KR20140002653A

KR20140002653A - 메티오닌 생산을 위한 nadph 이용가능성의 증가

Info

Publication number: KR20140002653A
Application number: KR1020137013386A
Authority: KR
Inventors: 반다 디셔트; 페린느 바스르; 세드리크 보이자르뜨; 라이너 피게
Original assignee: 메타볼릭 익스플로러
Priority date: 2010-10-25
Filing date: 2011-10-24
Publication date: 2014-01-08
Also published as: WO2012055798A1; BR112013009618A2; ES2637280T3; PL2633037T3; US9034611B2; CN103282488A; JP2013539987A; JP2017169576A; EP2633037A1; AR083468A1; CN106906176A; EP2633037B1; US20130183727A1

Abstract

본 발명은 PntAB의 트랜스히드로게나제 활성을 증강시키도록 변형된, 메티오닌의 생산을 위한 미생물에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 트랜스히드로게나제 UdhA의 활성이 상기 미생물에서 약화된다. 또한 본 발명은 발효에 의해 메티오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

메티오닌 생산을 위한 NADPH 이용가능성의 증가{INCREASING NADPH AVAILABILITY FOR METHIONINE PRODUCTION}

발명의 분야

본 발명은 메티오닌 생산을 증강시키기 위해 NADH로부터 생산된 세포내 NADPH 이용가능성을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 유리하게는, NADPH 수준을 증가시키기 위한 방법이 메티오닌 생산을 개선하기 위한 단일 탄소 대사의 증가와 회합된다.

발명의 배경

시스테인, 호모시스테인, 메티오닌 또는 S-아데노실메티오닌과 같은 황-함유 화합물은 세포 대사에 결정적이고, 식품 또는 사료 첨가제 및 제약으로서 사용되도록 공업적으로 생산된다. 특히, 동물이 합성할 수 없는 필수 아미노산인 메티오닌은 다수의 신체 기능에서 중요한 역할을 한다. 단백질 생합성에서의 역할과는 별개로, 메티오닌은 트랜스메틸화(transmethylation) 및 셀레늄 및 아연의 생체이용률에 관여한다. 메티오닌은 알레르기 및 류머티스성 열과 같은 장애의 치료에서 또한 직접적으로 사용된다. 생산되는 메티오닌 대부분은 동물 사료에 첨가된다.

BSE 및 조류 독감(chicken flu)으로 인해 동물에서 유래된 단백질을 사용하는 것이 감소되면서, 순수한 메티오닌에 대한 수요가 증가되었다. 화학적으로, D,L-메티오닌이 통상적으로 아크롤레인, 메틸 메르캅탄 및 시안화수소로부터 생산된다. 그럼에도 불구하고, 예를 들어 닭 사료 첨가제에서와 같이 (문헌 [Saunderson, C.L., (1985) British Journal of Nutrition 54, 621-633]), 라세미 혼합물은 순수한 L-메티오닌만큼 성능이 좋지 않다. 예를 들어 N-아세틸-D,L-메티오닌의 아실라제(acylase) 처리를 통해, 라세미 메티오닌으로부터 순수한 L-메티오닌을 생산할 수 있고, 이는 생산 비용을 극적으로 증가시킨다. 순수한 L-메티오닌에 대한 수요가 증가하는 것이, 환경 문제와 연관되어, 미생물에 의한 메티오닌 생산을 매력적이게 한다.

보조인자 쌍인 NADPH/NADP⁺ 및 NADH/NAD⁺는 모든 살아 있는 유기체에 필수적이다. 이들은 살아 있는 세포에서의 다수의 산화-환원 반응에서 환원 당량의 도너(donor) 및/또는 어셉터(acceptor)이다. 화학적으로 매우 유사하지만, 산화환원 보조인자인 NADH와 NADPH는 별개의 생화학적 기능에서 역할을 하고, 100가지를 초과하는 효소 반응에 참여한다 (문헌 [Ouzonis, C. A., and Karp, P. D. (2000) Genome Res. 10, 568-576]). 이화 반응은 일반적으로 NAD⁺/NADH와 연관되고, 동화 반응은 일반적으로 NADP⁺/NADPH와 연관된다. 전체적으로, 이러한 뉴클레오티드들은 세포에서의 사실상 모든 산화-환원 대사 경로에 직접적인 영향이 있다.

