과발현에 의해서는 단지 불충분하게 비커플링될 뿐이다. 이러한 메티오닌 또는 다른 황 함유 화합물의 함량 증가는 달성되더라도 여전히 많지 않으며, 미생물에서 공업적 규모로 발효 생산할 만한 방법을 제공하기에는 충분치 않다.
미생물에서 황 함유 화합물, 예를 들면 메티오닌 생산시, 메티오닌의 생합성 경로의 유전자가 미생물의 환형 게놈에 분포할 수 있다는 특정 문제점이 발생한다(뒤케르트 등, 상기 참조). 메티오닌의 생합성 경로의 유전자가 이와 같이 게놈에 분포하는 미생물의 예로는 코리네박테리움 글루타미쿰, 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)와 같은 세라티아, 및 살모넬라(Salminella)가 있다. 메티오닌 생합성을 담당하는 유전자의 분포는 유전자가 예를 들면, 오페론(operon), 즉 통상의 조절 단위 내에서 조직화되지 않은 것을 내포하는 것으로 간주될 수 있다. 이 경우, 몇몇 조절 기전이 동시에 비커플링되어 미생물에 의해 생산되는 메티오닌의 양을 보다 유효하게 향상시키는 것은 예를 들면, 상기 오페론을 조절하는 분자 스위치에 영향을 줌으로써, 즉 과발현시키거나 억제시킴으로써 달성될 수 있다. 대체로, 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈에서 메티오닌의 생합성에 관련된 유전자의 분포에도 불구하고 이러한 오페론이 존재할 수 있다는 사실이 최근 밝혀졌다(문헌[Rey et al. (2003), J. Biotechnol., 103, 51-65] 참조).
레이(Rey) 등은 단백질 McbR이 메티오닌 생합성에 관련된 하기 유전자의 발 현을 조절하는 전사 억제제임을 밝혀낼 수 있었다: metY(O-아세틸-L-호모세린 술프히드릴라아제 코딩), metK(S-아데노실-메티오닌 신테타아제 코딩), hom(호모세린 데히드로게나아제 코딩), cysK(L-시스테인 신타아제 코딩), cysI(NADPH 의존 술피드 리덕타아제 코딩) 및 ssuD(알칸술포네이트 모노옥시게나제 코딩). 앞서 언급한 효소는 모두 메티오닌 및/또는 시스테인 생합성에 관련되어 있으므로, 저자는 McbR에 대한 C. 글루타미쿰의 녹아웃(knockout) 균주에서 증가된 양의 메티오닌이 생산된다는 것을 밝혀낼 수 있었다.
이러한 결과에 비추어, 미생물에서 황 함유 화합물에 대한 생합성 경로의 중추적 조절에 관련된 추가 인자들을 동정하는 것에 대한 강한 요구가 존재하며, 이러한 중추적 조절 스위치를 (기능에 따라) 과발현 또는 억제시킴으로써, 현저히 증가된 양의 황 함유 화합물을 생산하는 미생물을 생산하는 것이 가능하다.
따라서, 본 발명의 과제는 황 함유 화합물을 생산할 수 있는 미생물을 제공하는 것이다.
특히, 또한, 본 발명의 과제는 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 미생물에서 메티오닌 또는 시스테인과 같은 황 함유 화합물을 생산하는 미생물 및 방법을 제공하는 것이며, 이때 황 함유 화합물의 생합성 경로의 중추 조절 요소를 탈활성화시킴으로써 이러한 황 함유 화합물을 현저히 증가된 양으로 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 과제는 예를 들면, 메티오닌 및/또는 시스테인과 같은 황 함유 화합물을 그들의 해당 야생형에 비해 증가된 양으로 생산하는 돌연변이 유기 체를 생산하는 데 사용될 수 있는 핵산 서열을 동정하는 것이다.
하기 상세한 설명으로부터 뚜렷이 나타나는 상기 및 추가의 본 발명의 과제는 독립항에 의해 해결된다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 종속항에 기재된다.
본 발명의 범위 내에서, C. 글루타미쿰에서의 신규한 선택 및 돌연변이 기전에 의해, C. 글루타미쿰에서 황 함유 화합물, 특히 메티오닌의 조절시 중추적 조절 스위치를 나타내는 인자, 즉 NCgl2640(엔트레즈(Entrez) 데이터베이스의 진뱅크(GenBank) 등록 번호, http://www.ncbi.nlm.nih.gov, 서열 번호 1)을 동정하는 것이 가능했다. NCBI(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 BLAST 프로그램에 의한 NCgl2640에 의해 코딩되는 아미노산 서열(진뱅크 등록 번호: NP_601931, 서열 번호 2)을 사용한 상동성 검색이 몇몇 동족체가 예를 들면, 대장균과 같이 다른 상이한 유기체에 존재한다는 결과를 밝혀냄에 따라, 아미노산 및 황 함유 화합물의 생합성 경로의 보존의 측면에서, 특히 상이한 미생물 사이에서 상기 인자가 다른 미생물에서 황 함유 화합물의 생합성 경로를 중추적으로 조절하는 데에도 관련될 수 있음을 추정할 수 있다.
본 발명의 범위 내에서 나타나는 바와 같이, 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 함량 및/또는 활성이 야생형에 비해 감소된 미생물을 황 함유 화합물을 생산하는 데 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 목적은 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이 미생물의 야생형에 비해 감소된 미생물에 관한 것이다. 하기에서, 또한 이러한 본 발명의 목적은 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 함량 및/또는 활성이 미생물의 야생형에 비해 감소되도록 하는 것으로 기재된다.
본 발명의 추가의 목적은 서열 번호 1에 나타낸 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량/활성이 야생형에 비해 감소되거나 또는 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 함량/활성이 야생형에 비해 감소됨으로 인해 L-메티오닌, L-시스테인, L-호모시스테인, L-시스타티오닌, S-아데노실-L-메티오닌, 글루타티온, 바이오틴, 티아민 및/또는 리포산, 바람직하게는 L-메티오닌 및/또는 L-시스테인과 같은 황 함유 화합물을 생산할 수 있는 앞서 언급한 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 대응하는 게놈 핵산 서열(들)의 붕괴 및/또는 삭제에 의해 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이 야생형에 비해 감소된 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 돌연변이를 게놈 핵산 서열에 도입시켜 하기 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 비기능적 형태를 발현시킴으로써 서열 번호 1에 나타낸 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 함량 및/또는 활성 또는 이러한 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이 야생형에 비해 감소된 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 안티센스(antisense) 방법에 의해, 하기 핵산의 mRNA에 특이적인 리보자임의 발현에 의해 또는 리보뉴클레아제 P 구조체의 발현에 의해 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 함량 및/또는 활성이 야생형에 비해 감소된 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 하기 핵산에 코딩되는 단백질에 특이적이고, 미생물에서 활성을 차단하거나 억제하는 재조합 항체의 발현에 의해 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 함량 및/또는 활성 또는 이러한 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이 야생형에 비해 감소된 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 함량 및/또는 활성 또는 이러한 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이, 상기 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 비기능적 형태를 세포에서 과발현시킴으로써 야생형에 비해 감소된 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 함량 및/또는 활성 또는 이러한 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이 감소되는 것 외에, C. 글루타미쿰으로부터의 McbR 또는 그의 동족체를 코딩하는 핵산의 함량 및/또는 활성이 야생형에 비해 감소된 미생물에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 한 목적은 서열 번호 3의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 함량 및/또는 활성 또는 서열 번호 4의 서열을 갖는 단백질과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 단백질의 함량 및/또는 활성도 야생형에 비해 감소된 미생물에 관한 것이다. 여기서, 함량 또는 활성 감소는 상기한 것과 동일한 방식으로 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 미생물의 특히 바람직한 실시양태는 앞서 언급한 핵산 서열 또는 이에 의해 코딩되는 단백질의 발현이 실질적으로 완전히 억제된 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산 또는 이에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성을 감소시키는 것 외에, 원하는 황 함유 화합물의 생합성 경로의 유전자 생성물을 코딩하는 하나 이상의 추가의 핵산의 함량 및/또는 활성이 야생형에 비해 증가된 미생물에 관한 것이다. 또한, 이러한 미생물에서, 대사의 대사산물이 상기 하나 이상의 추가의 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 활성에는 영향을 미치지 않도록 핵산을 돌연변이화시킬 수 있다. 이 미생물에서, C. 글루타미쿰으로부터의 McbR 또는 동족체의 함량 및/또는 활성은 앞서 언급한 바와 같이 추가로 감소될 수 있다.
동일하게, 본 발명의 추가의 목적은 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산 또는 이에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성을 감소시키는 것 외에, 원하는 황 함유 화합물의 생합성 경로의 유전자 생성물을 코딩하는 하나 이상의 추가의 핵산의 함량 및/또는 활성이 야생형에 비해 추가로 감소된 미생물에 관한 것이다. 상기 미생물에서, C. 글루타미쿰으로부터의 McbR 또는 동족체의 함량 및/또는 활성은 앞서 언급한 바와 같이 추가로 감소될 수 있다.
본 발명의 추가의 목적은 본 발명에 따른 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 미생물에서 황 함유 화합물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 여기서, L-메티오닌및/또는 L-시스테인의 특히 바람직한 생산 방법은 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산 또는 이러한 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이 야생형에 비해 감소되는 미생물 코리네박테리움 글루타미쿰을 사용한다.
본 발명의 추가의 목적은 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산 또는 이러한 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성을 감소시키는 것 외에, 추가의 앞서 언급한 핵산의 함량 및/또는 활성을 상기한 방식으로 증가시키거나 감소시키는 것인, 미생물을 사용하여 L-메티오닌 및/또는 L-시스테인을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 앞서 언급한 핵산의, 황 함유 화합물을 생산하는 데 사용될 수 있는 미생물 생산 용도에 관한 것이다.
본 발명의 범위 내에서, 메티오닌 생합성의 신규한 조절제는 C. 글루타미쿰에서 동정될 수 있다. 이는 C. 글루타미쿰의 메티오닌 과생산 균주를 동정하는 종래 당업계에서 이루어진 시도와는 상당히 다른 신규한 선택 및 돌연변이 전략을 사용함에 의해 가능하였다(실시예 참조).
본 발명의 범위 내에서, 서열 번호 1(진뱅크 등록 번호: NCgl2640)을 갖는 핵산 서열이 서열 번호 2(진뱅크 등록 번호: NP_601931)의 아미노산 서열을 갖고 C. 글루타미쿰에서 메티오닌의 생합성 경로의 조절에 적극적으로 관련된 단백질을 코딩한다는 점이 본 명세서에서 처음으로 밝혀질 수 있다. 본 발명의 범위 내에서, C. 글루타미쿰에서 서열 번호 1을 갖는 핵산 서열의 삭제 또는 기능적 붕괴가 서열 번호 1에 의해 코딩되는 단백질의 탈활성화된 조절로 인해 메티오닌을 증가된 양으로 생산하는 균주를 생산한다는 점도 본 명세서에서 처음으로 밝혀질 수 있다.
NCBI에서의 BLAST 검색은 C. 글루타미쿰으로부터의 NCgl2640의 동족체가 많은 다양한 미생물에 존재한다는 점을 보여주었다. 황 함유 화합물에 대한 생합성 경로가 많은 다양한 유기체에서 보존됨에 따라, 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 함량 및/또는 활성이 야생형에 비해 감소된 미생물도 메티오닌 및/또는 시스테인과 같은 다른 황 함유 화합물을 증가된 수준으로 생산할 수 있는 것으로 추정된다.
본 발명에 따르면, NCgl2640은 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산 분자를 나타내는 것으로 이해된다. 이러한 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질은 서열 번호 2의 서열을 갖는다.
본 발명에 따르면, 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산 또는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대한 기능적 동족체는 서열이 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산 또는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 상당한 상동성을 나타내는 핵산 분자 또는 단백질을 나타내는 것으로 이해된다.
본 발명에 따르면, NCgl2640의 함량 또는 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 함량은 해당 미생물에 대해 결정될 수 있는 바와 같이 이러한 핵산 또는 이 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 양을 나타내는 것으로 이해된다.
본 발명에 따르면, NCgl2640 또는 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 활성은 상기 핵산 서열에 의해 코딩되는 단백질의 세포 활성을 나타내는 것으로 이해된다. 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 세포 기능은 황 함유 화합물, 특히 메티오닌의 생합성 조절시 알 수 있다. 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 서열과 상동성을 갖는 핵산이 C. 글루타미쿰에서 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열을 갖는 핵산과 동일한 활성을 갖는지 여부는 용이하게 결정될 수 있다. 이를 위해, 해당 미생물에서 해당 게놈 핵산 서열을 삭제하고, 예를 들면, D,L-에티오닌과 같은 메티오닌의 구조 유사체의 첨가에도 불구하고 미생물이 여전히 메티오닌 또는 다른 황 함유 화합물을 생산할 수 있는지 여부를 결정한다.
본 발명에 따르면, 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 야생형에 비한 변화된 함량은 야생형에 비해 감소된 상기 핵산 또는 이러한 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 양을 나타내는 것으로 이해된다. 일반적으로, 상기 핵산 또는 이러한 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 양의 감소는 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산 또는 이에 기능적으로 상동성을 갖는 핵산인 내인성 핵산의 함량을 감소시킴으로써 달성된다.
본 발명에 따르면, 야생형은 유전자 조작되지 않은 대응하는 본래의 유기체를 나타내는 것으로 이해된다.
서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산 또는 이러한 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 활성의 감소는 내인성 핵산 또는 이러한 핵산에 의해 코딩되는 내인성 단백질의 양 또는 함량을 감소시킴으로써 달성될 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 상기 핵산 또는 이러한 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 활성의 감소는, 상기 핵산에 의해 코딩되는 단백질과 그들의 세포 결합 파트너의 상호작용이 예를 들면, NP_601931 또는 그의 동족체의 비기능적 형태 또는 이에 특이적인 항체의 발현에 의해 현저히 억제되면서 내인성 핵산 또는 상기 내인성 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 활성은 변화되지 않음을 나타내는 것으로 이해된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 미생물에서 발생하는 서열 번호 1에 나타낸 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산 또는 이러한 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성의 감소는 5％ 이상, 바람직하게는 10％ 이상, 특히 바람직하게는 20％ 이상, 또한 특히 바람직하게는 40％ 이상, 또한 특히 바람직하게는 60％ 이상, 특히 바람직하게는 80％ 이상, 또한 특히 바람직하게는 90％ 이상, 또한 특히 바람직하게는 95％ 이상, 또한 특히 바람직하게는 98％ 이상, 가장 바람직하게는 100％이다.
본 발명에 따르면, 용어 "서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산 또는 이러한 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 발현 억제"는 용어 "상기 핵산 또는 이러한 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성의 감소"와 유의어이다.
이미 앞서 언급한 바와 같이, NCgl2640의 동족체는 NCBI에서 BLAST 분석을 통해 많은 다양한 유기체에서 동정될 수 있다. 장래에는, 많은 다양한 미생물에 대한 더욱더 많은 서열 데이터가 이용가능할 것이고, 또한, 본 발명에서는 핵산 또는 이에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이 야생형에 비해 감소된 미생물을 포함하며, 단 상기 핵산 또는 상기 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산 또는 서열 번호 2의 서열을 갖는 단백질과 상당한 또는 실질적인 서열 상동성을 나타낸다.
두 핵산 또는 단백질의 동일성(identity)은 특정 서열 영역, 바람직하게는 전체 서열 길이에 걸친 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 동일성, 특히 미국 위스콘신주 메디슨 소재의 디엔에이 스타 인크. (DNA Star Inc.)에 의한 레이저진(Lasergene) 소프트웨어의 보조로 CLUSTAL 방법(문헌[Higgins et al., 1989, Comput. Appl. Biosci., 5(2), 151] 참조)을 사용하여 비교함으로써 계산된 동일성을 나타내는 것으로 이해된다. 또한, 상동성도 미국 위스콘신주 메디슨 소재의 디엔에이 스타 인크.에 의한 레이저진 소프트웨어의 보조로 CLUSTAL 방법(문헌[Higgins et al., 1989, Comput. Appl. Biosci., 5(2), 151] 참조)을 사용하여 계산할 수 있다.
핵산 분자는 동일한 5'에서 3'으로의 순서에서 동일한 뉴클레오티드를 갖는 경우 동일하다.
아미노산 분자는 동일한 아미노산을 N-말단에서 C-말단으로 동일한 순서로 갖는 경우 동일하다.
본 발명에 따르면, 일반적으로, 상당한 또는 실질적인 서열 상동성은 DNA 분자의 핵산 서열 또는 단백질의 아미노산 서열이 서열 번호 1의 또는 서열 번호 2의 핵산 또는 아미노산 서열 각각 또는 그들의 기능적 등가 부분과 30％ 이상, 바람직하게는 40％ 이상, 또한 바람직하게는 50％ 이상, 더 바람직하게는 60％ 이상 또는 70％ 이상, 특히 바람직하게는 90％ 이상, 특히 바람직하게는 95％ 이상, 가장 바람직하게는 98％ 이상 동일한 것을 나타내는 것으로 이해된다. 바람직하게는, 상동성은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 전체 서열 길이에서 결정한다.
따라서, 상동성은 바람직하게는 전체 아미노산 또는 핵산 서열 영역에서 계산한다. 앞서 언급한 프로그램 외에, 당업자는 임의로 상이한 서열을 비교하기 위해 상이한 알고리즘에 기초한 추가의 프로그램을 갖는다. 여기서, 니들만(Needleman) 및 분쉬(Wunsch), 또는 스미스(Smith) 및 워터맨(Waterman)에 의한 알고리즘이 특히 신뢰가능한 결과를 생성한다. 서열 비교를 위해, 또한 예를 들면, 프로그램 파일 오파(Pile Aupa)(문헌[J. Mol. Evolution. (1987), 25, 351-360; Higgins et al., (1989), Cabgos, 5, 151-153] 참조)를 사용하거나, 또는 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)(미국 53711 위스콘신주 메디슨 사이언스 드라이브 575)에 의한 GCG 소프트웨어 팩키지(Software Package)에 함유된 프로그램 갭 앤드 베스트 피트(Gap and Best Fit)(문헌[Needleman and Wunsch, (1970), J. Mol. Biol 48, 443-453 and Smith and Waterman(1981), Adv., Appl. Math., 2, 482-489] 참조)도 사용할 수 있다.
또한, 상당한 또는 실질적인 상동성 또는 서열 상동성은 상기 서열이 서열 번호 1 및 2를 갖는 서열에 기능적으로 상동성을 가짐을 나타내는 것으로도 이해된다.