예를 들어, 효모에서의 크실로스 상의 에탄올의 생산 (문헌 [Verho et al., (2003) Applied and Environmental Microbiology 69, 5892-5897]), (+)-카테킨의 고수율 생산 (문헌 [Chemler et al., (2007) Applied and Environmental Microbiology 77, 797-807]), 이. 콜라이(E. coli)에서의 라이코펜 생합성 (문헌 [Alper, H. et al., (2005) Metab. Eng. 7, 155-164]) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에서의 라이신 생산 (문헌 [Kelle T et al., (2005) L-lysine production; In: Eggeling L, Bott M (eds) Handbook of corynebacterium glutamicum. CRC, Boca Raton, pp467-490])과 같이, 다수의 공업적으로 유용한 화합물이 이들의 생합성에 보조인자 NADPH를 필요로 한다.

에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli)로 L-메티오닌을 생물공학적으로 생산하는 것은 충분한 NADPH 풀(pool)을 필요로 한다. 아스파르테이트 아미노산으로부터 메티오닌이 유래되지만, 이의 합성은 2가지 추가적인 경로인 시스테인 생합성 및 C1 대사 (N-메틸테트라히드로폴레이트)의 수렴을 필요로 한다. 아스파르테이트가 일련의 3가지 반응에 의해 호모세린으로 전환된다. 이어서 호모세린이 트레오닌/이소류신 또는 메티오닌 생합성 경로로 진입할 수 있다.

1개의 L-메티오닌 분자의 생산은 8.5 몰의 NADPH를 필요로 한다. 최소 배지 상에서의 이. 콜라이의 성장 및 L-메티오닌 생산 양쪽에 대한 NADPH 요구를 충족시키기 위해, 본 발명자들은 세포 내의 NADPH의 풀을 증가시키기 위한 목적으로 트랜스히드로게나제(transhydrogenase) 활성을 증가시키는 것을 본원에서 제안한다.

막-결합형 양성자-전위 효소 (PntAB) 또는 가용성인 에너지-비의존적 이소형(isoform) 효소 (SthA)에 의해 트랜스히드로게나제 반응 (하기)이 촉매될 수 있다.

이. 콜라이는 sthA (udhA로 또한 칭해짐) 및 pntAB 유전자에 의해 코딩되는 2개의 니코틴아미드 뉴클레오티드 트랜스히드로게나제를 갖추고 있다 (문헌 [Sauer U. et al., 2004, JBC, 279:6613-6619]). 미생물에서의 트랜스히드로게나제 PntAB 및 SthA의 생리학적 기능은 각각 NADPH의 생성 및 재산화이다 (문헌 [Sauer U. et al., 2004, JBC, 279:6613-6619]). 막-결합형 트랜스히드로게나제 PntAB는 전기화학적 양성자 구배를 NADH가 NAD⁺로 산화되는 것에 의해 NADP⁺가 NADPH로 환원되는 것에 대한 구동력으로 사용한다 (문헌 [Jackson JB, 2003, FEBS Lett 545:18-24]).

전체 세포에서의 NADPH의 이용가능성을 개선하기 위해 여러 전략이 사용되었다. 문헌 [Moreira dos Santos et al. (2004)]에서 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 내의 세포질 NADPH 수준을 증가시키기 위해 NADP+-의존적 말산 효소를 사용하는 것이 보고되었다. 문헌 [Weckbecker and Hummel (2004)]에는 아세토페논의 (R)-페닐에탄올로의 NADPH-의존적 전환을 개선하기 위한 이. 콜라이에서의 pntAB의 과발현이 기술되어 있다. 문헌 [Sanchez et al. (2006)]에는 폴리(3-히드록시부티레이트)의 NADPH-의존적 생산을 개선하기 위한 이. 콜라이에서의 가용성 트랜스히드로게나제 SthA의 과발현이 기술되어 있다.

본 발명자들은 박테리아에서 PntAB 활성을 증가시키고 SthA가 촉매하는 반응을 감소시키는 것에 의해 메티오닌 생산이 현저하게 증가된다는 것을 뜻밖에 발견하였다.

또한, 세포에서의 단일 탄소 대사를 증진시키기 위해, 높은 트랜스히드로게나제 활성 및 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제(reductase) (MetF) 활성의 증가를 조합하는 것에서, 변형된 미생물의 발효에 의한 L-메티오닌 생산이 매우 개선된다.

발명의 개요

본 발명은 미생물의 NADPH 생산이 증가된, 메티오닌을 생산하는 미생물에 관한 것이다. NADPH 생산 증가는 단독 변형으로서 또는 UdhA 트랜스히드로게나제 활성의 약화와 조합하여 PntAB 트랜스히드로게나제 활성을 증가시키는 것에 의해 달성된다. 본 발명의 특정한 실시양태에서, NADPH 생산 증가가 단일 탄소 대사 증가와 커플링된다.

또한 본 발명은

- 변형된 메티오닌-생산 미생물을 탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 포함하는 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계, 및

- 배양 배지로부터 메티오닌 및/또는 이의 유도체를 회수하는 단계

를 포함하고, 이때 상기 미생물에서, 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (NADPH)의 생산이 증가되는 방식으로 PntAB의 트랜스히드로게나제 활성이 증강되어 있는 발효 공정에서의 메티오닌 생산 방법에 관한 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 PntAB의 트랜스히드로게나제 활성을 증강시키도록 변형된, 메티오닌의 생산을 위한 미생물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 발효 공정에서의 메티오닌 생산 방법에 관한 것이다.

정의

본 발명은 유전자 발현 또는 단백질 생산 또는 활성을 증강시키기 위한 유전학적 변형을 함유하는 미생물에 관한 것이다.

본 발명의 설명에서, 이. 콜라이에서의 상응하는 유전자의 명칭을 사용하여 유전자 및 단백질이 확인된다. 그러나, 달리 명시되지 않는 한, 이러한 명칭의 사용은 본 발명에 따라 더욱 일반적인 의미를 지니고, 다른 유기체, 더욱 특히 미생물에서의 모든 상응하는 유전자 및 단백질을 포괄한다.

PFAM (정렬 및 은닉 마르코프 모델(hidden Markov) 모델의 단백질 패밀리 데이터베이스; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)은 단백질 서열 정렬의 대형 선집을 나타낸다. 각각의 PFAM은 다중 정렬을 가시화하는 것, 단백질 도메인을 확인하는 것, 생물들에서 분포를 평가하는 것, 다른 데이터베이스에 접근하는 것 및 공지된 단백질 구조를 가시화하는 것을 가능하게 한다.

38개의 주요 계통발생학적 계통을 나타내는 66개의 완전히 서열분석된 게놈들로부터의 단백질 서열들을 비교함으로써 COG (오르토로그성(orthologous) 단백질 군의 클러스터; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)가 수득된다. 각각의 COG는 3개 이상의 계통으로부터 정의되고, 이는 이전의 보존된 도메인의 확인을 허용한다.

상동성 서열 및 이들의 백분율 상동성을 확인하는 수단이 당업자에게 주지되어 있고, 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/로부터 이러한 웹사이트에 지시된 디폴트 파라미터와 함께 사용될 수 있는 BLAST 프로그램이 특히 이에 포함된다. 그 후, 예를 들어, 프로그램 CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) 또는 MULTALIN (http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/)을 이러한 웹사이트들에 지시된 디폴트 파라미터와 함께 사용하여, 수득된 서열을 활용 (예를 들어, 정렬)할 수 있다.

공지된 유전자에 대해 진뱅크(GenBank)에서 제공되는 참조물을 사용하여, 당업자는 다른 유기체, 박테리아 균주, 효모, 진균, 포유동물, 식물 등 내의 등가의 유전자를 결정할 수 있다. 다른 미생물들로부터 유래된 유전자들과의 서열 정렬을 수행함으로써 결정될 수 있는 컨센서스(consensus) 서열을 사용하여, 그리고 또 다른 유기체 내의 상응하는 유전자를 클로닝하기 위해 축퇴성 프로브를 디자인하여, 이러한 일상적인 작업이 유리하게 수행된다. 분자 생물학의 이러한 일상적인 방법이 당업자에게 주지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.]에서 언급되어 있다.