본 발명의 한 실시양태는 앞서 언급한 핵산의 야생형에 비해 증가된 양의 황 함유 화합물, 특히 메티오닌 및/또는 시스테인을 생산할 수 있는 미생물 생산 용도에 관한 것이다. 여기서, 당업자는 증가된 양의 황 함유 화합물을 생산할 수 있는 미생물을 생성하는 경우, 각각의 경우, 해당 유기체에서 C. 글루타미쿰으로부터 NCgl2640의 기능적 동족체에 대응하는 핵산의 함량 또는 활성이 야생형에 비해 감소하게 된다는 사실을 인식한다.
높은 상동성, 즉 높은 유사성 또는 동일성을 갖는 DNA 서열은 본 발명에 따른 핵산의 서열 번호 1에 나타낸 서열에 대응하는 DNA 서열의 진정한 후보이다. 이러한 유전자 서열은 예를 들면, PCR 및 혼성화와 같은 표준 기술을 통해 단리될 수 있고, 그들의 기능은 당업자에 의해 대응하는 효소 활성 시험 및 다른 실험에 의해 결정될 수 있다. 본 발명에 따르면, 또한 상이한 유기체의 DNA 서열에서 가장 많이 보존된 영역을 먼저 동정함으로써 PCR 프라이머를 디자인하기 위해 DNA 서열의 상동성 비교를 사용할 수 있다. 그 다음, 제1 단계로, 이러한 PCR 프라이머를 사용하여 본 발명의 핵산과 상동성을 갖는 핵산의 성분인 DNA 단편을 단리시킬 수 있다.
이러한 상동성 비교 또는 검색에 사용될 수 있는 다양한 검색 엔진이 존재한다. 이러한 검색 엔진은 예를 들면, NCBI에 의해 제공되는 BLAST 프로그램의 CLUSTAL 프로그램 군을 포함한다.
또한, DNA 서열을 본 발명에 따른 서열과 상동성을 갖는 가장 다양한 유기체로부터 단리시킬 수 있는 다양한 실험 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 이 방법 중에는 예를 들면, 대응하는 축퇴 프로브를 사용한 cDNA 라이브러리의 제조 및 스크리닝이 있다.
서열 번호 2와 상동성을 갖는 서열은 예를 들면, 하기 단백질을 코딩하는 서열일 수 있다:
(각각의 경우, 이 수들은 진뱅크 등록 번호임).
이미 앞서 언급한 바와 같이, 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산 또는 이러한 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성을 변화시키는 것은 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 활성 또는 함량의 감소는 예를 들면, 전사, 번역 및/또는 단백질 수준에서 조절 기전의 자극을 탈활성화하거나 또는 해당 핵산의 유전자 발현을 감소시킴으로써 수행될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 해당 게놈 서열의 발현은 감소되게 된다. 바람직하게는, 이는 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산에 대한 게놈 서열이 불활성화되는 미생물이다. 이러한 게놈 서열의 불활성화는 상이하게 수행될 수 있다. 한 가능성은 상동 재조합에 의해 게놈 서열을 삭제하는 것이다. 또다른 가능성은 게놈 서열에 삽입을 도입시켜 핵산의 발현을 방지하거나 또는 비기능적 단백질로 만드는 것이다.
본 발명의 범위 내에서, 비기능적 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이에 기능적으로 상동성을 갖는 단백질의 구조 및 이에 따른 기능이 황 함유 화합물, 특히 메티오닌의 생합성 경로에서 더 이상 중추적 조절 스위치로 기능하지 않도록 점 돌연변이, 삽입 또는 삭제에 의해 변화된 단백질 또는 단백질 단편을 나타내는 것으로 이해된다.
삽입, 삭제, 또는 돌연변이를 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 게놈 서열에 도입시킴으로써 비기능적 단백질 또는 단백질 단편이 얻어지는지 여부는 용이하게 결정될 수 있다. 이를 위해, 추정의 비기능적 단백질 또는 단백질 단편을 발현하는 미생물을 예를 들면, D,L-에티오닌과 같은 메티오닌의 구조 유사체의 존재 하에서 성장할 수 있는 능력에 대해 시험한다. 미생물이 성장하는 경우, 이들은 비기능적 단백질 또는 단백질 단편이다.
게놈 서열의 삭제에 의하거나 돌연변이, 삽입, 또는 삭제의 도입으로 비기능적 단백질 또는 단백질 단편의 생성에 의해 서열 번호 1과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 게놈 서열의 발현을 감소시키는 것을 일반적으로 게놈 서열의 기능적 붕괴로 지칭한다.
여기서, 상동 재조합에 의한 게놈 절편의 삭제 또는 기능적 붕괴는
a) 하기 핵산 서열을 5'→3' 배향으로 포함하는 벡터를 생성하는 단계:
- 미생물에서 기능적인 프로모터 서열,
- 이에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 1을 갖는 서열과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산 서열의 5' 말단에 동일하거나 상동성을 갖는 DNA 서열,
- 이에 작동가능하게 연결된, 내성 유전자를 코딩하는 DNA 서열,
- 이에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 1을 갖는 서열과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산 서열의 3' 말단에 동일하거나 상동성을 갖는 DNA 서열,
- 이에 작동가능하게 연결된, 미생물에서 기능적인 종결 서열; 및
b) a)로부터의 벡터를 미생물에 전달하고, 임의적으로, 벡터를 미생물의 게놈에 통합시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
상동 재조합에 대한 한 가능성을 하기 실시예로부터 취할 수 있다. 예를 들면, 미생물에서 핵산 서열을 과발현시키는 것으로 공지된 통상적인 플라스미드가 이러한 상동 재조합에 대한 벡터로 사용될 수 있다는 점이 당업자에게 공지되어 있다. 전형적으로, 항생제에 대한 내성을 내성 유전자로 사용할 것이다(하기 참조).
작동가능한 연결은 프로모터, 코딩 서열, 종결제(terminator), 및 임의적으로, 조절 요소 각각이 코딩 서열의 발현시 그의 기능을 충분히 수행할 수 있도록 하는 추가의 조절 요소의 순차 배열을 나타내는 것으로 이해된다. 작동가능하게 연결가능한 서열의 예로는 활성화 서열, 인헨서(enhancer) 등이 있다. 추가의 조절 요소는 선택가능한 마커(marker), 증폭 신호, 복제 기원 등을 포함한다. 적합한 조절 서열은 예를 들면, 문헌[Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재되어 있다.
비기능적 단백질 또는 단백질 단편을 유발하는 점 돌연변이, 삽입 또는 삭제를 게놈 서열에 도입시키는 것은 통상적으로 선행 기술에 공지된 기술에 의해 수행된다(특히, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2001), 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA] 및 미국 라 졸라 소재의 스트라타진(Stratagene)에 의한 소위 퀵체인지(Quikchange) 돌연변이생성 방법 참조). 점 돌연변이, 삽입 또는 삭제를 미생물의 게놈 서열에 도입시키는 추가의 방법은 특히, 문헌[Jager et al., (1992) J. Bacteriol. 174, 5462-5465] 및 WO 02/070685에 기재되어 있다.
앞서 언급한 핵산의 함량 및/또는 활성을 감소시키는 추가의 가능성은 예를 들면, 안티센스 전략에 의해 이루어질 수 있다. 이를 위해, 예를 들면,
a) 하기 핵산 서열을 5'→3' 배향으로 포함하는 벡터를 생성하는 단계:
- 해당 미생물에서 기능적인 프로모터 서열,
- 이에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 1 또는 그의 기능적 동족체에 대한 안티센스 서열,
- 이에 작동가능하게 연결된, 해당 미생물에서 기능적인 종결 서열; 및
b) a)로부터의 벡터를 미생물에 전달하고, 임의적으로, 벡터를 미생물의 게놈에 통합시키는 단계를 포함하는 방법을 사용할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 mRNA를 특이적으로 인식하는 리보자임을 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 벡터를 본 발명에 따른 미생물을 생산하는 데 사용한다. 특이적 mRNA에 대한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 활성을 갖는 리보자임이 어떻게 제조될 수 있는지는 당업자에게 공지되어 있다. 이는 예를 들면, 스테이네케(Steinecke) 등의 문헌[Steinecke et al. (1992) EMBO J., 11, 1525]에 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 범위 내에서, 또한 용어 리보자임은 실제 리보자임 외에, 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 mRNA와 상보적인 리더(leader) 서열도 포함함으로써 mRNA 특이적 리보자임이 리보자임의 mRNA 기질에 훨씬 더 우수하게 특이적이게 하는 RNA 서열을 나타내는 것으로 이해된다.
이러한 방법은 예를 들면,
a) 하기 핵산 서열을 5'→3' 배향으로 포함하는 벡터를 생성하는 단계:
- 해당 미생물에서 기능적인 프로모터 서열,
- 이에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 1의 핵산 또는 그의 기능적 동족체의 mRNA를 특이적으로 인식하는 리보자임을 코딩하는 DNA 서열,
- 이에 작동가능하게 연결된, 해당 미생물에서 기능적인 종결 서열; 및
b) a)로부터의 벡터를 미생물에 전달하고, 임의적으로, 벡터를 미생물의 게놈에 통합시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 미생물 생산에 대한 추가의 별법은 서열 번호 1에 나타낸 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 안티센스 서열로 이루어진 DNA 서열 및 RNase P를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터에 의해 핵산을 전달하는 것에 의해 제공된다. RNase P를 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 mRNA로 향하게 함으로써 RNase P를 통해 mRNA를 분절시키는 리더 서열(안티센스 서열)을 함유하는 이러한 벡터의 전사에서, RNA 분자가 세포에서 합성된다(또한, US 특허 5,168,053 참조). 바람직하게는, 리더 서열은 서열 번호 1에 나타낸 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 DNA 서열에 상보적인 10 내지 15개의 뉴클레오티드를 포함한다.
이러한 방법은 예를 들면,
a) 하기 핵산 서열을 5'→3' 배향으로 포함하는 벡터를 생성하는 단계:
- 해당 미생물에서 기능적인 프로모터 서열,
- 이에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 1의 서열 또는 기능적 동족체에 상보적인 핵산 서열 또는 이의 일부,
- 이에 작동가능하게 연결된, 리보뉴클레아제 P를 코딩하는 DNA 서열,
- 이에 작동가능하게 연결된, 해당 미생물에서 기능적인 종결 서열; 및
b) a)로부터의 벡터를 미생물에 전달하고, 임의적으로, 벡터를 미생물의 게놈에 통합시키는 단계를 포함할 수 있다.
용어 상보성은 핵산 분자가 상보적 염기들 간의 수소 결합을 기초로 또다른 핵산 분자와 혼성화할 수 있는 것을 설명한다. 두 핵산 분자가 서로 혼성화할 수 있는 경우 100％ 상보적일 필요는 없다는 것이 당업자에게 공지되어 있으며, 바람직하게는, 한 핵산은 또다른 핵산과 혼성화되는 경우 이와 40％ 이상, 바람직하게는 50％ 이상, 또한 바람직하게는 60％ 이상 또는 70％ 이상, 특히 바람직하게는 80％ 이상, 또한 특히 바람직하게는 90％ 이상, 특히 바람직하게는 95％ 이상, 가장 바람직하게는 98％ 이상 또는 100％ 상보적이다.
바람직하게는, 상보성 정도는 상동성 및 동일성 정도와 마찬가지로 단백질 또는 핵산의 전체 길이에서 결정되게 된다.
엄격한 시험관내 혼성화 조건은 당업자에게 공지되어 있고, 문헌으로부터 이용가능하다(예를 들면, 문헌[샘브룩 등], 상기 참조). 용어 특이적 혼성화는 특이적 핵산 서열을 갖는 핵산이 예를 들면, DNA 또는 RNA 분자로 된 복잡한 혼합물의 일부인 경우, 엄격한 조건 하에서, 분자가 이러한 특이적 핵산 서열을 갖는 핵산에 결합하는 환경을 지칭한다.
따라서, 용어 엄격한 조건은 핵산이 표적 서열을 갖는 핵산에는 우선적으로 결합하지만, 상이한 서열을 갖는 핵산에는 결합하지 않거나 또는 적어도 실질적으로 적게 결합하는 조건을 지칭한다.
엄격한 조건은 환경에 따라 좌우된다. 긴 서열은 고온에서 특이적으로 혼성화한다. 일반적으로, 엄격한 조건은 혼성화 온도가 정해진 이온 강도 및 정해진 pH 값에서 특이적 서열에 대해 융점(Tm) 미만 약 5 ℃이도록 선택된다. Tm은 표적 서열에 상보적인 분자의 50％가 상기 표적 서열과 혼성화하는 온도(정해진 pH 값, 정해진 이온 강도 및 정해진 핵산 농도에서)이다. 전형적으로, 엄격한 조건은 0.01 내지 1.0 M의 나트륨 이온(또는 또다른 염의 이온)의 염 농도 및/또는 7.0 내지 8.3의 pH를 포함한다. 온도는 짧은 분자, 예를 들면, 10 내지 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 것들의 경우 30 ℃ 이상이다. 또한, 엄격한 조건은 예를 들면, 포름아미드와 같은 탈안정화제를 첨가하는 것을 포함할 수 있다.
전형적인 혼성화 및 세척 완충제는 하기 조성으로 이루어진다.
예비 혼성화 용액: 0.5％ SDS
5 × SSC
50 mM NaPO4, PH 6.8
0.1％ Na 피로포스페이트
5 × 덴하르트 시약(Denhardt's Reagent)
100 ㎍/ml 연어 정액
혼성화 용액: 예비 혼성화 용액
1 × 106 cpm/ml 프로브(5-10 min, 95 ℃)
20 × SSC: 3 M NaCl
0.3 M 시트르산나트륨
HCl을 사용하여 pH 7로 조정
50 × 덴하르트 시약: 5 g 피콜(Ficoll)
5 g 폴리비닐 피롤리돈
5 g 소혈청 알부민
증류수로 500 ml로 조정.
통상적으로, 혼성화는 다음과 같이 수행된다:
임의적 과정: 블롯을 30분 동안 1 × SSC/0.1％ SDS 중에서 65 ℃에서 세척
예비 혼성화: 50 내지 55 ℃에서 2시간 이상
혼성화: 55 내지 60 ℃에서 밤새
세척: 5분 2 × SSC/0.1％ SDS 혼성화 온도
30분 2 × SSC/0.1％ SDS 혼성화 온도
30분 1 × SSC/0.1％ SDS 혼성화 온도
45분 0.2 × SSC/0.1％ SDS 65 ℃
5분 0.1 × SSC 실온
통상, 안티센스 전략에서 전달된 핵산은 20 내지 1,000개, 바람직하게는 20 내지 750개, 특히 바람직하게는 약 400 내지 800개 및 500 내지 750개의 뉴클레오티드를 포함한다. 그러나, 20 내지 500개, 또한 특히 바람직하게는 20 내지 300개, 특히 바람직한 20 내지 150개, 또한 특히 바람직한 20 내지 75개, 가장 바람직하게는 약 20 내지 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산도 사용할 수 있다. 서열이 오직 약 20 또는 25개의 뉴클레오티드만을 포함하는 것도 가능하다.
세포에서의 전사로 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산의 mRNA에 상보적인 서열 또는 그의 기능적으로 상동성을 갖는 서열(예를 들면, 안티센스 전략에서)이 생성되는 핵산이 미생물에 전달되는 경우, 이 서열은 mRNA와 100％ 상보적일 필요는 없다. 이러한 서열이 50％ 이상, 바람직하게는 60％ 이상, 특히 바람직하게는 70％ 이상, 또한 특히 바람직하게는 80％ 이상, 특히 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 상보성을 갖는 것으로 충분하다. 여기서, 편차는 삭제, 치환 및/또는 삽입에 의해 유발될 수 있다.
일반적으로, 서열 번호 1에 나타낸 서열 또는 이의 기능적으로 상동성을 갖는 서열의 mRNA 영역과 특이적으로 혼성화할 수 있는 오직 이러한 상보적 서열만이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. NP_601931 이외의 단백질 또는 이에 상동성을 갖는 단백질의 RNA 영역과 생체내 혼성화하고, 이를 억제하는 서열은 본 발명에 따른 방법에 적합하지 않다.
또한, 앞서 언급한 방법 중 일부는 서열 번호 1의 서열을 갖거나 이에 상보적인 핵산의 mRNA의 코딩 부의 성분이 아닌 서열을 사용하여 수행할 수 있다. 이는 예를 들면, 상기 서열이 5' 또는 3' 비번역된 영역으로부터의 서열인 경우 충분할 수 있으며, 단 이러한 조절 서열은 서열 번호 1의 서열 또는 이에 상동성을 갖는 서열을 갖는 핵산의 mRNA의 특징이다.
특히, 이러한 서열은 mRNA의 번역이 안티센스 구조체에 의해 억제되는 경우 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 용어 mRNA는 서열 번호 1의 서열 또는 이에 상동성을 갖는 서열을 갖는 핵산의 mRNA의 코딩 성분, 뿐만 아니라 서열 번호 1의 서열 또는 이에 상동성을 갖는 서열을 갖는 핵산의 mRNA의 특징인 예비 mRNA 또는 성숙 mRNA에서 발생하는 모든 조절 서열을 포함한다. 따라서, 이는 DNA 서열에도 적용된다. 이는 예를 들면, 5' 및 3' 비번역된 영역, 프로모터 서열, 상류 활성화 서열 등에 관련된다.
전사로 리더 서열 및 RNAse P로 이루어진 RNA 분자가 생성되는 벡터를 사용하는 경우, 서열 번호 1의 서열 또는 상동 서열을 갖는 핵산의 mRNA를 특이적으로 인식하기 위해 리더 서열은 충분히 상보적이어야 한다. 해당 요건에 따르면, 이는 mRNA의 영역이 리더 서열에 의해 인식되도록 선택될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 리더 서열은 약 20개의 뉴클레오티드를 포함하지만, 15개 아래로 많이 떨어지지 않아야 한다. 100％ 상보성의 리더 서열의 경우, 12개의 뉴클레오티드도 충분하다. 물론, 리더 서열은 100개 이하의 뉴클레오티드 또는 그 이상을 포함할 수 있으며, 이는 오직 해당 mRNA에 대한 그들의 특이성만을 증가시킨다.
본 발명의 범위 내에서, 센스 서열은 지칭되는 경우, NCgl2640 또는 그의 동족체에 대한 유전자의 코딩 가닥에 대응하거나 또는 이의 일부를 포함하는 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 여기서, 상기 서열은 서열 번호 1의 서열 또는 그의 기능적 동족체이다.
본 발명의 범위 내에서, 안티센스 서열은 지칭되는 경우, NP_601931 또는 그의 동족체에 대한 유전자의 비코딩 DNA 가닥에 대응하는 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 따라서, 이 서열은 서열 번호 1 또는 그의 동족체에 상보적이다. 물론, 이 서열은 비코딩 DNA 가닥의 서열과 100％ 동일할 필요는 없으며, 앞서 언급한 수준의 상동성을 가질 수 있다. 또한, 이는 정의에 따른 유전자의 mRNA에 상보적인 안티센스 서열이 상기 mRNA와 100％ 상보적일 필요가 없는 환경에서 반영된다. 예를 들면, 또한, 이들은 50％ 이상, 바람직하게는 60％ 이상, 특히 바람직하게는 70％ 이상, 또한 특히 바람직하게는 80％ 이상, 특히 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％, 98％ 이상 및/또는 100％ 상보적일 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 안티센스 서열이 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산의 해당 mRNA와 특이적으로 혼성화할 수 있는 것으로 충분하다. 혼성화는 세포 조건 하 생체내에서 또는 시험관내에서 발생할 수 있다.
전형적으로, 안티센스 서열과 내인성 mRNA 서열의 혼성화는 세포 조건 하 생체내에서 또는 시험관내에서 발생할 수 있다.
또한, 용어 센스 및 안티센스는 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 유전자 발현에 대해 당업자는 억제에 사용하기 위해 핵산 분자가 얼마나 길어야 하는지 및 해당 서열에 대해 상동성 또는 상보성을 갖는 것을 필요로 하는지도 인식한다. 본 발명에 따르면, 생체내 및/또는 시험관내에서 NCgl2640 또는 그의 동족체의 코딩 센스 서열과 특이적으로 혼성화할 수 없는, 즉 다른 단백질 부류의 코딩 센스 서열과도 혼성화할 수 있는 안티센스 서열은 사용할 수 없다.
대체로, 안티센스 전략을 리보자임 방법과 합칠 수 있다. 리보자임은 안티센스 서열에 커플링된 경우 표적 서열을 촉매 분절시키는 촉매적 활성 RNA 서열이다(문헌[Tanner et al., (1999) FEMS Microbiol Rev. 23(3), 257-75] 참조). 이는 안티센스 전략의 유효성을 증가시킬 수 있다.
또한, 특이적 DNA 결합 인자, 예를 들면, 징크 핑커(zinc finger) 전사 인자에 의해 유전자 억제, 뿐만 아니라 유전자 과발현도 가능하다.
또한, 표적 단백질 자체를 억제하는 인자를 세포에 도입시킬 수 있다. 단백질 결합 인자는 예를 들면, 앱타머(aptamer)일 수 있다(문헌[Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immnunol. 243, 123-36] 참조).
또한, 억제는 앱타머에 의해 수행될 수 있다. 앱타머는 NP_601931에 특이적으로 결합하고, 경쟁 반응에 의해 단백질의 활성을 감소시키도록 디자인될 수 있다. 대개, 앱타머의 발현은 벡터 기재 과발현을 통해 수행된다. 앱타머의 디자인, 선택 및 발현은 당업자에게 공지되어 있다(문헌[Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol., 243, 123-36] 참조)
상기 단백질의 경우, 특이적 항체는, 미생물에서의 발현이 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성을 감소시키는 추가의 단백질 결합 인자로 간주될 수 있다. 이러한 단일클론, 다클론 또는 재조합 항체의 생산은 표준 프로토콜에 따라 수행된다(문헌[Guide to Protein Purification, Meth. Enzymol. 182, pp. 663-679 (1990), M. P. Deutscher, ed.] 참조). 항체의 발현도 문헌으로부터 공지되어 있다(문헌[Fiedler et al., (1997) Immunotechnology 3, 205-216; Maynard and Georgiou (2000) Annu. Rev. Biomed. Eng. 2, 339-76] 참조).
본 발명에 따른 미생물을 생산하는 추가의 방법은 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 내인성 핵산 또는 이에 의해 코딩되는 단백질의 활성을, 미생물에서 이러한 핵산 또는 단백질의 비기능적 돌연변이체를 발현시킴으로써 감소시키고자 한다. 이러한 비기능적 돌연변이체 또는 형태는 황 함유 화합물, 특히 메티오닌을 미생물에서 더 이상 생합성할 수 없거나 적어도 상당히 제한되게 생합성할 수 있는 핵산 또는 이 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 형태이다. 이러한 비기능적 돌연변이체는 점 돌연변이, 삽입 및/또는 삭제를 가질 수 있다. 이들은 본 발명에 따른 미생물의 생산에 특히 유용하며, 여기서 내인성 핵산 또는 이러한 핵산 서열에 의해 코딩되는 단백질의 함량은 바뀌지 않지만, 서열 번호 1에 나타낸 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 내인성 핵산 또는 이러한 핵산 서열에 의해 코딩되는 단백질의 활성은 앞서 언급한 비기능적 돌연변이체를 과발현시킴으로써 차단된다.
본 발명에 따르면, 이러한 비기능적 돌연변이체는 야생형, 즉 예를 들면, 서열 번호 1 및 2의 서열과 실질적으로 동일한 핵산 또는 아미노산 서열을 갖는다. 그러나, 이들은 일부 위치에서 뉴클레오티드 또는 아미노산의 점 돌연변이, 삽입, 또는 삭제를 가지며, 이는 비기능적 돌연변이체가 야생형과는 달리 그들의 세포 결합 파트너와 상호작용할 수 없거나 또는 상당히 제한적으로 상호작용할 수 있는 효과를 갖는다. 이 방식으로, 비기능적 돌연변이체는 야생형의 세포 결합 파트너와의 상호작용과 경쟁함으로써 황 함유 화합물의 생합성의 조절을 탈커플링한다.
서열 번호 1의 서열을 갖는 본 발명에 따른 핵산의 기능적 또는 비기능적 돌연변이체는 당업자에 의해 용이하게 동정될 수 있다. 당업자는 임의로 점 돌연변이(들), 삽입(들) 또는 삭제(들)를 서열 번호 1과 동일하거나 상동성을 갖는 핵산 서열에 삽입시키는 다양한 기술을 갖고 있다(특히, 문헌[Sambrook (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Jaeger et al., (1992) J. Bacteriol. 174, 5462-5465], WO 02/070685 및 미국 라 졸라 소재의 스트라타진에 의한 소위 퀵체인지 돌연변이생성 방법 참조). 일반적으로 돌연변이로도 지칭될 수 있는 점 돌연변이, 삽입 및/또는 삭제를 도입시킨 후, 당업자는 본 실시예에 예시되거나 선행 기술로부터 공지된 대응하는 시험들에 의해, 돌연변이 단백질이 그들의 정상 활성을 보유하는지 여부를 결정할 수 있다(또한, 상기 참조).
본 발명에 따르면, 용어 "비기능적 단백질 또는 단백질 단편"은 아미노산 또는 핵산 수준에서 NCgl2640 또는 그의 동족체에 대해 실질적인 서열 상동성을 갖지 않는 단백질을 포함하지 않는다. 본 발명의 범위 내에서, 비기능적 돌연변이체는 불활성화된 또는 불활성 또는 우성 음성 단백질로도 지칭된다.
따라서, 앞서 언급한 점 돌연변이(들), 삽입(들) 및/또는 삭제(들)를 갖는 본 발명에 따른 기능적 또는 비기능적 돌연변이체, 또는 기능적 등가부는 NCgl2640에 대한 실질적인 서열 상동성에 의해 특성화된다.
비기능적 돌연변이체가 본 발명의 내용에 따른 돌연변이체인지 여부는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 이를 위해, 원하는 돌연변이, 즉 점 돌연변이, 삽입 또는 삭제를 예를 들면, 상동 재조합 또는 부위 특이적 돌연변이생성에 의해 서열 번호 1과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 게놈 핵산 서열에 도입시키고, 내인성 핵산 서열의 함량 및/또는 활성 감소가 황 함유 화합물의 생합성의 조절의 탈커플링을 유도하여 상기 미생물이 증가된 양의 황 함유 화합물을 생산하는지 여부를 시험한다. 미생물이 이와 같이 생산하는 경우, 이로써 이것이 비기능적 돌연변이임이 입증되는 것이다.
그 다음, 이 방식으로 결정된 비기능적 돌연변이를, 벡터에 위치하고 미생물에서 기능적인 프로모터 및 종결제 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열에 도입시킬 수 있다. 상기 벡터를 미생물에 전달한 후, 비기능적 돌연변이체를 과발현시킬 수 있고, 이들은 내인성 야생형 서열 또는 단백질의 그들의 세포 결합 파트너와의 상호작용과 경쟁한다.
이러한 방법은 예를 들면,
a) 하기 핵산 서열을 5'→3' 배향으로 포함하는 벡터를 생성하는 단계:
- 미생물에서 기능적인 프로모터 서열,
- 이에 작동가능하게 연결된, NCgl2640의 우성 음성 돌연변이체 또는 그의 동족체를 코딩하는 DNA 서열,
- 이에 작동가능하게 연결된, 미생물에서 기능적인 종결 서열, 및
b) a)로부터의 벡터를 미생물에 전달하고, 임의적으로, 벡터를 미생물의 게놈에 통합시키는 단계를 포함할 수 있다.
점 돌연변이(들), 삽입돌연변이(들) 또는 삭제 돌연변이(들)를 NP_601931 또는 그의 동족체를 코딩하는 핵산 서열에 어떻게 도입시키는지는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 점 돌연변이를 도입시키는 데 PCR 기술이 바람직할 수 있다(문헌["PCR technology: Principle and Applications for DNA Amlication", H. Ehrlich, id, Stockton Press] 참조). 또한, 점 돌연변이를 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산에 도입시키는 예는 하기 실시예에서도 찾을 수 있다.
본 발명에 따르면, 또한, 본 발명의 미생물은, 예를 들면, 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산에 의해 코딩되는 단백질과 다른 세포 결합 파트너와의 상호작용과 특이적으로 경쟁하는 재조합 항체가 미생물에서 발현되도록 생산될 수 있다.
NP_601931 또는 그의 동족체에 대한 이러한 재조합 항체를 단리시키고 동정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 문헌으로부터 취할 수 있다(문헌[Harlowet al., 1999, Using antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press] 참조).
본 발명에 따르면, 재조합 항체는 예를 들면, 문헌[Skerra et al. (Curr. Opin. Immunol. (1993) 2, 250-262)]에 기재된 바와 같이 재조합 항체의 상이한 공지된 형태를 나타내는 것으로 이해된다. 여기서, 본 발명의 재조합 항체는 이황화 가교, 뿐만 아니라 소위 VH 쇄에 의해 연결된 소위 Fab 단편, Fv 단편, scFv 항체, scFv 동종이량체(homodimer)를 포함한다. Fab 단편은 조립된 완전 경쇄 및 절단된 중쇄로 이루어지는 반면, Fv 단편은 비공유적으로 연결된 VH 및 VL 쇄로 이루어진다. 앞서 언급한 단편 및 재조합 항체의 조사는 문헌[Conrad et al. (Plant Mol. Biol. (1998) 38, 101-109)]에서 찾을 수 있다. 앞서 언급한 Fab 및 Fv 단편은 생체내에서 서로 회합할 수 있다.
이 공정은 그다지 효율적으로 운전되지 않을 수 있기 때문에, 본 발명에 scFv 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 이 항체는 가요성 링커 펩티드를 통해 융합된 경쇄로 된 가변성 부분 및 중쇄로 된 가변성 부분으로 이루어진다. 이러한 scFv 항체의 생산은 선행 기술에 집중적으로 기재되었다(특히, 콘라드(Conrad) 등의 문헌, 상기 참조; 문헌[Breitling et al. (1999) Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, New York] 참조). scFv 항체는 정상 항체와 동일한 항원 특이성 및 활성을 갖지만, 다른 천연 또는 재조합 항체와 같이 개개의 쇄로부터 생체내 조립될 필요는 없다. 따라서, 이들은 본 발명에 따른 방법에 특히 적합하다.
앞서 언급된 문헌에는, 어떻게 당업자에 의해 본 발명에 바람직한 scFv 항체를 코딩하는 핵산 서열이 단리되고 생성될 수 있는지 상세히 설명되어 있다.
통상적으로, 여기서, 존재하는 하이브리도마 세포주가 단일클론 항체를 생산한다고 가정한다. 뒤이어, 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA를 단리시키고, 제2 단계에서, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역에 대한 코딩 영역을 함께 융합시켜 한 분자를 형성한다.
당업자에게 공지된 재조합 항체를 생성하는 추가 방법은 재조합 항체의 라이브러리의 스크리닝이다(소위 파지 표시 라이브러리, 또한, 문헌[Hoogenboom et al. (2000) Immunology Today 21, 371-378; Winter et al. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455; De Wildt et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18, 989-994] 참조). 이 방법에서, 당업자에게 공지된 절차에 의해 정해진 항원에 대해 특이적인 재조합 항체를 풍부하게 하고 선택하고 단리시키는 것이 가능하다.
서열 번호 2의 서열을 갖는 단백질과 동일하거나 상동성을 갖는 단백질에 대한 항체를 발현시키는 방법은 예를 들면,
a) 하기 핵산 서열을 5'→3' 배향으로 포함하는 벡터를 생성하는 단계:
- 미생물에서 기능적인 프로모터 서열,
- 이에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 2의 서열을 갖는 단백질과 동일하거나 상동성을 갖는 단백질에 특이적인 재조합 항체를 코딩하는 DNA 서열,
- 이에 작동가능하게 연결된, 미생물에서 기능적인 종결 서열; 및
b) a)로부터의 벡터를 미생물에 전달하고, 임의적으로, 벡터를 미생물의 게놈에 통합시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 범위 내에서, 서열 번호 1에 나타낸 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산 또는 이러한 서열에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이 야생형에 비해 감소되는 것으로 언급되는 경우, 핵산의 기능적 발현이 감소되고, 바람직하게는 완전히 억제된다고 언급함으로써 동일한 환경이 또한 기술된다.
본 발명의 범위 내에서, 용어 황 함유 화합물 또는 미세 화학물질은 하나 이상의 공유 결합된 황 원자를 함유하고 본 발명에 따른 발효 방법을 통해 이용가능한 임의의 화학적 화합물을 포함한다.
본 발명에 따르면, 황 함유 화합물은 특히 L-메티오닌, L-시스테인, L-호모시스테인, L-시스타티오닌, S-아데노실-L-메티오닌, 글루타티온, 바이오틴, 티아민, 및/또는 리포산, 바람직하게는 L-메티오닌 및/또는 L-시스테인을 포함한다.
본 발명에 따르면, 미생물은 악티노박테리아(Actinobacteria), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 클로로플렉서스 오란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus), 피렐룰라종(Pirellula sp .) 1, 할로박테리아(Halobacteria) 및/또는 메타노코치(Methanococci), 바람직하게는 코리네박테리아(Corynebacteria), 미코박테리아(Mycobacteria), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 살모넬라(Salmonellae), 대장균, 시겔라(Shigella) 및/또는 수도모나스(Pseudomonas)가 바람직하다. 코리네박테리움 글루타미쿰, 대장균, 바실러스속의 미생물, 특히 바실러스 서브틸리스 및 스트렙토마이세스속의 미생물로부터 선택된 미생물이 특히 바람직하다.
용어 대사산물은 유기체의 대사에서 중간체로서 또는 또한, 최종 생성물로서 존재하고, 화학 성분으로서의 능력 외에, 효소 및 그들의 촉매 활성을 조절하는 효과를 가질 수 있는 화학적 화합물을 나타낸다. 여기서, 이러한 대사산물이 효소의 활성의 억제 효과 및 자극 효과 양쪽 모두를 가질 수 있다는 점이 문헌으로부터 공지되어 있다(문헌[Stryer, Biochemistry, (1995) W.H. Freeman & Company, New York, New York, USA] 참조). 또한, UV 방사선, 이온화 방사선 또는 돌연변이생성 물질에 의해 게놈 DNA를 돌연변이시킨 데 이어, 특이적 표현형을 선택하는 것과 같은 수단에 의해, 유기체에서 대사성 대사산물에 의한 영향이 변화된 효소를 생산하는 것이 가능하다는 점도 문헌에 기재되어 있다(문헌[Sahm et al. (2000), Biological Chemistry 381(9-10): 899-910] 참조). 또한, 상기 변형된 성질도 특이적인 수단에 의해 얻을 수 있다. 여기서, 또한, 당업자는 발현된 DNA 서열로부터 발생하는 단백질이 예를 들면, 대사성 대사산물의 조절 효과가 변화되지 않은 단백질에 비해 변화된 것과 같은 특이적 신규한 성질을 갖도록 효소에 대해 유전자에서 단백질을 코딩하는 DNA의 특이적 뉴클레오티드를 특이적으로 변화시키는 것에도 친숙하다.
서열 번호 1에 나타낸 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산 또는 이 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이 야생형에 비해 감소된 코리네형(coryneform) 세균이 본 발명에 따른 미생물로 특히 적합하다.
이 미생물은 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프룩토오스, 말토오스, 당밀, 전분, 셀룰로오스, 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 황 함유 미세 화학물질, 특히 L-메티오닌을 생산할 수 있다. 코리네박테리움속으로부터, 특히 L-아미노산을 생산할 수 있는 것으로 공지된 코리네박테리움 글루타미쿰 종이 적합하다.
코리네형 세균의 적합한 균주의 예로는 다음의 속이 있다: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium Aceto글루타미쿰) ATCC 15806, 코리네박테리움 아세토에시도필룸(Corynebacterium Acetoacidophilum) ATCC 13870, 코리네박테리움 써모아미노겐스(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539 및 코리네박테리움 멜라쎄콜라(Corynebacterium melassecola) ATCC 17965와 같은 코리네박테리움, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(C. 글루타미쿰) 종, 또는 브레비박테리움 플라범(Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘텀(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869, 및 브레비박테리움 디바리카텀(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020과 같은 브레비박테리움속, 또는 원하는 미세 화학물질 또는 그의 전구체(들)도 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10065 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21608과 같은 이로부터 유래한 균주.
약어 KFCC는 Korean Federation of Culture Collection을 나타내고, 약어 ATCC는 American Type Strain Culture Collection을 나타낸다.
본 발명에 따른 추가의 실시양태는 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산 또는 이러한 서열에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이 감소되는 것 외에, 서열 번호 3의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 상동성을 갖는 핵산 또는 이러한 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이 야생형에 비해 감소된 미생물에 관한 것이다.