본 발명에 따른 "활성 약화"라는 용어는 효소 또는 유전자에 대해 사용될 수 있고, 각각의 경우에, 상응하는 유전자의 발현의 부분적이거나 완전한 억제를 가리키며, 그러면 상응하는 유전자를 '약화된' 것으로 한다. 이러한 발현 억제는 유전자 발현의 저해, 유전자 발현에 필요한 프로모터 영역의 전체 또는 일부분의 결실, 유전자의 코딩 영역에서의 결실, 또는 야생형 프로모터의 더 약한 천연 또는 합성 프로모터로의 교환일 수 있다. 우선적으로, 유전자 약화는 본질적으로 이러한 유전자의 완전한 억제이고, 이는 본 발명에 따른 균주의 확인, 단리 및 정제를 용이하게 하는 선별 마커 유전자로 교체될 수 있다. 유전자는 우선적으로 상동 재조합 기술에 의해 불활성화된다 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645]).

"증강된 트랜스히드로게나제 PntAB 활성"이라는 용어는 변형되지 않은 미생물의 효소 활성보다 우월한 효소 활성을 가리킨다. 상기 효소의 효소 활성을 측정하는 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 변형되지 않은 미생물에서 관찰되는 활성과 비교하여 PntAB 활성이 10％ 증가된다; 우선적으로는 상기 활성이 20％, 더욱 우선적으로는 30％, 더욱 더 우선적으로는 50％ 증가되거나, 또는 60％ 더 우월하다.

효소 활성을 증강시키기 위해, 여러 수단이 당업자에게 공지되어 있다: 단백질의 촉매 부위를 변형시키는 것, 단백질의 안정성을 증가시키는 것, 메신저 RNA의 안정성을 증가시키는 것, 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 것.

단백질을 안정화시키는 요소들 (예를 들어, GST 태그(tag) (아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences)), 뿐만 아니라 메신저 RNA를 안정화시키는 요소들 (문헌 [Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64])이 당업계에 공지되어 있다.

"증가된 유전자 발현", "증강된 유전자 발현" 또는 "유전자 과발현"이라는 용어들은 본문에서 상호교환가능하게 사용되고, 의미가 유사하다.

유전자 발현을 증가시키기 위해, 여러 기술이 당업자에게 공지되어 있다: 미생물 내의 유전자의 카피수를 증가시키는 것, 높은 수준의 유전자 발현을 유도하는 프로모터를 사용하는 것, 유전자의 직접적인 또는 간접적인 전사 억제인자의 활성 및/또는 발현을 약화시키는 것.

유전자는 염색체적으로 또는 염색체외적으로 코딩된다. 유전자가 염색체 상에 위치하는 경우, 당업계의 전문가에게 공지된 재조합 방법 (유전자 교체 포함)에 의해 유전자의 여러 개의 카피가 염색체 상에 도입될 수 있다. 유전자가 염색체외에 위치하는 경우, 복제 기원에 관하여, 따라서 세포 내에서의 카피수에 관하여 상이한 여러 유형의 플라스미드들이 유전자를 보유한다. 이러한 플라스미드들이 플라스미드의 성질에 따라 1개 내지 5개의 카피, 또는 약 20개의 카피, 또는 500개까지의 카피로 미생물 내에 존재한다: 복제가 엄격한(tight), 카피수가 낮은 플라스미드 (pSC101, RK2), 카피수가 낮은 플라스미드 (pACYC, pRSF1010) 또는 카피수가 높은 플라스미드 (pSK 블루스크립트(bluescript) II).

본 발명의 특정한 실시양태에서, 강도가 상이한 프로모터들을 사용하여 유전자가 발현된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 프로모터들은 유도성이다. 이러한 프로모터들은 상동성 또는 이종성이다. 어떤 프로모터가 가장 편리한지가 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 프로모터 Ptrc, Ptac, Plac 또는 람다 프로모터 cI가 광범위하게 사용된다.