서열 번호 3의 서열을 갖는 핵산은 C. 글루타미쿰으로부터 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질 McbR을 코딩하는 핵산이다. 이 단백질은 C. 글루타미쿰에서 황 함유 화합물, 특히 메티오닌의 생합성 경로의 유전자에 대한 전사 억제제로 나타날 수 있다(레이 등, 상기 참조).
서열 번호 1 및 3의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 함량 및/또는 활성을 동시에 감소시킴으로써, 황 함유 화합물을 생산하는 데 특히 적합한 미생물이 제공된다. 상기 황 함유 화합물은 메티오닌 및 시스테인이 특히 바람직한 앞서 언급한 화합물일 수 있다. 또한, 미생물은 앞서 언급한 유기체일 수 있으며, 여기서 C. 글루타미쿰 및 대장균이 바람직하다.
서열 번호 3에 나타낸 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산 또는 이 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성을 감소시키기 위해, 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산 또는 이러한 핵산에 의해 코딩되는 단백질과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산에 대해 상기한 것과 동일한 방법 및 절차를 사용할 수 있다. 여기서, 상동성, 상보성, 기능적 형태, 우성 음성 돌연변이체 등과 같은 용어는 동일한 방식으로 이해된다.
본 발명에 따른 미생물의 추가의 실시양태는 서열 번호 1에 나타낸 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산 또는 이 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 함량이 야생형에 비해 감소된 것 외에, 원하는 황 함유 화합물의 생합성 경로의 유전자를 코딩하는 하나 이상의 추가의 핵산의 함량 및/또는 활성이 야생형에 비해 감소된 미생물에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 추가의 핵산은 다음을 포함하는 군 I으로부터 선택된다:
- 호모세린 키나아제를 코딩하는 유전자 thrB(EP 1 108 790; DNA 서열 번호 3453),
- 트레오닌 디히드라타제를 코딩하는 유전자 ilvA(EP 1 108 790; DNA 서열 번호 2328),
- 트레오닌 신타아제를 코딩하는 유전자 thrC(EP 1 108 790; DNA 서열 번호 3486),
- 메조-디아미노피멜레이트-D-데히드로게나아제를 코딩하는 유전자 ddh(EP 1 108 790; DNA 서열 번호 3494),
- 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자 pck(EP 1 108 790; DNA 서열 번호 3157),
- 글루코오스-6-포스페이트-6-이소머라제를 코딩하는 유전자 pgi(EP 1 108 790; DNA 서열 번호 950),
- 피루베이트 옥시다아제를 코딩하는 유전자 poxB(EP 1 108 790; DNA 서열 번호 2873),
- 디히드로디피콜리네이트 신타아제를 코딩하는 유전자 dapA(EP 1 108 790; DNA 서열 번호 3476),
- 디히드로디피콜리네이트 리덕타아제를 코딩하는 유전자 dapB(EP 1 108 790; DNA 서열 번호 3477),
- 디아미노피콜리네이트 데카르복실라제를 코딩하는 유전자 lysA(EP 1 108 790 A2; DNA 서열 번호 3451),
- 글리코실 트란스퍼라제(진뱅크 등록 번호 NP_600345)를 코딩하는 유전자(진뱅크 등록 번호 NCgl1072), 및
- 락테이트 데히드로게나아제(진뱅크 등록 번호 NP_602107)를 코딩하는 유전자(진뱅크 등록 번호 NCgl2817).
또한, 물론, 본 발명에 따른 이러한 미생물은 서열 번호 3의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 함량 및/또는 활성 또는 이 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성도 야생형에 비해 감소될 수 있다.
여기서, 군 I에 언급된 핵산 서열 또는 이러한 서열에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성의 감소는 예를 들면, 서열 번호 1 내지 4에 대해 상기한 것과 동일한 방식으로 수행될 수 있다. 여기서, 상동성, 우성 음성 돌연변이체 등과 같은 용어는 앞서 정의한 것과 동일한 것으로 이해된다.
본 명세서에 언급된 본 발명의 실시양태 모두는 앞서 언급한 황 함유 화합물을 생산하는 데 사용될 수 있는 미생물에 관한 것이다. 여기서, 메티오닌 및/또는 시스테인을 생산하는 데 사용될 수 있는 미생물이 특히 바람직하며, 여기서 이 미생물은 앞서 언급한 미생물일 수 있고, C. 글루타미쿰 및 대장균이 바람직하다. 여기서, 앞서 언급한 핵산의 함량 및/또는 활성을 감소시키기 위해 앞서 언급한 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 추가의 실시양태는 생산될 황 함유 화합물의 생합성 경로의 유전자 생성물을 코딩하는 핵산의 함량 및/또는 활성이 야생형에 비해 추가로 증가된 앞서 언급한 미생물에 관한 것이다. 여기서, 특히 황 동화, 메티오닌 대사, 트레할로스 대사, 피루베이트 대사, 시스테인 대사, 아스파테이트 세미알데히드 합성, 해당작용, 아나플러로시스(anaplerosis), 펜토즈 포스페이트 대사, 시트르산 사이클 또는 아미노산 수출의 생합성 경로를 대사 경로로 간주할 수 있다.
이 측면에서, 본 발명의 추가의 실시양태는 다음을 포함하는 군 II로부터 선택된 핵산 또는 이 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이 증가된 미생물에 관한 것이다:
- 아스파테이트 키나아제를 코딩하는 유전자 lysC(EP 1 108 790 A2; DNA 서열 번호 281),
- 아스파테이트 세미알데히드 데히드로게나아제를 코딩하는 유전자 asd(EP 1 108 790 A2; DNA 서열 번호 282),
- 글리세린알데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제를 코딩하는 유전자 gap(문헌[Eikmanns (1992) Journal of Bacteriology 174: 6076-6086] 참조),
- 3-포스포글리세레이트 키나아제를 코딩하는 유전자 pgk(문헌[Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086] 참조),
- 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 유전자 pyc(문헌[Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086] 참조),
- 트리오세포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자 tpi(문헌[Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086] 참조),
- 호모세린 O-아세틸트란스퍼라제를 코딩하는 유전자 metA(EP 1 108 790; DNA 서열 번호 725),
- 시스타티오닌 감마-신타아제를 코딩하는 유전자 metB(EP 1 108 790; DNA 서열 번호 3491),
- 시스타티오닌 감마-리아제를 코딩하는 유전자 metC(EP 1 108 790; DNA 서열 번호 3061),
- 세린 히드록시메틸 트란스퍼라제를 코딩하는 유전자 glyA(EP 1 108 790; DNA 서열 번호 1110),
- O-아세틸호모세린 술프히드릴라아제를 코딩하는 유전자 metY(EP 1 108 790; DNA 서열 번호 726),
- 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타아제를 코딩하는 유전자 metF(EP 1 108 790; DNA 서열 번호 2379),
- 포스포세린 아미노트란스퍼라제를 코딩하는 유전자 serC(EP 1 108 790; DNA 서열 번호 928),
- 포스포세린 포스파타제를 코딩하는 유전자 serB(EP 1 108 790; DNA 서열 번호 334, DNA 서열 번호 467, DNA 서열 번호 2767),
- 세린 아세틸 트란스퍼라제를 코딩하는 유전자 cysE(EP 1 108 790; DNA 서열 번호 2818),
- 호모세린 데히드로게나아제를 코딩하는 유전자 hom(EP 1 108 790; DNA 서열 번호 1306), 및
- 메티오닌 신타아제를 코딩하는 유전자 metH(EP 1 108 790; DNA 서열 번호 1663),
- 메티오닌 신타아제(진뱅크 등록 번호 NP_600367)를 코딩하는 유전자 metE(진뱅크 등록 번호 NCgl1094),
- 시스테인 신타아제(진뱅크 등록 번호 NP_601760)를 코딩하는 유전자(진뱅크 등록 번호 NCgl2473),
- 시스테인 신타아제(진뱅크 등록 번호 NP_601337)를 코딩하는 유전자(진뱅크 등록 번호 NCgl2055),
- 술피트 리덕타아제(진뱅크 등록 번호 NP_602008)를 코딩하는 유전자(진뱅크 등록 번호 NCgl2718),
포스포아데노신 포스포술페이트 리덕타아제(진뱅크 등록 번호 NP_602007)를 코딩하는 유전자 cysH(진뱅크 등록 번호 NCgl2717),
- 술페이트 아데닐일트란스퍼라제 서브유닛 1(진뱅크 등록 번호 NP_602005)을 코딩하는 유전자(진뱅크 등록 번호 NCgl2715),
- CysN-술페이트 아데닐일트란스퍼라제 서브유닛 2(진뱅크 등록 번호 NP_602006)를 코딩하는 유전자(진뱅크 등록 번호 NCgl2716),
- 페레독신(ferredoxin) NADP 리덕타아제(진뱅크 등록 번호 NP_602009)를 코딩하는 유전자(진뱅크 등록 번호 NCgl2719),
- 페레독신(진뱅크 등록 번호NP_602010)을 코딩하는 유전자(진뱅크 등록 번호 NCgl2720),
- 글루코오스-6-포스페이트데히드로게나아제(진뱅크 등록 번호 NP_600790)를 코딩하는 유전자(진뱅크 등록 번호 NCgl1514), 및
- 프룩토오스-1,6-비스포스파타제(진뱅크 등록 번호-NP_601294)를 코딩하는 유전자(진뱅크 등록 번호 NCgl2014).
바람직하게는, 본 발명에 따른 미생물에서 수행되는 군 II의 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성의 증가는 5％ 이상, 바람직하게는 20％ 이상, 또한 바람직하게는 50％ 이상, 특히 바람직하게는 100％ 이상, 또한 특히 바람직하게는 5배 이상이며, 특히 바람직하게는 10배 이상, 또한 특히 바람직하게는 50배 이상, 더욱 바람직하게는 100배 이상, 가장 바람직하게는 1000배 증가된다.
군 II의 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성의 증가는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 바람직하게는, 이는 이 핵산 서열을 미생물에서 기능적인 프로모터, 미생물에서 기능적인 리보좀 결합 부위 및 미생물에서 기능적인 종결제를 추가로 함유하는 벡터에 DNA 서열 형태로 도입시킴으로써 달성된다. 그 다음, 이 벡터를 미생물에 전달하고, 선택된 벡터에 따라, 미생물과 함께 염색체외로 복제하거나 미생물의 게놈에 통합시킨다. 여기서, 특이적 핵산 또는 이에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성을 감소시키는 것으로 앞서 기재한 실질적으로 동일한 벡터 또는 플라스미드를 사용할 수 있다. 이를 사용되는 선택적 마커에 사용할 수 있다.
또한, 군 II의 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성의 증가도 미생물에서 상기 핵산의 유사체 또는 동족체 또는 기능적 등가물을 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 용어 상동성, 상보성 등은 상기한 바와 같다.
본 발명의 범위 내에서, 명시적으로 개시된 폴리펩티드의 기능적 등가물 또는 유사체는 예를 들면, 기질 특이성과 같은 원하는 생물학적 활성을 추가로 보유하는 상기 폴리펩티드와는 상이한 폴리펩티드이다.
본 발명에 따르면, 기능적 등가물은 특히, 서열 위치 중 하나 이상에서 앞서 명시적으로 언급한 아미노산 이외의 아미노산을 갖지만, 여전히 앞서 언급한 생물학적 활성을 나타내는 돌연변이체를 나타내는 것으로 이해된다. 따라서, 기능적 등가물은 하나 이상의 아미노산 첨가(들), 치환(들), 삭제(들) 및/또는 역위(들)에 의해 얻을 수 있는 돌연변이체를 포함하며, 이러한 변화들은 임의의 서열 위치에서 일어날 수 있으며, 단 앞서 언급한 성질 프로파일을 갖는 돌연변이체를 제공한다. 또한, 특히, 돌연변이체와 변화되지 않은 폴리펩티드 간의 반응성 패턴이 질적으로 매칭되는 경우, 즉 예를 들면, 동일한 기질이 상이한 속도로 전환되는 경우 기능적 등가성이 제공된다.
물론, 기능적 등가물은 천연 발생 변이체와 같이 다른 유기체로부터 이용가능한 폴리펩티드도 포함한다. 상동 서열 영역으로 된 구역은 예를 들면, 서열 비교에 의해 결정될 수 있고, 등가의 효소는 본 발명의 명세서에 따라 결정될 수 있다.
또한, 기능적 등가물은 단편, 바람직하게는 예를 들면, 원하는 생물학적 기능을 갖는 본 발명의 폴리펩티드의 개개의 도메인 또는 서열 모티프를 포함한다.
또한, 기능적 등가물은 앞서 언급한 폴리펩티드 서열 또는 이로부터 유도된 등가물 중 하나, 및 기능적 N- 또는 C-말단 연결에서(즉, 융합 단백질 요소 기능의 실질적인 상호 장애 없이) 이와 기능적으로 상이한 하나 이상의 추가의 이질 서열을 갖는 융합 단백질이다. 이러한 이질 서열의 예로는 신호 펩티드, 효소, 면역글로불린, 표면 항원, 수용체 또는 수용체 리간드가 있다.
본 발명에 따른 기능적 등가물로는 앞서 명시적으로 개시된 단백질의 동족체가 있다. 이들은 상기 명시적으로 개시된 서열 중 하나와 30％ 이상 또는 약 40％, 50％ 이상, 바람직하게는 약 60％, 65％, 70％ 또는 75％ 이상, 특히 예를 들면, 90％, 95％ 또는 99％와 같이 85％ 이상 상동성을 갖는다.
본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드의 동족체는 돌연변이생성, 예를 들면 점 돌연변이 또는 단백질의 절단을 통해 생성될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 동족체는 단백질 활성의 작동제 또는 길항제로 기능하는 단백질의 변이체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 단백질의 동족체는 예를 들면, 절단 돌연변이체와 같은 돌연변이체의 조합 뱅크(combinatorial bank)의 스크리닝에 의해 동정될 수 있다. 예를 들면, 다양한 뱅크의 단백질 변이체를, 핵산 수준에서의 조합 돌연변이생성에 의해, 예를 들면 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물의 효소적 결찰에 의해 생성할 수 있다. 축퇴 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재 동족체의 뱅크를 생성하는 데 사용할 수 있는 다수의 방법들이 존재한다. 축퇴 유전자 서열의 화학적 합성은 DNA 합성기에서 수행될 수 있고, 그 다음, 합성 유전자를 적합한 발현 벡터에 결찰시킬 수 있다. 유전자 축퇴 집합의 사용은 원하는 잠재 단백질 서열로 된 집합을 코딩하는 혼합물 중의 모든 서열을 제공할 수 있게 한다. 축퇴 올리고뉴클레오티드의 합성 방법은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Narang al. (1983) Tetrahedron 39, 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53, 323; Itakura et al., (1984) Science 198, 1056; Ike et al. (1983) Necleic Acids Res. 11, 477] 참조). 또한, 스크리닝에 이어 본 발명에 따른 단백질의 동족체를 선택하기 위한 다양한 집단의 단백질 단편을 생성하기 위해 단백질 코돈 단편의 뱅크를 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 코딩 서열 단편의 뱅크는, 니킹(nicking)이 오직 한 분자당 약 한번 일어나는 조건 하에서 코딩 서열의 이중 가닥 PCR 단편을 뉴클레아제로 처리하고, 이중 가닥 DNA를 변성시키고, DNA를 재생(renaturing)시켜, 상이한 니킹된 생성물로 된 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이중 가닥 DNA를 형성하고, S1 뉴클레아제로 처리함으로써 새로이 형성된 이중체로부터 단일 가닥 부분을 제거하고, 생성되는 단편 뱅크를 발현 벡터에 결찰시킴으로써 생성될 수 있다. 상기 방법에 의해, 상이한 크기로 된 본 발명에 따른 단백질에서 N-말단, C-말단 및 내부 단편을 코딩하는 발현 뱅크가 유도될 수 있다.
선행 기술에서, 점 돌연변이 또는 절단에 의해 생성된 유전자 생성물의 조합 뱅크의 스크리닝 및 선택된 성질을 갖는 유전자 생성물에 대한 cDNA 뱅크의 스크리닝에 대한 몇몇 기술이 공지되어 있다. 이러한 기술은 본 발명에 따른 동족체의 조합 돌연변이생성에 의해 생성된 유전자 뱅크의 신속한 스크리닝에 적합될 수 있다. 고 처리량 분석을 하게 될 대형 유전자 뱅크를 스크리닝하는 데 가장 흔히 사용되는 기술은 복제가능한 발현 벡터로 유전자 뱅크를 클로닝하고, 생성되는 벡터 뱅크를 사용하여 적합한 세포를 형질전환시키고, 원하는 활성의 검출 및 생성물이 검출된 유전자를 코딩하는 벡터의 단리가 간소화된 조건 하에서 조합 유전자를 발현시키는 것을 포함한다. 뱅크에서 기능적 돌연변이체의 발생을 증가시키는 기술인 회귀적 앙상블 돌연변이생성(recursive ensemble mutagenesis; REM)을 동족체를 동정하는 스크리닝 시험과 함께 사용할 수 있다(문헌[Arkin et al. (1992) PNAS 89, 7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3), 327-331] 참조).
앞서 언급한 군 II의 유기체로부터 예를 들면, 효소 메티오닌 신타아제(EC 2.1.1.13)를 코딩하는 metH 유전자를 실제 공지된 바와 같이 단리시킬 수 있다.
metH 유전자 또는 또한, 유기체의 다른 유전자를 앞서 언급한 군 II로부터 단리시키기 위해, 상기 유기체의 유전자 뱅크를 먼저 대장균에서 정립시킨다. 유전자 뱅크의 정립은 일반적으로 공지된 문헌 및 편람에 상세히 기재되어 있다. 예로서, 윈나커(Winnacker)에 의한 문헌["Gene und Klone, Eine Einfuhrung indie Gentechnologie"(Verlag Chemie, Weiiilieim, Germany, 1990)], 또는 샘브룩 등에 의한 편람(상기 참조)에 언급되어 있다. 공지된 유전자 뱅크로는 코하라(Kohara) 등(문헌[1987, Cell 50, 495-508] 참조)에 의해 λ-벡터에서 정립된 대장균 K-12 균주 W3110의 경우가 있다.
효소, 예를 들면, 대장균에서 군 II의 유전자 뱅크를 생성하기 위해, 코스미드(cosmid) 벡터 슈퍼코스(SuperCos) I(문헌[Wahl et al., (1987) PNAS, 84, 2160-2164] 참조)와 같은 코스미드, 뿐만 아니라 pBR322(문헌[BoliVal et al. (1979) Life Sciences, 25, 807-818(1979)] 참조) 또는 pUC9(문헌[Vieira et al(1982), Gene, 19, 259-268] 참조)와 같은 플라스미드를 사용할 수 있다. 제한 및 재조합 면에서 결여된 대장균 균주가 숙주로서 특히 적합하다. 이에 대한 예로는 문헌[Grant et al. (1990) PNAS, 87, 4645-4649에 기재된 균주 DH5αmer가 있다. 그 후, 코스미드의 보조로 클로닝된 긴 DNA 단편을 또다시 시퀀싱에 적합한 통상적인 벡터에 서브클로닝(subcloning)한 다음, 예를 들면, 문헌[Sanger et al. (1977, PNAS, 74, 5463-5467)]에 기재된 바와 같이 시퀀싱할 수 있다.
그 다음, 얻어진 DNA 서열을 예를 들면, 문헌[Staden(1986, Necleic Acids Research 14, 217-232)]에 의한 것, 문헌[Marck(1988, Nucleic Acids Research 16, 1829-1836] 참조)에 의한 것 또는 문헌[Butler(Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97)]에 의한 GCG 프로그램과 같은 공지된 알고리즘 또는 서열 분석 프로그램에 의해 조사할 수 있다.
당업자는 특히, 편람["The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" by Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993)] 및 문헌[Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology, 41, 255-260)]에서 혼성화에 의해 DNA 서열을 동정하는 지침을 찾을 수 있다. 당업자는 특히, 편람[Gait: Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984)] 및 [Newton and Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994)]에서 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 보조로 DNA 서열을 증폭하는 것에 대한 지침을 찾을 수 있다.
단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에서의 변화가 실질적으로 장애를 유발하지 않고 심지어 그의 기능을 안정화시킬 수 있다는 점도 공지되어 있다. 당업자는 이에 대한 정보를 특히, 문헌[Ben-Bassat et al. (1987, Journal of Bacteriology 169,751-757)], 문헌[O'Regan et al. (1989, Gene 77, 237-251)], 문헌[Sahin-Toth et al. (1994, Protein Sciences 3, 240-247)], 문헌[Hochuli et al. (1988, Biotechnology 6, 1321-1325)] 및 공지된 유전학 및 분자 생물학 교본에서 찾을 수 있다.
코리네형 세균에서 복제되는 플라스미드는 핵산 또는 이에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성을 증가 또는 감소시키는 앞서 언급한 모든 방법에 플라스미드로서 적합하다. 예를 들면, pZl(문헌[Menkel et al. (1989, Applied and Environmental Microbiology 64, 549-554)] 참조), pEKExl(문헌[Eikmanns et al., (1991, Gene, 102, 93-98)] 참조), 또는 pHS2-1(문헌[Sonnen et al. (1991, Gene, 107, 69-74)] 참조)와 같은 다수의 공지된 플라스미드 벡터는 크립틱(cryptic) 플라스미드 pHM1519, PBL1 또는 pGA1를 기재로 한다. 예를 들면, pCLiKSMCS, 또는 pCG4(US-A 4,489,160) 또는 pNG2(문헌[Serwold-David et al. (1990) FEMS Microbiology Letters 66, 119-124] 참조) 또는 pAG1(US-A 5,158,891) 기재의 이러한 플라스미드 벡터와 같은 다른 플라스미드 벡터를 동일한 방식으로 사용할 수 있다.
또한, 이러한 플라스미드 벡터의 보조로 hom-thrB 오페론을 복제하거나 증폭시키는 데 예를 들면, 문헌[Reinscheid et al. (1994, Applied and Environmental Microbiology, 60, 126-132)]에 기재된 바와 같이 염색체로 통합시킴으로써 유전자를 증폭하는 방법을 사용할 수 있는 플라스미드 벡터도 적합하다. 이 방법에서, 전체 유전자를 C. 글루타미쿰에서가 아닌 숙주(전형적으로, 대장균)에서 복제할 수 있는 플라스미드 벡터로 클로닝한다. 예를 들면, PSUP301(문헌[Sirnon et al. (1983), Biotechnology 1, 784-791] 참조), PK18mob 또는 pK19mob(문헌[Schaefer et al., Gene 145, 69-73] 참조), (문헌[Bernard et al. (1993, Journal of Molecular Biology, 234, 534-541)] 참조), PEM1(문헌[Schrumpf et al(1991), Journal of Bacteriology 173, 4510-4516] 참조), 또는 pBGS8(문헌[Spratt et al. (1986), Gene 41, 337-342] 참조)가 벡터로 고려될 수 있다. 뒤이어, 증폭될 유전자를 함유하는 플라스미드 벡터를 형질전환에 의해 C. 글루타미쿰으로 된 원하는 균주로 전달한다. 형질전환 방법은 예를 들면, 문헌[Thierbach et al(1988, Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362)), Dunican et al (1989, Biotechnology 7, 1067-1070) and Tauch et al. (1994, FEMS Microbiological Letters 123, 343-347)]에 기재되어 있다.
발현을 위해, 재조합 핵산 구조체 또는 유전자 구조체를 적합한 숙주 유기체, 바람직하게는 숙주에서 유전자의 최적 발현을 가능케 하는 숙주 특이적 벡터에 삽입시킨다. 벡터는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌["Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., Ed., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)]으로부터 취할 수 있다. 플라스미드 외에, 예를 들면, 파지, 트란스포존(transposon), IS 요소, 파스미드(phasmid), 코스미드, 및 선형 또는 환형 DNA와 같이 당업자에게 공지된 기타의 벡터도 벡터로 이해된다. 숙주 유기체에서, 상기 벡터는 자율적으로 또는 염색체로 복제될 수 있다.
예를 들면, 클로로암피실린, 카나마이신, 젠타마이신, G418, 블레오마이신, 히그로마이신(hygromycin) 등과 같은 다양한 항생제가 선택적 마커로서 적합하다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 이들은, 단백질의 함량 및/또는 활성이 야생형에 비해 감소된, 단백질을 코딩하는 핵산이 상동 재조합에 의해 미생물의 게놈으로부터 제거되거나 또는 이러한 핵산 서열이 더이상 기능적으로 발현되지 않도록 상동 재조합에 의해 변화된 미생물이다.
따라서, 본 발명에 따른 바람직한 미생물은 상동 재조합에 의해, 서열 번호 1, 서열 번호 3의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 게놈 핵산 및 군 I에 언급된 서열에 대해 불활성화되어, 앞서 언급한 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 기능적 발현은 더 이상 발생하지 않는다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 이들은 군 II의 핵산 또는 이의 기능적 등가물과 동일하거나 상동성을 갖는 핵산을 추가로 과발현시키는 미생물이다.
과발현을 수행하기 위해, 당업자는 다양한 수단들을, 개개로 또는 조합하여 취할 수 있다. 따라서, 대응하는 유전자의 카피 수를 증가시킬 수 있거나 또는 프로모터 및 구조 유전자의 상류에 위치한 리보좀 결합 부위 또는 조절제 영역을 돌연변이화할 수 있다. 구조 유전자의 상류에 삽입된 발현 카세트는 동일한 방식으로 기능한다. L-메티오닌의 발효적 생산 과정 동안 유도성 프로모터의 보조로 발현을 추가로 향상시키는 것이 가능하다. 또한, mRNA의 수명을 연장시키는 수단에 의해서도 발현이 개선된다. 또한, 효소 활성은 효소의 분해를 방지함으로써 강화된다. 유전자 또는 유전자 구조체는 다양한 카피 수를 갖는 플라스미드에 존재할 수 있거나 염색체 내에 통합되고 증폭될 수 있다. 별법으로, 또한 배지 조성 및 배양 절차를 변화시킴으로써 관련된 유전자의 과발현을 수행할 수도 있다.
특히, 당업자는 문헌[Martin et al. (1987, Biotechnology 5, 137-146)], 문헌[Guerrero et al. (1994, Gene 138, 35-41)], 문헌[Tsuchiya et al. (1988, Biotechnology, 6, 428-430)], 문헌[Eikmanns et al. (1991, Gene, 102, 93-98)], EP 0 472 869, US 4,601,893, 문헌[Schwarzer et al. (1991, Biotechnology 9, 84-87)], 문헌[Remscheid et al. (1994, Applied and Environmental Microbiology, 60, 126-132)], 문헌[LaBarre et al. (1993, Journal of Bacteriology 175, 1001-1007)], WO 96/15246, 문헌[Malumbres et al. (1993, Gene 134, 15-24)], JP-A-10-229891, 문헌[Jensen et al. (1998, Biotechnology and Bioengineering, 58, 191-195)], 문헌[Makrides (1996, Microbiological Reviews, 60, 512-538)], 뿐만 아니라 공지된 유전학 및 분자 생물학 교본에 기재된 지침을 찾을 수 있다.
본 발명의 범위 내에서 사용되는 방법에 적합한 프로모터의 예는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 프로모터 groES, sod, eftu, ddh, amy, lysC, dapA, lysA, 뿐만 아니라 문헌[Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Sonenshein, Abraham L., Hoch, James A., Losick, Richard; ASM Press, District of Columbia, Washington and Patek M., Eikmanns B. J., Patek J., Sahm H., Microbiology 1996, 142 1297-1309]에 기재된 것과 같은 그람 양성 프로모터 SPO2, 뿐만 아니라 그람 음성 세균에서 유리하게 사용되는 cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, l-PR- 또는 l-PL-프로모터를 포함한다. 예를 들면, PrPl-프로모터와 같은 빛-유도성 프로모터, 특히, 온도-유도성 프로모터와 같은 유도성 프로모터를 사용하는 것도 바람직하다. 대체로, 조절 서열을 갖는 모든 천연 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 합성 프로모터도 유리하게 사용할 수 있다. 프로모터에 대한 추가 예는 문헌[Patek M. et al., J. Biotechnol. 2003, 104, 311-323]에 기재되어 있다.
앞서 언급한 조절 서열은 핵산 서열의 특이적인 발현, 바람직한 경우, 단백질의 발현을 가능하게 한다. 예를 들면, 이는 숙주 유기체에 따라, 유전자가 오직 유도 후에만 발현 또는 과발현되거나 또는 동시에 발현 및/또는 과발현되는 것을 의미할 수 있다. 여기서, 조절 서열 또는 인자는 양성적으로 영향을 미쳐 발현을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 따라서, 조절 요소의 향상은 프로모터 및/또는 인헨서와 같은 강한 전사 신호를 사용하여 전사 수준에서 유리하게 수행될 수 있다. 또한, 예를 들면, mRNA의 안정성을 개선시킴으로써 번역을 향상시키는 것도 가능하다.
이를 위해, 예를 들면, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, 1993, John Wiley & Sons, Incorporated, New York, New York, PCR Methods, Gelfand, David H., Innis, Michael A., Sninsky, John J. 1999, Academic Press, Incorporated, California, San Diego, PCR Cloning Protocols, Methods in Molecular Biology Ser., Vol. 192, 2nd ed., Humana Press, New Jersey, Totowa. Sambrook et al., 상기 참조 and in T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)]에 기재된 것들과 같은 통상의 재조합 및 클로닝 기술을 사용한다.
또한, 본 발명은 바람직하게는 앞서 언급한 황 함유 화합물, 특히 메티오닌 및/또는 시스테인인 황 함유 화합물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 본 발명의 미생물을 사용하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 황 함유 화합물이 이러한 미생물의 발효 배양에 의해 세포 또는 세포 배지에 풍부한 것을 특징으로 한다. 여기서, 바람직한 발효 방법을 최적화함으로써 추가의 수율 증가를 달성할 수 있다는 점이 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명에 따른 방법에서, 본 발명에 따라 생산된 미생물을 황 함유 화합물, 특히 L-메티오닌을 생산하는 배치 방법 또는 공급 배치 또는 반복된 공급 배치 방법을 사용하여 연속적으로 또는 불연속적으로 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법의 개요는 문헌[Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, Germany, 1991)) 또는 문헌[Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, Germany, 1994))]에서 찾을 수 있다.
사용되는 배양 배지는 대응하는 균주의 요건을 적합하게 충족시켜야 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지의 기재는 편람["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981)]에 함유되어 있다.
본 발명에 따라 사용가능한 배지는 대개 하나 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기 염, 비타민 및/또는 미량 원소를 포함한다.
바람직한 탄소 공급원은 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 당이다. 특히 적합한 탄소 공급원은 예를 들면, 글루코오스, 프룩토오스, 만노오스, 갈락토오스, 리보오스, 소르보오스(sorbose), 리불로오스(ribulose), 락토오스, 말토오스, 슈크로오스, 라피노오스(raffinose), 전분 또는 셀룰로오스이다. 또한, 당은 당밀 또는 당 정제의 다른 부산물과 같이 복잡한 화합물을 통해 배지에 첨가될 수 있다. 상이한 탄소 공급원으로 된 혼합물을 첨가하는 것이 유리할 수도 있다. 추가의 가능한 탄소 공급원으로는 예를 들면, 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛유와 같은 오일 및 지방, 예를 들면, 팔미트산, 스테아르산 또는 리놀레산과 같은 지방산, 예를 들면, 글리세린, 메탄올 또는 에탄올과 같은 알코올, 및 예를 들면, 아세트산 또는 락트산과 같은 유기산이 있다.
대개, 질소 공급원은 유기 또는 무기 질소 화합물 또는 이러한 화합물을 함유하는 물질이다. 예시적인 질소 공급원은 황산암모니아, 염화암모니아, 인산암모니아, 탄산암모니아 또는 질산암모니아와 같은 암모니아 기체 또는 암모니아 염, 질산화물, 우레아, 아미노산 또는 복잡한 질소 공급원, 예를 들면 "옥수수 침출액(corn steep liquor)", 대두분말(soyflour), 대두 단백질, 효모 추출물, 육류 추출물 등을 포함한다. 질소 공급원은 개개로 또는 혼합물로 사용할 수 있다.
배지에 함유될 수 있는 무기 염 화합물은 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 염화염, 인염 또는 황산염을 포함한다.
예를 들면, 술페이트, 술피트, 디티오나이트, 테트라티오네이트, 티오술페이트 및 술피드와 같은 무기 황 함유 화합물, 뿐만 아니라 머캅탄 및 티올과 같은 유기 황 화합물을 황 함유 미세 화학물질, 특히 메티오닌을 생성하는 데 황 공급원으로 사용할 수 있다.
인산, 이수소인산칼륨 또는 디칼륨수소인산염 또는 대응하는 나트륨 함유 염을 인 공급원으로 사용할 수 있다.
용액 중에 금속 이온을 보유하기 위해 배지에 킬레이트제를 첨가할 수 있다. 특히 적합한 킬레이트제는 카테콜 또는 프로토카테큐에이트(protocatechuate)와 같은 디히드록시페놀 또는 시트르산과 같은 유기산을 포함한다.
대개, 본 발명에 따라 사용되는 발효 배지는 예를 들면, 바이오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토테네이트(pantothenate) 및 피리독신인 비타민 또는 성장 강화제과 같은 다른 성장 인자도 함유한다. 종종 성장 인자 및 염은 효모 추출물, 당밀, "옥수수 침출액" 등과 같은 복잡한 배지 성분으로부터 유도된다. 또한, 적합한 전구체를 배양 배지에 첨가할 수 있다. 배지 화합물의 정확한 조성은 해당 실험에 따라 크게 좌우되고, 각각의 특이적인 경우에 따라 개별적으로 선택된다. 배지 최적화에 대한 정보는 문헌["Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Ed. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) P. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)]으로부터 취할 수 있다. 또한, 성장 배지는 스탠다드(Standard) 1(머크(Merck)) 또는 BHI(브레인 하트 인퓨젼(Brain heart infusion), DIFCO) 등과 같이 통상적인 공급처로부터 입수가능하다.
모든 배지 성분을 가열(20 min, 1.5 bar 및 121 ℃) 또는 멸균 여과에 의해 멸균한다. 성분들을 함께 또는, 필요에 따라, 분리하여 멸균시킬 수 있다. 모든 배지 성분들은 배양 초기에 존재할 수 있거나 임의적으로, 연속적으로 또는 배치식으로 첨가될 수 있다.
통상, 배양 온도는 15 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 40 ℃이고, 실험 동안 일정하게 유지되거나 변할 수 있다. 배지의 pH 값은 5 내지 8.5 범위 내, 바람직하게는 약 7.0에서 존재해야 한다. 배양 과정 동안, 배양에 대한 pH 값은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수와 같은 알칼리 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물을 첨가함으로써 조절할 수 있다. 발포체 형성을 조절하기 위해, 예를 들면, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위해, 예를 들면, 항생제와 같은 적합한 선택적 작용제를 배지에 첨가할 수 있다. 호기성 조건을 유지시키기 위해, 예를 들면, 주위 공기와 같은 산소 또는 산소 함유 기체 혼합물을 배양액에 도입시킨다. 최대의 원하는 생성물이 형성될 때까지 배양을 계속한다. 통상, 이러한 목적은 10시간 내지 160시간 내에 달성된다.
이로써 얻은 특히, L-메티오닌을 함유하는 발효 브로쓰는 대개 7.5 내지 25 중량％의 건조 질량을 갖는다.
또한, 발효를 적어도 말기에, 특히 그 기간의 30％ 이상 당 제한 조건 하에서 운전하는 것도 유리하다. 이는 이 기간 동안 발효 배지 중 이용가능한 당의 농도가 ≥ 0 내지 3 g/l에서 유지되거나 이 범위로 낮춰짐을 의미한다.
뒤이어, 발효 브로쓰를 가공한다. 그 요건에 따라, 바이오메스(biomass)가 예를 들면, 원심분리, 여과, 배출(decanting) 또는 이 방법의 조합과 같은 분리 방법에 의해 완전히 또는 부분적으로 발효 브로쓰로부터 제거될 수 있거나, 또는 전체 바이오메스가 브로쓰에 잔류할 수 있다.
뒤이어, 발효 브로쓰를 공지된 방법, 예를 들면, 회전 증발기, 박막 증발기, 적하 필름(drop film) 증발기의 보조로, 역삼투, 또는 나노여과에 의해 증점시키거나 재농축시킬 수 있다. 뒤이어, 이 재농축된 발효 브로쓰를 동결건조, 분사 건조, 분사 과립화 또는 다른 방법에 의해 가공할 수 있다.