메티오닌의 유도체:

본 발명에 따르면, 배양 배지로부터 메티오닌이 회수된다. 그러나, 배양 배지로부터 메티오닌의 일부 유도체를 회수하는 것이 또한 가능하고, 이는 간단한 반응에서 메티오닌으로 전환될 수 있다. 메티오닌의 유도체들은 메티오닌 변환 및/또는 분해 경로 예컨대 S-아실 메티오닌 및 N-아실 메티오닌 경로로부터 유래된다. 특히, 이러한 생성물은 S-아데노실-메티오닌 (SAM) 및 N-아세틸-메티오닌 (NAM)이다. 특별히, NAM은 탈아실화에 의해 메티오닌으로 단리 및 변환될 수 있는, 용이하게 회수가능한 메티오닌 유도체이다.

미생물

"메티오닌의 생산을 위한 미생물" 또는 "메티오닌-생산 미생물"이라는 용어는 내인성 수요를 위해서만 메티오닌을 생산하는 비-생산 미생물보다 높은 수준의 메티오닌을 생산하는 미생물을 가리킨다. 메티오닌 생산에 "최적화"된 미생물이 당업계에 주지되어 있고, 특히 특허 출원 WO2005/111202, WO2007/077041 및 WO2009/043803에 개시되어 있다.

"변형된 미생물"이라는 용어는 개선된 메티오닌 생산을 위해 변형된 미생물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 이러한 미생물에 의해 생산된 메티오닌의 양, 특히 메티오닌 수율 (그램/몰 탄소 공급원 당 생산된 그램/몰 메티오닌의 비)이 상응하는 미변형 미생물에 비교하여 변형된 미생물에서 더 높다. 일반적인 변형에는 형질전환 및 재조합에 의한 유전자 결실, 유전자 교체, 및 이종 유전자의 발현을 위한 벡터의 도입이 포함된다.

본 발명에서 사용되는 미생물은 박테리아, 효모 또는 진균이다. 우선적으로, 엔테로박테리아과(Enterobacteriaceae), 바실루스과(Bacillaceae), 스트렙토마이세테스과(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아과(Corynebacteriaceae) 중에서 미생물이 선택된다. 더욱 우선적으로, 미생물은 에쉐리키아(Escherichia), 클레브시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea), 살모넬라(Salmonella) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속이다. 더욱 더 우선적으로, 미생물은 에쉐리키아 콜라이 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 종이다.

NADPH 의 증가

본 발명에 따르면, 변형된 미생물은 한편으로는 개선된 메티오닌 생산을 위한 변형을, 또 다른 한편으로는 PntAB의 트랜스히드로게나제 활성을 증가시키는 것에 의한 이용가능한 NADPH의 개선된 생산을 위한 변형을 포함한다.

PntAB는 NADH가 NAD⁺로 산화되는 것을 통해 NADP⁺가 NADPH로 환원되는 것을 촉매하고 각각 pntA 및 pntB 유전자에 의해 코딩되는 2개의 서브유닛인 알파 및 베타로 구성되는 막횡단 피리딘 뉴클레오티드 트랜스히드로게나제이다.

증가된 PntAB 활성은 세포 내의 이용가능한 NADPH의 생산을 증강시킨다. 이는 세포 내의 증가된 농도에 자동적으로 도달하지 않는데, 이용가능한 NADPH가 NADPH 의존적 효소에 의해 직접적으로 소비될 수 있기 때문이다. 이러한 문맥에서의 "증가된 PntAB 활성"이라는 용어는, 예를 들어 유전자의 카피수를 증가시키는 것, 더 강한 프로모터를 사용하는 것 또는 활성이 증가된 대립유전자를 사용하는 것, 그리고 가능하게는 이러한 수단들을 조합하는 것에 의한, 상응하는 pntA 및 pntB 유전자에 의해 코딩되는 트랜스히드로게나제의 세포내 활성에서의 증가를 기술한다.