그러나, 황 함유 미세 화학물질, 특히 L-메티오닌을 추가 정제하는 것도 가능하다. 따라서, 바이오메스의 제거 후 적합한 수지를 사용하여 생성물 함유 브로쓰를 크로마토그래피하며, 여기서 원하는 생성물 또는 오염물질은 크로마토그래피 수지 상에 전체로 또는 부분적으로 보유된다. 임의적으로, 이러한 크로마토그래피 단계는 반복될 수 있으며, 여기서 동일한 또는 상이한 크로마토그래피 수지를 사용한다. 당업자는 적합한 크로마토그래피 수지를 선택하고 이를 가장 유효한 방식으로 사용하는 데 숙련되어 있다. 정제된 생성물을 여과 또는 한외여과에 의해 농축시키고, 생성물의 안정성이 최대로 되는 온도에서 저장할 수 있다.
단리된 화합물(들)의 정체성 및 순도를 선행 기술에 의해 결정할 수 있다. 이들은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 분광법, 염색 방법, 박막 크로마토그래피, NIRS, 효소 시험 또는 미생물학적 시험을 포함한다. 이러한 분석 방법은 문헌[Patek et al. (1994, Appl. Environ. Microbiol. 60, 133-140), Malakhova et al. (1996, Biotekhnologiya 11, 27-32), Schmidt et al. (1998, Bioprocess Engineer. 19, 67-70), Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996, Vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89-90, p. 521-540, p. 540-547, p. 559-566, 575-581 and p. 581-587); Michal, G (1999, Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons), Fallon et al. (1987, Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17)]에 요약되어 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해, 황 함유 화합물, 특히 메티오닌 또는 시스테인의 생산을 야생형에 비해, 5％ 이상, 10％, 50％, 75％, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 7, 10배, 특히 바람직하게는 20, 40, 60, 80, 100배, 특히 200, 500, 1,000배, 가장 바람직하게는 10,000배 증가시키는 것이 바람직하게 달성된다. 절대량에서, 특히 발효 브로쓰 1 리터 당 1 g 내지 150 g의 메티오닌의 수득량이 본 발명의 방법에 의해 달성될 수 있다.
이제 하기 비제한적인 실시예에 의해 본 발명을 상세히 기술할 것이다.
1. 물질 및 방법
1.1 세균 균주, 배지 및 플라스미드
C. 글루타미쿰 ATCC 14752 또는 ATCC 13032를 CGXII 최소 배지(문헌[Keilhauer et al. (1993) J. Bacteriol 175, 5595-5603] 참조)에서 통상적으로 배양하였다. 트란스포존 돌연변이체를 카나마이신(15 mg/ml)의 존재 하에서 배양하였다. 플라스미드를 C. 글루타미쿰에서 형질전환하는 경우 대장균 DH5α를 표준 클로닝에 사용하고, 대장균 ET12567를 플라스미드 증폭에 사용하였다.
본 발명에 사용된 균주 및 플라스미드를 하기 표 1에 나타낸다. 대응하는 항생제(카나마이신 50 ㎍/ml, 글로람페니콜, 50 ㎍/ml, 암피실린, 100 ㎍/ml)와 혼합된 루리아(Luria) 브로쓰(LB) 배지를 대장균 균주에 대한 표준 배지로 사용하였다. 4 mM MgSO4 및 10 mM KCl(Psi 브로쓰)과 혼합된 LB 배지를 화학적으로 형질전환된 대장균에 대한 회수 배지로 사용하였다. 전기천공된 C. 글루타미쿰 균주에 대한 회수 배지는 LBHIS(브레인 하트 인퓨젼을 갖춘 루리아 브로쓰) 및 소르비톨(문헌[Liebl et al. (1989) FEMS Microbiol Lett, 65, 299-304] 참조)였다. 플라스미드 pCGL0040(진뱅크 등록 번호 U53587)을 트란스포존 Tn5531(IS1207 Kmr)에 대한 공여체로 사용하고, 대장균 ET12567에서 증폭시켰다.
1.2 재조합 DNA 기술
플라스미드 DNA를 사용한 대장균 세포의 형질전환을 화학적 기능성(competent) 대장균 DH5α 또는 ET 12567을 사용하여 수행하였다. 세포를 염화루비듐 방법 [http://micro.nwfsc.noaa.gov/protocols/]에 따라 생성하고, 샘브룩 등(상기 참조)에 기재된 바와 같이 형질전환하였다. 기능성 C. 글루타미쿰 세포의 생성 및 전자형질전환(electrotransformation)을 문헌[Ankri (1996), Plasmid, 35, 62-66; Liebl et al., 상기 참조]에 기재된 바와 같이 수행하였다.
게놈 DNA를 위저드(Wizard)® 게놈 DNA 정제 키트(프로메가(Promega))를 사용하여 단리시켰다. 대장균 세포로부터의 플라스미드 제조를 퀴아프렙 미니트렙 키트(QIAprep Miniprep Kit)(퀴아겐(Qiagen))를 사용하여 통상적으로 수행하였다. 제한 엔도뉴클레아제를 로쉐 디아크노스틱스(Roche Diagnostics)로부터 구입하였다. 소화된 DNA 단편을 아가로오스 겔로부터 QIAEX II 겔 익스트렉션 키트(Gel Extraction Kit)(퀴아겐)에 의해 회수하였다. 표준 DNA 기술을 문헌(샘브룩 등, 상기 참조)에 기재된 바와 같이 수행하였다. DNA 시퀸싱을 글로발 어디션 IR2 시스템(Global Edition IR2 System)(네브라스카주 린콜른 소재의 LI-COR Inc.)을 사용하여 수행하였다.
ORF 및 프로모터를 동정하기 위한 게놈 데이터베이스로서, ERGO 데이터베이스(미국 시카고 소재의 인테그레이티드 게노믹스(Integrated Genomics))를 사용하였다. 본 명세서에 제공된 NCgl 수는 NCBI에서 진뱅크로부터의 C. 글루타미쿰 ATCC 13032 게놈 서열(진뱅크 등록 번호 NC 003450)을 지칭한다. ERGO 데이터베이스로부터 유래한 시스테인 신타아제(NCgl2473, 프로모터 위치 2721625-2721822), 술피트 리덕타아제(NCgl2718, 프로모터 위치 3005188-3005389), 및 O-아세틸호모세린 술프히드로라아제(metY, NCgl0625, 프로모터 위치 667771-668107)에 대한 프로모터를 PCR에 의해 증폭시키고, XhoI 및 BamHI 링커를 통해 동일한 제한 효소에 의해 분절된 플라스미드 pClik(Cmr)에서 프로모터 비함유 lacZ에 융합시켰다. 얻어진 플라스미드를 pClik-H185, PClik-H187 및 pC1ik-H217로 지칭하였다(표 1 참조). 이 플라스미드 중의 개개의 BglII 제한 부위를 사용하여 PCR에 의해 증폭된 NCgl2640에 도입시키며, 여기서 프라이머 쌍 2640-fwd-BglII(5'-CCGCTGCTGCTGGTGGCGCTAGATCTGCTAACGGC-3') 및 2640-rev-BglII(5'-ATGTGTTGGGAGATCTCTTAAGTTATTTAGTCCAG-3')를 사용하였다. 증폭된 DNA 단편은 NCgl2640 유전자의 상류 370개 이하의 염기쌍에 위치하는 추정의 조절 요소를 포함하였다.
1.3 트란스포즈(transpose) 및 삽입 부위의 트란스포징(transposing) 및 돌연변이생성, 스크리닝 및 위치결정(localization)
플라스미드 pCGL0040을 대장균 ET12567로부터 단리시켰다. 뒤이어, C. 글루타미쿰 ATCC 14752를 전기천공에 의해 플라스미드를 사용하여 형질전환시켰다. 트란스포존 삽입 돌연변이체를 20 ㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 LBHIS에서 평판배양함으로써 선택하였다. 얻어진 모든 돌연변이체를 풀링(pooling)하고, 멸균 0.9 ％ NaCl로 2회 세척하고, 뭉쳐진 풀의 106 희석액의 100 ㎕ 엘리콧의 형태로 카나마이신(20 ㎍/ml) 및 에티오닌(7.5 g/l)을 함유하는 CGXII 배지에서 평판배양하였다. 추가 분석을 위해 가장 빨리 성장하는 클론을 선택하였다.
트란스포존 삽입 부위를 위치 결정하기 위해, 게놈 DNA를 돌연변이체로부터 단리시켰다. 그 다음, 트란스포존 염색체 링커 부위를 pUC18로 클로닝한 데 이어, 올리고뉴클레오티드 Tn5531-Eco (5'-CGGGTCTACACCGCTAGCCCAGG-3')(문헌[Simic et al. (2001) J. Bacteriol. 183, 5317-5324] 참조)로 시퀀싱함으로써 삽입 부위를 결정하였다. 그 다음, 이로써 얻어진 서열을 BLASTn 프로그램에 의해 ERGO 데이터베이스 및 NCBI 진뱅크 서열에 대해 분석하였다. NCgl2640 서열을 사용한 패턴 및 프로파일 검색에 다양한 서열 분석 수단(http://www.expasy.org/, http://npsa-pbil.ibcp.fr 또는 http://pfam.wustl.edu/(단백질 족 데이터베이스 PFAM)을 사용하였다.
1.4 C. 글루타미쿰 ATCC 13032에서의 NCgl2640의 염색체 삭제
두 프라이머 쌍 2640-SacB1 (5'-GAGAGGGCCCATCAGCAGAACCTGGAACC-3')/2640-SacB2 (5'-GATCCAGAGGTCCACAACC-3') 및 2640-SacB3 (5--GATGGTTCAAGACGAACTCC-3')/2640-SacB4 (5'-GAGAGTCGACCAGAATCAATTCCAGCCTTC-3')에 의해, NCgl2640의 상류 및 하류 영역을 PCR에 의해 C. 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체 DNA로부터 증폭시켰다. 얻어진 단편을 ApaI/XbaI 또는 SpeI/SalI로 소화시키고, 비복제성 벡터 pClik-SacB에 공동으로 클로닝하고, 이 벡터를 ApaI/SalI으로 소화시켜 플라스미드 pSdel-NCgl2640을 얻었다. 그 다음, C. 글루타미쿰 ATCC 13032를 비복제성 플라스미드 pSdel-NCgl2640을 사용한 전기천공에 의해 형질전화시켰다. 카나마이신에 내성을 갖는 클론은 염색체로 통합된 플라스미드를 함유하였다. 뒤이어, 플라스미드 손실에 대한 선택을 문헌[Schafer et al. (Schafer et al. (1994) Gene 145:69-73)]의 방법에 따라 슈크로오스에 내성을 갖는 돌연변이체를 스크리닝함으로써 수행하였다. 그 다음, 삭제를 PCR 분석 및 써던 블로팅(Southern blotting)에 의해 확인하였다.
1.5 LacZ 활성 측정
선택된 C. 글루타미쿰 돌연변이 균주를 NCgl2640으로 보체화된 pClik 플라스미드 H185, H187 및 H217 또는 그의 유도체로 보체화하였다(표 1 참조). 형질전환체를 10 mM L-메티오닌의 존재 또는 부재 하에서, 카나마이신(20 ㎍/ml) 및 글로람페니콜(15 ㎍/ml)을 함유하는 CGXII 최소 배지에서 배양하였다. 샘브룩 등의 문헌(샘브룩 등, 상기 참조)에 기재되어 있는 바와 같이, 세포를 초기 대수 증식기(OD600 = 1 - 2)까지 배양하고, β-gal 활성에 대해 조사하였다. 4개의 독립적 시험 계열에서 분석시험을 각각 3회 수행하였다.
1.6 DNA 결합 단백질의 단리
자기 비드를 사용하여 DNA 친화성 크로마토그래피에 의해 DNA 결합 단백질을 단리시키는 원리는 실질적으로 문헌[Gabrielsen et al. (1993), Methods Enzymol., 218, 508-225]에 기재되었고, C. 글루타미쿰에 대한 상세한 프로토콜이 이용가능하 다(레이 등의 문헌(상기 참조)). 몇 가지 예외를 제외하고, 이 프로토콜을 본 발명에 사용하였다. 용리 완충제를 제외하고, 모든 완충제를 2.5 mM L-메티오닌과 혼합시켰다. 세포 붕괴 직후, 조 추출물을 프로테아제 억제제(PMSF, 아프로티닌(aprotinin), 류펩틴(leupeptin)(문헌[Rosenberg et al. (1996) Protein Analysis and Purification. Benchtop Techniques, Boston, Birkhaeuser] 참조)에 의해 단백질 분해로부터 보호하였다. 조 추출물을 한외여과(200,000 g, 40 분, 40 ℃)시킨 후, 단백질 용액을 겔 여과(세파덱스(Sephadex) G25)에 의해 탈염시켰다. PCR-증폭된 바이오티닐화 프로모터 DNA를 스트렙타비딘(streptavidin) 코팅된 다이나비즈(Dynabeads)® M270(다이날 바이오테크(Dynal Biotech.))에 고정시켰다. 음성 대조군 단편으로, C. 글루타미쿰으로부터 groES 유전자의 상류 영역으로부터의 460 bp 단편을 증폭시켰다. 세척 완충제는 대량의 비특이적 경쟁자 DNA(연어 정액 DNA, 0.4 mg/ml, 시그마(Sigma))를 함유하였다. I D-SDS-PAGE를 4％ 축적 겔(stacking gel) 및 12％ 러닝 겔(running gel)(문헌[Schaegger et al. (1987) Anal. Biochem. 166, 368-379] 참조)을 사용하여 수행하고, 단백질을 콜로이드성 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) G-250으로 염색하였다. MALDI-TOF 분석 및 트립틱(tryptic) 소화에 대한 프로토콜은 실질적으로 문헌[Hermann et al. (2001) Electrophoresis, 22, 1712-1723]에 기재된 프로토콜과 같다.
1.7 세포외 및 세포내 메티오닌 농도 측정
메티오닌을 그의 o-프탈디알데히드 유도체의 형태로 HPLC에 의해 정량화하였 다(문헌[Molnar-Perl et al. (2001), J. Chromatogr. 913, 283-302] 참조). C. 글루타미쿰을 50-100 ml의 배양 부피를 갖는 500 ml 진탕 플라스크에서 30 ℃ 및 225 rpm에서 정지기까지 배양하였다. 세포를 원심분리(10,000 g, 10 min, 4 ℃)에 의해 회수하고, 메티오닌 농도를 HPLC 분석에 의해 결정하였다. 세포내 메티오닌 농도를 결정하기 위해, 세포를 액체로부터 분리시키고, 실리콘 오일 원심분리에 의해 활성화시켰다(문헌[Ebbighausen et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechn. 31, 184-190] 참조). 뒤이어 세포를 초음파 처리 또는 블루-캡트 리보라이저(blue-capped ribolyser)(페스트프렙(FastPrep)®, Q-바이오진(Q-Biogene))에 의해 용해시켰다. 상청액 중 가용성 단백질을 브래드포드(Bradford) 분석시험에 따라 결정하였다. 따라서, C. 글루타미쿰 중의 가용성 단백질의 세포내 함량은 실험적으로 250 mg/ml인 것으로 결정되었다. HPLC 분석 후 메티오닌 농도를 결정할 수 있도록 이 값에 기초하여 샘플의 총 내부 세포 부피를 계산하였다.
2.2.1 결과
에티오닌 내성 트란스포존 돌연변이체의 선택 및 동정
본 발명의 범위 내에서, 메티오닌 과생산을 통해 에티오닌 내성을 얻을 수 있으며, 이는 C. 글루타미쿰에서 메티오닌 생합성을 조절하는 데 관련될 수 있는 추정적 억제제를 불활성화시킴으로써 달성될 수 있다는 가설을 세웠다. 이에 대한 근거는 에티오닌이 대사될 수 없기 때문에 메티오닌이 고농도로 보이게 되는 메티오닌의 구조적 유사체라는 점이다. 그 결과, 메티오닌 생합성은 대개 감소조절되고, 결국 유기체는 메티오닌 결핍으로 사멸한다.
항대사산물에 의해 유발되는 독성을 피하기 위해 유기체가 사용할 수 있는 것들 중 하나는 이 경우 메티오닌인 천연 대사산물을 과생산함으로써 독성 제제와 경쟁하는 것이다. 이 방식으로, 메티오닌 내성 균주는 이미 1970년대에 생산되었다(Kase et al., 상기 참조). 그러나, 그 당시 메티오닌을 현저하게 과생산하는 균주는 수득하지 못했으며, 이는 그 당시 수행된 선택 실험에서 중추적 조절제로서 메티오닌의 생합성을 탈활성화시키는 돌연변이체가 동정되지 않았기 때문인 듯하다. 이것이 트란스포존 매개 돌연변이생성에 의해 돌연변이를 도입시키고자 한 본 발명의 시도의 한 이유였다.
따라서, C. 글루타미쿰 ATCC 14752를 트란스포존 Tn5531에 대한 공여체로서 pCGL0040을 사용하여 형질전환하였다. 이 방식으로, 카나마이신을 갖는 LBHIS 플레이트에서 약 7,000개의 돌연변이체를 얻었다. 이 돌연변이체를 선행 기술에서 기재된 바와 같이 7.5 g/l D,L-에티오닌과 카나마이신을 갖는 CGXII 배지를 함유하는 플레이트에서 풀링하고 평판배양하였다. 모든 가능한 에티오닌 내성 돌연변이체가 회수될 수 있도록 보장하기 위해 약 100,000 콜로니 형성 단위(CFU)를 평판배양하였다. 6 g/l의 에티오닌을 사용하여, 4일 이상 야생형의 성장을 억제하였다. 2일 후, 11개의 카나마이신 내성 돌연변이체 및 에티오닌 내성 돌연변이체를 단리시킬 수 있었다. 모든 돌연변이체는 ORL NCgl2640에서 동일한 Tn5531 삽입을 함유하였다. 상기 돌연변이를 14752-Δ2640으로 지칭하고, 하기 실험을 위해 클론을 선택하였다(표 1).
2.2 트란스포존 삽입 부위의 서열 분석
균주 14752::2640에서의 트란스포존 삽입 부위가 위치 2918026/2918027(진뱅크 등록 번호 NC 003450)에서 추정의 단백질의 C-말단 절반에 위치함을 관찰할 수 있었다. NCgl2640은 NCgl2639와 7 개의 염기쌍만큼 분리되어, 양쪽 유전자는 아마도 한 오페론에 조직된 것으로 보인다. NCgl2639를 데이터베이스(진뱅크)에서 추정적 히드롤라아제 또는 아세틸트란스퍼라제로 주석을 단다(도 2 참조). NCgl2640은 42 kDa의 단백질을 코딩한다. 상동성을 통해, 상당한 상동성(e-값 < 2e-20)의 25개를 초과하는 추정적 세균 단백질을 동정할 수 있었으며, 이들 중 어느 것도 기능적인 방식으로 본 명세서에 주석을 달지 않았다. 글루타메이트 시스테인 리가아제 족에 대한 특징인 단백질 족 데이터베이스(PFAM)의 모티프 04107과 같이, 보존 도메인 검색을 사용하여 비공지된 기능의 단백질에 대한 공통서열 패턴(C0G2170)을 높은 유의성으로 동정할 수 있었다. 더 이상의 공통서열 모티프를 동정할 수 없었다. 특히, DNA 결합 단백질을 동정할 수 없었다.
2.3 메티오닌 내성 표현형의 확인
그 다음, C. 글루타미쿰 ATCC 14752 및 돌연변이 균주를 7.5 g/l(돌연변이체) 또는 3.8 g/l(야생형) D,L-에티오닌의 존재 또는 부재 하에서 3 g/l 글루코오스를 함유하는 CGXII 배지에서 배양하였다. 에티오닌의 존재 하의 돌연변이체의 성장은 메티오닌이 없는 성장이나 에티오닌이 없는 야생형의 성장과 식별되지 않았다. 그러나, 실질적으로 낮은 치사량에 가까운 농도의 에티오닌의 존재 하에서 야생형의 성장은 현저히 악화되었다(도 3 참조).
다른 부위에서의 돌연변이가 에티오닌 내성 표현형을 생성하는 것을 배제하 기 위해, C. 글루타미쿰 ATCC 13032에서 NCgl2640 불활성화의 영향을 시험하였다. NCgl2640을 상동 재조합 및 슈크로오스 내성 돌연변이체 균주의 선택에 의해 C. 글루타미쿰의 게놈으로부터 절단하였다. 13032::2640으로 지칭되는 이 돌연변이체는 7.5 g/l에서 D,L-에티오닌에 내성을 갖지만, 이 플레이트에서 야생형 ATCC 13032의 성장은 검출할 수 없었다.
따라서, 본 발명의 범위 내에서, 에티오닌 내성 표현형은 실제로 오직 NCgl2640의 불활성화만을 기초로 한다는 점을 입증할 수 있었다.
2.4 NCgl2640 돌연변이체에서 메티오닌 생합성 유전자의 변화된 발현
그 다음, 대개 메티오닌 생합성의 핵심 단계인 황 동화의 엄격한 조절이 NCgl2640 돌연변이체에서 변화되는지 조사하였다.
NCgl2640이 C. 글루타미쿰에서 황 화합물의 생합성의 중추적 조절제인 경우, 이는 황 동화와 관련된 유전자의 발현을 조절하고, 메티오닌 발현량이 증가해야 하며, 이는 에티오닌에 대한 내성을 담당할 것이라는 가설로부터 가정한 것이었다. 이 가설을 metY, cysK 및 술페이트 오페론 유전자의 발현량에 대한 NCgl2640 녹아웃의 영향을 기초로 조사하였다. 이를 위해, NCgl2640이 삭제된 균주 14752::2640, 및 야생형을 lacZ 리포터(reporter) 플라스미드 pClik-PcysK, pClik-PmetY 및 pClik-Psulfat로 형질전환시켰다(또한, 표 1 참조). 그 다음, ATCC 14752 야생형 및 돌연변이 균주를 10 mM L-메티오닌을 첨가하거나 첨가하지 않고 CGXII 배지에서 대수 증식기(OD600 = 3)까지 배양하고, 유전자 발현을 lacZ 활성에 의해 결정하였다.
야생형에서는, 메티오닌의 존재가 조사된 모든 유전자의 발현량을 감소시켰다. 술페이트 오페론의 발현은 완전히 억제되었다. 돌연변이 균주에서, cysK 및 술페이트 오페론에 대한 상당한 탈억제가 관찰되었다. 양쪽 모두의 유전자에서, 메티오닌의 발현은 독립적이며, 이는 돌연변이 균주 배경 중의 메티오닌 및 다른 황 함유 화합물에 대한 생합성 경로의 완전한 탈억제, 즉 완전한 탈조절을 시사한다(또한, 도 4 참조). 인접 NCgl2639(히드롤라아제 또는 아세틸트란스퍼라제, 도 2 참조)에 대한 NCgl2640의 불활성화의 중심적 영향을 배제하기 위해, NCgl2640을 돌연변이체에서 그의 프로모터를 통해 발현시키며, 이는 야생형 표현형을 재정립하여, 즉 메티오닌 유발 억제 및 감소(cysK)되거나 또는 증가된(술페이트 오페론) 기저 전사 수준이 관찰되었다(또한, 도 4 참조). 이러한 표현형은 야생형에서보다 보체화된 균주에서 훨씬 더 많이 발현된다. 아마도 이는, 보체화된 균주에서 중간 카피 플라스미드로부터 발생하는 NCgl2640의 발현이 증가하기 때문인 듯하다.
2.5 NCgl2640은 cysK, metY 및 술페이트 오페론의 프로모터에 결합하지 않음
따라서, 본 발명의 범위 내에서, cysK, 술페이트 오페론 및 또한 metY의 발현이 NCgl2640에 의해 중추적으로 조절된다는 점이 밝혀질 수 있었다. 전형적인 DNA 결합 모티프가 NCgl2640의 서열에서 동정되지 않음에 따라, NCgl2640이 앞서 언급한 유전자 중의 해당 프로모터 영역에 결합할 수 있는지 여부를 검사하기 위해 소위 풀다운(pull down) 분석시험에서 DNA 친화성 정제를 사용하였다. PCR에 의해 증폭되고 비드에 고정된 프로모터를 2.5 mM L-메티오닌의 존재 하에서, 10 mM L-메 티오닌의 존재 또는 부재 하에서 배양된 C. 글루타미쿰 세포의 조 추출물을 사용하여 인큐베이션하였다. 고 염 농도(> 200 mM)에서 프로모터로부터 용리되는 단백질을 1 D-SDS-PAGE에 의해 분리시키고, MALDI-TOF에 의해 분석하였다.
유사한 접근으로, 레이 등(상기 참조)은 이미 McbR 억제제를 metY 프로모터에 특이적으로 결합하는 것으로 보이는 4개의 다른 단백질과 함께 동정하였다. 이 결과를 본 발명의 범위 내에서 확인할 수 있었다. 또한, McbR이 cysK의 프로모터 및 술페이트 오페론에도 결합한다는 점도 밝혀낼 수 있었다(도 5 참조). 그러나, 이러한 양쪽 연구에서는, NCgl2640을 검출하지 못했으며, 이는 어떠한 직접적인 DNA/단백질 상호작용도 NCgl2640 매개 조절에 관여하지 않는다는 점을 시사한다.
2.6 NCgl2640 돌연변이체에서의 L-메티오닌 양의 증가
따라서, 대량의 에티오닌에 대한 C. 글루타미쿰 14752::2640의 내성은 L-메티오닌 생합성 증가의 결과로 보인다. 이 가설을 입증하기 위해, 야생형 및 돌연변이체에서 L-메티오닌의 생산을 CGXII 최소 배지 배양으로 조사하였다.
돌연변이 균주가 대개 야생형의 2배 이상의 메티오닌을 생산하였다는 점을 밝힐 수 있었다. 에티오닌의 존재 하에서, 메티오닌 분비는 야생형이 아닌 돌연변이체에서 자극될 수 있었다(도 6A 참조). 마찬가지로 세포내 메티오닌 양은 돌연변이체에서 두 배가 되었지만, 에티오닌은 세포내 메티오닌 양을 감소시켰으며, 이는 아마도 메티오닌 분비의 자극 때문인 듯하다(도 6B 참조). 총 메티오닌 양은 돌연변이체가 야생형의 두배였다.
앞서 설명한 실험은 NCgl2640에 대한 코딩 서열이 삭제되어, 이 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이 야생형에 비해 감소된 미생물이 메티오닌을 증가된 양으로 생산할 수 있다는 것을 보여준다.
황 대사 유전자가 작용 전달(trans-acting) 조절제일 수 있는 NCgl2640에 의해 조절됨에 따라, 본 발명에 따른 미생물을 다른 황 함유 화합물을 생산하는 데에도 사용할 수 있다. 이는 예를 들면, 미생물이 시스테인 생산을 위해 황을 감소시키게 되는 대사 경로에도 의존해야 하고, 추가의 황 함유 화합물, 예를 들면 글루타티온 또는 S-아데노실 메티오닌이 시스테인 및/또는 메티오닌의 존재에 의존한다는 사실에 기초한다.
서열 데이터
서열 번호 1(진뱅크 등록 번호 NCgl2640):
서열 번호 2(진뱅크 등록 번호 NP_601931):
서열 번호 3(McbR):
서열 번호 4(진뱅크 등록 번호 NP_602128):
도 1 메티오닌 생합성시 황을 혼입시키는 별개의 방법
황을 MetY(A)에 의해 촉매화되는 직접적 술프하이드로레이션(sulfhydrolation)에 의해, 또는 트란스-술프하이드로레이션 경로(B)를 통해 혼입시킬 수 있다. 표지된 유전자 생성물의 프로모터를 위해 lacZ 융합물을 제조하였다. NCgl2718의 프로모터는 술페이트 군집 중에 조직화된 유전자(NCgl2715-NCgl2720)의 발현을 조절한다.
하기 약어를 사용하였다: Ask, 아스파테이트 키나아제, AsDH, 아스파테이트 세미알데히드 데히드로게나아제, Hom, 호모세린 데히드로게나아제, MetA, 호모세린 아세틸트란스퍼라제, MetB 시스타티오닌-γ-신타아제, MetC, 시스타티오닌-β-리아제, MetH, 메티오닌 신타아제, MetY, 0-아세틸호모세린 술프히드로라아제, MetK, S-아데노실 메티오닌 신타아제, NCgl2715, 술페이트 아데노실트란스퍼라제 서브유닛 1; NCgl2716, 술페이트 아데노실트란스퍼라제 서브유닛 2; NCgl2717, PAPS 리덕타아제; NCgl2718, 추정적 니트리트 리덕타아제로 주석을 단 술피드 리덕타아제; CysK, 시스테인 신타아제.
도 2 NCgl2640의 게놈 설명
ORFs에 대해 이용가능한 진뱅크 주석:
NCgl2638, 여러 부분으로 나뉜 Na+/H+ 안티포터(antiporter)와 유사;
NCgl2639, 예측된 히드롤라아제 또는 아세틸트란스퍼라제, 알파-/베타-히드롤라아제 슈퍼페밀리(superfamily)와 유사;
NCgl2640, 가설적 단백질(비특성화된 BCR);
NCgl2641, 가설적 단백질, 주석 없음;
Tn5531, 트란스포존 5531(757207). 진한 삼각형은 NCgl2640 중 Tn5531의 삽입 부위를 나타낸다.
도 3 에티오닌의 존재 또는 부재 하에서 CGXII 배지에서 배양된 C. 글루타미쿰 야생형 및 돌연변이체의 성장 곡선
글루코오스 농도는 3 g/l이고, D,L-에티오닌 농도는 야생형 또는 돌연변이체 균주에 대해 3.5 g/l 또는 7.5 g/l였다. 야생형은 7.5 g/l의 D,L-에티오닌의 존재 하에서 성장하지 않는 것으로 관찰되어야 한다.
진한 기호: 배양 동안 존재하는 에티오닌;
빈 기호: 에티오닌 없이 배양;
▲ 야생형;
● 돌연변이체 균주.
도 4 cysK, metY 및 술페이트 오페론의 메티오닌 의존성 발현에 대한 NCgl2640 녹아웃의 영향
C. 글루타미쿰-ATCC 14752(야생형; WT), 돌연변이 균주 14752::2640, 및 플라스미드-기원(plasmid-borne) NCgl2640(::2640-cpl)으로 보체화되고 리포터 플라스미드 pClik-PcsyK, pClik-metY 또는 pClik-Psulfat를 함유하는 돌연변이 균주를 메티오닌(10 mM)의 존재 또는 부재 하에서 CGXII(3 g/l 글루코오스) 배지에서 배양하였다. 프로모터 활성을 LacZ 활성 리포터 분석시험에 의해 결정하고, 밀러(Miller) 단위로 정량화하였다.
어두운 막대: 성장 배지 중 메티오닌 비함유;
빈 막대: 성장 배지 중 L-메티오닌 함유.
도 5 추정적 술페이트 오페론의 유전자 및 시스테인 신타아제(cysK), O-아세틸호모세린-술프히드릴라아제(metY)에 대한 C. 글루타미쿰 유전자의 추정적 프로모터 영역에 결합하는 단백질에 대한 SDS-PAGE
1, TetR과 유사하고, 레이 등(상기 참조)으로부터 공지된 조절제 McbR,
2, 엑소폴리 포스파타제(분해 생성물);
3, 엑소폴리 포스파타제;
4, ATP 포스포리보실 트란스퍼라제;
5, DNA 중합효소 I.
엑소폴리 포스파타제 및 DNA 중합효소 I을 제외하고, groES에 결합하는 동정된 단백질 어느 것도 프로모터 단편을 조절하지 않는다.
GAP-DH, 글리세르알데히드-3-포스페이트-데히드로게나아제를 마커 단백질(37 kDa)로 사용하였다; M, 단백질 마커.
도 6
에티오닌의 존재 또는 부재 하에서 C. 글루타미쿰 야생형 및 NCgl2640 녹아웃 돌연변이체 균주(::2640)에서의 세포외(A) 및 세포내(B) L-메티오닌 량
어두운 막대: 인큐베이션 동안 에티오닌 없음,
백색 막대: 3.5 g/l(야생형) 또는 7.5 g/l(::2640)의 D,L-에티오닌.