본 발명의 특정한 실시양태에서, pntAB를 코딩하는 유전자가 과발현된다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 높은 강도를 나타내는 프로모터를 사용하여 pntAB 유전자가 과발현된다. 이같은 프로모터들은, 예를 들어, 각각 특이적인 강도를 나타내는 Ptrc 패밀리에 속하는 것들이다. Ptrc 프로모터는 전형적인 이. 콜라이 프로모터 Plac 및 Ptrp, 특히 Plac의 -35 박스 및 Ptrp의 -10 박스의 컨센서스 서열을 나타내는 인공 하이브리드 프로모터이다 (문헌 [Amann et al., 1983, Gene and Amann et al., 1988, Gene). 본 발명자들은 강도가 상이한 일련의 프로모터를 수득하기 위해 홀리(Hawley) 연구 (문헌 [Hawley & McClure, 1983, Nucleic Acids Research])에서의 프로모터 비교에 따라 -10 또는 -35 박스의 컨센서스 서열을 변형시킴으로써 이러한 인공 프로모터를 변형시켰다. 서열이 컨센서스 -10 및 -35 박스와 더 많이 상이할수록, 프로모터의 강도가 더 낮다. 본 발명에서 사용된 Ptrc 프로모터들은 숫자로 칭량되는 지명된 Ptrc이다: 숫자가 높을수록, 인공 프로모터 서열과 컨센서스 서열 사이의 차이가 더 크다.

본 발명의 특정한 실시양태에서, UdhA 활성의 약화와 조합하여 PntAB 활성을 증가시키는 것에 의해 이용가능한 NADPH의 증가가 수득된다. UdhA는 본질적으로 NAD⁺가 NADH로 환원되는 것을 통해 NADPH가 NADP⁺로 산화되는 것을 촉매하는 가용성 피리딘 뉴클레오티드 트랜스히드로게나제이다.

상기에 기술된 바와 같이, 상응하는 udhA 유전자를 부분적으로 또는 완전히 억제하는 것에 의해, udhA 유전자의 발현을 저해하는 것에 의해, 유전자 발현에 필요한 프로모터 영역 전체 또는 일부분을 결실시키는 것에 의해, 유전자의 코딩 영역의 결실에 의해, 또는 야생형 프로모터의 더 약한 천연 또는 합성 프로모터로의 교환에 의해 UdhA 활성의 약화가 달성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상동 재조합에 의한 udhA 유전자의 완전한 결실에 의해 UdhA 활성의 약화가 달성된다.

C1 대사

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 증가된 NADPH 생산이 메티오닌-생산 미생물에서의 단일 탄소 대사 (C1 대사로 언급됨)의 증가와 커플링된다. C1 대사는 당업자에게 주지되어 있고, 폴레이트 대사화를 기초로 한다. 폴레이트가 폴레이트 리덕타제에 의해 디히드로폴레이트로 환원된 후, 디히드로폴레이트 리덕타제에 의해 테트라히드로폴레이트 (THF로 언급됨)로 환원된다. THF는 DNA 염기 및 아미노산 생합성에 관여하는 화합물이다.

THF는 글리신 또는 세린으로부터 유래되는 메틸렌 기를 수용하여, 메틸렌-THF를 형성한다. THF로의 메틸렌 기 전달은 세린의 경우에는 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제(transferase) (GlyA)에 의해, 또는 글리신의 경우에는 글리신 절단 복합체 (GcvTHP)에 의해 촉매된다. 글리신 절단 복합체 (GCV)는 글리신의 산화를 촉매하여 이산화탄소, 암모니아, 메틸렌-THF 및 환원된 피리딘 뉴클레오티드를 산출하는 다효소 복합체이다. GCV 복합체는 P-단백질로 언급되는 글리신 데히드로게나제(dehydrogenase) (GcvP), H-단백질로 언급되는 리포일-GcvH-단백질 (GcvH), T-단백질로 언급되는 아미노메틸트랜스퍼라제 (GcvT), 및 L-단백질로 언급되는 디히드로피로아미드 데히드로게나제 (GcvL 또는 Lpd)인 4개의 단백질 성분으로 이루어진다. P-단백질은 글리신으로부터의 CO2의 피리독살 포스페이트-의존적 유리를 촉매하여, 메틸아민 모이어티(moiety)를 남긴다. 이러한 메틸아민 모이어티가 글리신의 탈카르복실화 전에 P-단백질에 결합된 H-단백질의 리포산 기로 전달된다. T-단백질이 메틸아민 기로부터의 NH3의 방출을 촉매하고, 남은 C1 유닛을 THF로 전달하여, 메틸렌-THF를 형성시킨다. 그 후, L 단백질이 H-단백질의 리포산 성분을 산화시키고, 전자를 NAD+로 전달하여, NADH를 형성시킨다.