| 표 1: 앞서 언급한 균주 및 플라스미드의 요약. | ||
| 균주 또는 플라스미드 | 표현형 | 공급원 또는 참고문헌 |
| C. 글루타미쿰 균주 | ||
| ATCC 13032 | 야생형 | ATCC |
| ATCC 14752 | 야생형 | (Simic et al., 2001) |
| 13032::2640 | NCgl2640을 갖는 야생형, Kmr | 본 발명에 따름 |
| 14752::2640 | NCgl2640을 갖는 야생형, Kmr | 본 발명에 따름 |
| 14752-PcysK | 리포터 플라스미드 pClik-Pcys를 갖는 ATCC 14752, Cmr | 본 발명에 따름 |
| CG::2640-PcysK | 리포터 플라스미드 pClik-PcysK를 갖는 14752::2640, Kmr Cmr | 본 발명에 따름 |
| CG::2640-PcysK-cpl | 리포터 플라스미드 pClik-PcysK-cpl을 갖는 14752::2640, Kmr Cmr | 본 발명에 따름 |
| 14752-PmetY | 리포터 플라스미드 pClik-PmetY를 갖는 ATCC 14752, Cmr | 본 발명에 따름 |
| CG::2640-PmetY | 리포터 플라스미드 pClik-PmetY를 갖는 14752::2640, Kmr Cmr | 본 발명에 따름 |
| CG::2640-PmetY-cpl | 리포터 플라스미드 pClik-PmetY-cpl을 갖는 14752::2640, Kmr Cmr | 본 발명에 따름 |
| 14752-P술페이트 | ATCC 14752와 리포터 플라스미드 pClik-P술페이트, Cmr | 본 발명에 따름 |
| CG::2640-P술페이트 | 리포터 플라스미드 pClik-P술페이트를 갖는 14752::2640, Kmr Cmr | 본 발명에 따름 |
| CG::2640-P술페이트-cpl | 리포터 플라스미드 pClik-P술페이트-cpl을 갖는 14752::2640, Kmr Cmr | 본 발명에 따름 |
| 대장균-균주 | ||
| DH5α | F- endA1, hsdR17(rk-mk+)supE44, thi-lλ recAI gyrA96 relA1 φ80ΔlacAm15 | (Hanahan, 1983) |
| ET12567 | dam dcm hsd, 제한 결손 | (MacNeil et al., 1992) |
| 플라스미드 | ||
| pUC18 | Apr , lacZ | 스트라타진 |
| pCGL0040 | Tn5531 (IS1207 Kmr)의 공여체; Apr, oriVE .c. | (Ankri et al., 1996b) |
| pMT1 | 대장균-C. 글루타미쿰 셔틀 벡터, Apr Kmr | (Follettie et al., 1993; Lee and Sinskey, 1994) |
| oepClik-SacB | 상동 재조합에 의한 대립형질 치환용 벡터; C. 글루타미쿰에서 비복제성임, Kmr, SacB | (Hwang et al., 1999) |
| pSdel-NCgl2640 | NCgl2640의 염색체 삭제용 pClikSacB-기재 대립형질 치환 벡터 | 본 발명에 따름 |
| pClik-PcysK | cysK 프로모터 프로브 벡터 lacZ 융합, Cmr | 본 발명에 따름 |
| pClik-PcysK-cpl | NCgl2640을 갖는 pClik-PcysK, Cmr | 본 발명에 따름 |
| pClik-PmetY | metY 프로모터 프로브 벡터 lacZ 융합, Cmr | 본 발명에 따름 |
| pClik-PmetY-cpl | NCgl2640을 갖는 pClik-PmetY, Cmr | 본 발명에 따름 |
| pClik-P술페이트 | 술페이트 오페론 프로모터 프로브 벡터 lacZ 융합, Cmr | 본 발명에 따름 |
| pClik-P술페이트-cpl | NCgl2640을 갖는 pClik-P술페이트, Cmr | 본 발명에 따름 |
표 1의 참고문헌
SEQUENCE LISTING
<110> BASF AG
<120> Mikroorganisms for the production of sulfur-containing compounds
<130> B 7673
<140> DE 10 2004 035 052.3
<141> 2004-07-20
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1131
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<300>
<308> GenBank/NCgl2640
<309> 2002-03-20
<313> (1)..(1131)
<400> 1
atgggcattg agtttaagcg ttcaccgcga cccaccctgg gcgttgagtg ggaaattgca 60
cttgttgatc cagaaacacg tgatctagcc ccgcgcgctg cagaaatact agagattgtg 120
gccaagaacc accctgaggt gcacctcgag cgcgaattcc tccaaaacac cgtggagctt 180
gtcaccggag tgtgcgacac cgtccccgaa gcggtggcag agctttccca cgatctagat 240
gcgctgaaag aagcagcgga ttctctcggg cttcggttgt ggacctctgg atcccaccca 300
ttttcggatt tccgcgaaaa cccagtatct gaaaaaggct cctacgacga gatcatcgcg 360
cgcacccaat actggggaaa ccagatgttg atttggggca ttcacgtcca cgtgggcatc 420
agccatgaag atcgcgtgtg gccgatcatc aatgcgctgc tgacaaatta cccacatctg 480
ttggcacttt ctgcaagctc tccagcatgg gacggacttg ataccggtta tgcctccaac 540
cggacgatgc tctaccaaca gctgcctaca gccggactgc cataccaatt ccaaagctgg 600
gatgaatggt gcagctacat ggcggatcaa gataaatccg gtgtcatcaa ccacaccgga 660
tccatgcact ttgatatccg ccccgcatcc aaatggggaa ccatcgaagt ccgcgtggcc 720
gattctacct ccaacctgcg ggaactgtct gccatcgtgg cgttgaccca ctgtctcgtg 780
gtgcactacg accgcatgat cgacgctggc gaagagcttc cctccctgca acaatggcac 840
gtttcggaaa ataaatggcg cgcggctagg tatggtctgg atgccgaaat catcatttcc 900
agagacaccg atgaagcgat ggttcaagac gaactccgcc gactagtagc gcaattgatg 960
cctctagcca acgaactcgg ctgcgctcgt gagcttgaac ttgtgttgga aatcctggaa 1020
cgtggtggtg gatacgaacg ccaacgcaga gtgtttaaag aaactggcag ttggaaagct 1080
gcagttgatt tagcctgcga cgaactcaac gacctcaaag cactggacta a 1131
<210> 2
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<313> (1)..(376)
<400> 2
Met Gly Ile Glu Phe Lys Arg Ser Pro Arg Pro Thr Leu Gly Val Glu
1 5 10 15
Trp Glu Ile Ala Leu Val Asp Pro Glu Thr Arg Asp Leu Ala Pro Arg
20 25 30
Ala Ala Glu Ile Leu Glu Ile Val Ala Lys Asn His Pro Glu Val His
35 40 45
Leu Glu Arg Glu Phe Leu Gln Asn Thr Val Glu Leu Val Thr Gly Val
50 55 60
Cys Asp Thr Val Pro Glu Ala Val Ala Glu Leu Ser His Asp Leu Asp
65 70 75 80
Ala Leu Lys Glu Ala Ala Asp Ser Leu Gly Leu Arg Leu Trp Thr Ser
85 90 95
Gly Ser His Pro Phe Ser Asp Phe Arg Glu Asn Pro Val Ser Glu Lys
100 105 110
Gly Ser Tyr Asp Glu Ile Ile Ala Arg Thr Gln Tyr Trp Gly Asn Gln
115 120 125
Met Leu Ile Trp Gly Ile His Val His Val Gly Ile Ser His Glu Asp
130 135 140
Arg Val Trp Pro Ile Ile Asn Ala Leu Leu Thr Asn Tyr Pro His Leu
145 150 155 160
Leu Ala Leu Ser Ala Ser Ser Pro Ala Trp Asp Gly Leu Asp Thr Gly
165 170 175
Tyr Ala Ser Asn Arg Thr Met Leu Tyr Gln Gln Leu Pro Thr Ala Gly
180 185 190
Leu Pro Tyr Gln Phe Gln Ser Trp Asp Glu Trp Cys Ser Tyr Met Ala
195 200 205
Asp Gln Asp Lys Ser Gly Val Ile Asn His Thr Gly Ser Met His Phe
210 215 220
Asp Ile Arg Pro Ala Ser Lys Trp Gly Thr Ile Glu Val Arg Val Ala
225 230 235 240
Asp Ser Thr Ser Asn Leu Arg Glu Leu Ser Ala Ile Val Ala Leu Thr
245 250 255
His Cys Leu Val Val His Tyr Asp Arg Met Ile Asp Ala Gly Glu Glu
260 265 270
Leu Pro Ser Leu Gln Gln Trp His Val Ser Glu Asn Lys Trp Arg Ala
275 280 285
Ala Arg Tyr Gly Leu Asp Ala Glu Ile Ile Ile Ser Arg Asp Thr Asp
290 295 300
Glu Ala Met Val Gln Asp Glu Leu Arg Arg Leu Val Ala Gln Leu Met
305 310 315 320
Pro Leu Ala Asn Glu Leu Gly Cys Ala Arg Glu Leu Glu Leu Val Leu
325 330 335
Glu Ile Leu Glu Arg Gly Gly Gly Tyr Glu Arg Gln Arg Arg Val Phe
340 345 350
Lys Glu Thr Gly Ser Trp Lys Ala Ala Val Asp Leu Ala Cys Asp Glu
355 360 365
Leu Asn Asp Leu Lys Ala Leu Asp
370 375
<210> 3
<211> 642
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<300>
<308> GenBank/AY217661
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<313> (1)..(642)
<400> 3
gtggctgcta gcgcttcagg caagagtaaa acaagtgccg gggcaaaccg tcgtcgcaat 60
cgaccaagcc cccgacagcg tctcctcgat agcgcaacca accttttcac cacagaaggt 120
attcgcgtca tcggtattga tcgtatcctc cgtgaagctg acgtggcgaa ggcgagcctc 180
tattcccttt tcggatcgaa ggacgccttg gttattgcat acctggagaa cctcgatcag 240
ctgtggcgtg aagcgtggcg tgagcgcacc gtcggtatga aggatccgga agataaaatc 300
atcgcgttct ttgatcagtg cattgaggaa gaaccagaaa aagatttccg cggctcgcac 360
tttcagaatg cggctagtga gtaccctcgc cccgaaactg atagcgaaaa gggcattgtt 420
gcagcagtgt tagagcaccg cgagtggtgt cataagactc tgactgattt gctcactgag 480
aagaacggct acccaggcac cacccaggcg aatcagctgt tggtgttcct tgatggtgga 540
cttgctggat ctcgattggt ccacaacatc agtcctcttg agacggctcg cgatttggct 600
cggcagttgt tgtcggctcc acctgcggac tactcaattt ag 642
<210> 4
<211> 213
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<300>
<308> GenBank/NP_602128
<309> 2002-03-20
<313> (1)..(213)
<400> 4
Met Ala Ala Ser Ala Ser Gly Lys Ser Lys Thr Ser Ala Gly Ala Asn
1 5 10 15
Arg Arg Arg Asn Arg Pro Ser Pro Arg Gln Arg Leu Leu Asp Ser Ala
20 25 30
Thr Asn Leu Phe Thr Thr Glu Gly Ile Arg Val Ile Gly Ile Asp Arg
35 40 45
Ile Leu Arg Glu Ala Asp Val Ala Lys Ala Ser Leu Tyr Ser Leu Phe
50 55 60
Gly Ser Lys Asp Ala Leu Val Ile Ala Tyr Leu Glu Asn Leu Asp Gln
65 70 75 80
Leu Trp Arg Glu Ala Trp Arg Glu Arg Thr Val Gly Met Lys Asp Pro
85 90 95
Glu Asp Lys Ile Ile Ala Phe Phe Asp Gln Cys Ile Glu Glu Glu Pro
100 105 110
Glu Lys Asp Phe Arg Gly Ser His Phe Gln Asn Ala Ala Ser Glu Tyr
115 120 125
Pro Arg Pro Glu Thr Asp Ser Glu Lys Gly Ile Val Ala Ala Val Leu
130 135 140
Glu His Arg Glu Trp Cys His Lys Thr Leu Thr Asp Leu Leu Thr Glu
145 150 155 160
Lys Asn Gly Tyr Pro Gly Thr Thr Gln Ala Asn Gln Leu Leu Val Phe
165 170 175
Leu Asp Gly Gly Leu Ala Gly Ser Arg Leu Val His Asn Ile Ser Pro
180 185 190
Leu Glu Thr Ala Arg Asp Leu Ala Arg Gln Leu Leu Ser Ala Pro Pro
195 200 205
Ala Asp Tyr Ser Ile
210
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer 2640-fwd-BglII
<400> 5
ccgctgctgc tggtggcgct agatctgcta acggc 35
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer 2640-rev-BglII
<400> 6
atgtgttggg agatctctta agttatttag tccag 35
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide Tn5531-Eco
<400> 7
cgggtctaca ccgctagccc agg 23
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<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer 2640-SacB1
<400> 8
gagagggccc atcagcagaa cctggaacc 29
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer 2640-SacB2
<400> 9
gatccagagg tccacaacc 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer 2640-SacB3
<400> 10
gatggttcaa gacgaactcc 20
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer 2640-SacB4
<400> 11
gagagtcgac cagaatcaat tccagccttc 30
Claims (28)
- 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산에 의해 코딩되는 하나 이상의 단백질의 함량 및/또는 활성이 미생물의 야생형에 비해 감소된 것을 특징으로 하는 황 함유 화합물을 생산하는 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 황 함유 화합물이 L-메티오닌, L-시스테인, L-호모시스테인, L-시스타티오닌, S-아데노실-L-메티오닌, 글루타티온, 바이오틴, 티아민 및/또는 리포산, 바람직하게는 L-메티오닌 및/또는 L-시스테인을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 악티노박테리아(Actinobacteria), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 클로로플렉서스 오란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus), 바람직하게는 코리네박테리아(Corynebacteria), 미코박테리아(Mycobacteria), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 살모넬라(Salmonellae), 대장균(Escherichia coli), 시겔라(Shigella), 바실러스(Bacillus), 세라티아(Serratia), 살모넬라(Salmonella) 및/또는 수도모나스(Pseudomonas)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 서열 번호 1의 서열 과 30％, 40％ 또는 50％ 이상, 바람직하게는 60％ 이상, 또한 바람직하게는 70％ 이상, 특히 바람직하게는 80％ 이상, 특히 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상 동일한 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 미생물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 황 함유 화합물의 생합성 경로의 하나 이상의 단백질의 함량 및/또는 활성이 상기 미생물의 야생형에 비해 추가로 증가되고(되거나) 황 함유 화합물의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 이 핵산에 의해 코딩되는 단백질이 생합성 대사산물에 의해 그의 활성이 영향받지 않도록 돌연변이된 것을 특징으로 하는 미생물.
- 제5항에 있어서, 상기 황 함유 화합물의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산이- 메티오닌 신타아제 metH를 코딩하는 핵산,- 아스파테이트 키나아제 lysC를 코딩하는 핵산,- 글리세린알데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제 gap을 코딩하는 핵산,- 3-포스포글리세레이트 키나아제 pgk를 코딩하는 핵산,- 피루베이트 카르복실라제 pyc를 코딩하는 핵산,- 트리오세포스페이트 이소머라제 tpi를 코딩하는 핵산,- 호모세린-0-아세틸트란스퍼라제 metA를 코딩하는 핵산,- 시스타티오닌-감마-신타아제 metB를 코딩하는 핵산,- 시스타티오닌-감마-리아제 metC를 코딩하는 핵산,- 세린 히드록시메틸트란스퍼라제 glyA를 코딩하는 핵산,- O-아세틸호모세린 술프히드릴라아제 metY를 코딩하는 핵산,- 포스포세린 아미노트란스퍼라제 serC를 코딩하는 핵산,- 포스포세린 포스파타제 serB를 코딩하는 핵산,- 세린 아세틸트란스퍼라제 cysE를 코딩하는 핵산,- 호모세린 데히드로게나아제 hom을 코딩하는 핵산,- 메티오닌 신타아제 metE를 코딩하는 핵산,- 시스테인 신타아제를 코딩하는 핵산,- 술피트 리덕타아제를 코딩하는 핵산,- 포스포아데노신 포스포술페이트 리덕타아제 cysH를 코딩하는 핵산,- 술페이트 아데닐일트란스퍼라제 서브유닛 1을 코딩하는 핵산,- CysN 술페이트 아데닐일트란스퍼라제 서브유닛 2를 코딩하는 핵산,- 페레독신(ferredoxin) NADP 리덕타아제를 코딩하는 핵산,- 페레독신을 코딩하는 핵산,- 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제를 코딩하는 핵산, 및/또는- 프룩토오스-1,6-비스포스파타제를 코딩하는 핵산으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 미생물.
- 제6항에 있어서, 상기 황 함유 화합물의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산이 제6항 기재의 핵산과 기능적으로 상동성을 갖고, 바람직하게는 50％ 이상, 바람직하게는 60％ 이상, 또한 바람직하게는 70％ 이상, 특히 바람직하게는 80％ 이상, 특히 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상 동일한 것을 특징으로 하는 미생물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 황 함유 화합물의 생합성 경로의 하나 이상의 단백질의 함량 및/또는 활성이 미생물의 야생형에 비해 추가로 감소된 것을 특징으로 하는 미생물.
- 제8항에 있어서, 상기 황 함유 화합물의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산이- 호모세린 키나아제 thrB를 코딩하는 핵산,- 트레오닌 디히드라타제 ilvA를 코딩하는 핵산,- 트레오닌 신타아제 thrC를 코딩하는 핵산,- 메조-디아미노피멜레이트-D-데히드로게나아제 ddh를 코딩하는 핵산,- 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제 pck를 코딩하는 핵산,- 글루코오스-6-포스페이트-6-이소머라제 pgi를 코딩하는 핵산,- 피루베이트 옥시다아제 poxB를 코딩하는 핵산,- 디히드로디피콜리네이트 신타아제 dapA를 코딩하는 핵산,- 디히드로디피콜리네이트 리덕타아제 dapB를 코딩하는 핵산,- 디아미노피콜리네이트 데카르복실라제 lysA를 코딩하는 핵산,- 글리코실트란스퍼라제를 코딩하는 핵산, 및/또는- 락테이트 데히드로게나아제를 코딩하는 핵산로부터 선택된 것을 특징으로 하는 미생물.
- 제9항에 있어서, 상기 황 함유 화합물의 생합성 경로의 단백질을 코딩하는 핵산이 제9항 기재의 핵산과 기능적으로 상동성을 갖고, 바람직하게는 50％ 이상, 바람직하게는 60％ 이상, 또한 바람직하게는 70％ 이상, 특히 바람직하게는 80％ 이상, 특히 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상 동일한 것을 특징으로 하는 미생물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항 기재의 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 미생물에서 황 함유 화합물을 생산하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 황 함유 화합물이 배지 및/또는 미생물 세포에 풍부하고, 이로부터 단리되는 발효 공정에 관한 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 황 함유 화합물이 L-메티오닌, L-시스테인, L-호모시스테인, L-시스타티오닌, S-아데노실-L-메티오닌, 글루타티온, 바이오틴, 티아민 및/또는 리포산, 바람직하게는 L-메티오닌 및/또는 L-시스테인을 포함 하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 악티노박테리아, 시아노박테리아, 프로테오박테리아, 클로로플렉서스 오란티아쿠스, 피렐룰라종(Pirellula sp .) 1, 할로박테리아(Halobacteria) 및/또는 메타노코치(Methanococci), 바람직하게는 코리네박테리아, 미코박테리아, 스트렙토마이세스, 살모넬라, 대장균, 시겔라 및/또는 수도모나스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이 대응하는 게놈 핵산 서열(들)의 붕괴 및/또는 삭제에 의해 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이a) 하기 핵산 서열을 5'→3' 배향으로 포함하는 벡터를 생성하는 단계;- 미생물에서 기능적인 프로모터 서열,- 이에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 1의 서열의 5' 말단과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 DNA 서열,- 이에 작동가능하게 연결된, 내성 유전자를 코딩하는 DNA 서열,- 이에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 1의 서열의 3' 말단과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 DNA 서열,- 이에 작동가능하게 연결된, 미생물에서 기능적인 종결 서열, 및b) a)로부터의 벡터를 미생물에 전달하고, 임의적으로, 벡터를 미생물의 게놈에 통합시키는 단계에 의해 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이a) 하기 핵산 서열을 5'→3' 배향으로 포함하는 벡터를 생성하는 단계;- 해당 미생물에서 기능적인 프로모터 서열,- 이에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 1의 서열 또는 그의 기능적 동족체에 대한 안티센스 서열,- 이에 작동가능하게 연결된, 미생물에서 기능적인 종결 서열, 및b) a)로부터의 벡터를 미생물에 전달하고, 임의적으로, 벡터를 미생물의 게놈에 통합시키는 단계에 의해 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이a) 하기 핵산 서열을 5'→3' 배향으로 포함하는 벡터를 생성하는 단계;- 해당 미생물에서 기능적인 프로모터 서열,- 이에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 1에 나타낸 서열 또는 그의 기능적 동족체에 상보적인 핵산 서열 또는 이의 일부,- 이에 작동가능하게 연결된, 리보뉴클레아제 P를 코딩하는 DNA 서열,- 이에 작동가능하게 연결된, 해당 미생물에서 기능적인 종결 서열, 및b) a)로부터의 벡터를 미생물에 전달하고, 임의적으로, 벡터를 미생물의 게놈에 통합시키는 단계에 의해 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열 번호 1에 나타낸 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이a) 하기 핵산 서열을 5'→3' 배향으로 포함하는 벡터를 생성하는 단계;- 해당 미생물에서 기능적인 프로모터 서열,- 이에 작동가능하게 연결된, 서열 번호 1의 서열 또는 그의 기능적 동족체를 갖는 핵산의 mRNA를 특이적으로 인식하는 리보좀을 코딩하는 핵산 서열,- 이에 작동가능하게 연결된, 해당 미생물에서 기능적인 종결 서열, 및b) a)로부터의 벡터를 미생물에 전달하고, 임의적으로, 벡터를 미생물의 게놈에 통합시키는 단계에 의해 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이 단백질에 특이적이고 황 함유 화합물의 대사시 단백질의 기능을 차단하는 하나 이상의 재조합 항체의 발현에 의해 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이 서열 번호 1의 서열 또는 그의 동족체를 갖는 핵산 또는 이의 일부에 비해 점 돌연변이(들), 삭제(들) 및/또는 삽입(들)을 함유하는 하나 이상의 비기능적 핵산의 발현에 의해 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 기능적 발현이 미생물의 야생형에 비해 근본적으로 완전히 억제된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 3의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 함량 및/또는 활성이 미생물의 야생형에 비해 추가로 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 서열 번호 3의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의 기능적 발현이 미생물의 야생형에 비해 근본적으로 완전히 억제되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 제6항 또는 제7항 기재의 하나 이상의 핵산의 기능적 발현이 추가로 증가되고(되거나) 제9항 또는 제10항 기재의 하나 이상의 핵산의 기능적 발현이 추가로 억제되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항 기재의 미생물의, 황 함유 화합물, 특히 L-메티오닌 및/또는 L-시스테인 생산 용도.
- 서열 번호 1의 서열을 갖는 핵산과 동일하거나 기능적으로 상동성을 갖는 핵산의, 황 함유 화합물, 특히 L-메티오닌 및/또는 L-시스테인 생산 용도.
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