메티오닌 생합성에서, 메틸렌-THF가 메틸렌 테트라히드로폴레이트 리덕타제 (MetF)에 의해 환원되어 메틸-THF를 형성할 수 있다. 메틸-THF는 메티오닌을 형성하기 위한 메틸트랜스퍼라제 MetE 또는 MetH에 의한 호모시스테인의 메틸화 동안에 메틸 공여체이다.

C1 대사를 증가시키는 것은 개선된 메티오닌 생산에 이른다.

본 발명에 따르면, "C1 대사를 증가시키는 것"은 MetF, GcvTHP, Lpd, GlyA, MetE 또는 MetH에서 선택된 C1 대사에서 수반되는 하나 이상의 효소의 활성의 증가와 관련된다. 효소 활성을 증가시키기 위해, 이러한 여러 효소의 상응하는 유전자가 과발현될 수 있거나, 활성이 개선된 효소를 발현하도록 이들의 핵산 서열이 변형될 수 있거나, 또는 피드백 조절에 대한 이들의 감수성이 감소될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제 MetF의 활성 및/또는 글리신 절단 복합체 GcvTHP의 활성 및/또는 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 GlyA의 활성을 증강시키는 것에 의해 단일 탄소 대사가 증가된다.

본 발명의 특정한 실시양태에서, 유전자 metF를 과발현시키는 것 및/또는 번역을 최적화하는 것에 의해 MetF의 활성이 증강된다.

본 발명의 특정한 실시양태에서, Ptrc 패밀리 프로모터에 속하는 강한 프로모터의 제어 또는 유도성 프로모터, 예컨대 PCT/FR2009/052520 출원에 기술된 바와 같은 온도 유도성 프로모터 P_R의 제어 하에서 유전자를 발현시키는 것에 의해 metF 유전자의 과발현이 달성된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, RNA 안정화제를 사용하는 것에 의해 단백질 MetF의 번역의 최적화가 달성된다. 유전자 과발현을 위한 기타 수단들이 당업계의 전문가에게 공지되어 있고, metF 유전자의 과발현에 사용될 수 있다.

메티오닌 생합성 경로의 최적화:

상기 언급된 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 변형된 미생물은 이용가능한 NADPH 생산 및 C1 대사에서의 추가적인 변형, 개선된 메티오닌 생산을 위한 개선을 포함할 수 있다.

미생물에서의 메티오닌 생산에 수반되는 유전자들이 당업계에 공지되어 있고, 이는 메티오닌 특이적 생합성 경로에서 수반되는 유전자, 뿐만 아니라 전구체를 제공하는 경로에서 수반되는 유전자 및 메티오닌 소비 경로에서 수반되는 유전자를 포함한다.

효율적인 메티오닌 생산은 메티오닌 특이적 경로 및 전구체를 제공하는 여러 경로의 최적화를 필요로 한다. 메티오닌 생산 균주가 특허 출원 WO2005/111202, WO2007/077041 및 WO2009/043803에서 기술되었다. 이러한 출원들은 본 출원에 참고로 포함된다.

자신의 억제제인 SAM 및 메티오닌에 대한 피드백 감수성이 감소된 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제 대립유전자들을 과발현하는 메티오닌 생산 균주가 특허 출원 WO2005/111202에 기술되어 있다. 이러한 출원은 이러한 대립유전자들을 메티오닌 레귤론(regulon)의 하향조절을 담당하는 메티오닌 억제인자 MetJ의 결실과 조합하는 것을 또한 기술한다. 또한, 이러한 2가지 변형을 아스파르토키나제(aspartokinase)/호모세린 데히드로게나제의 과발현과 조합하는 것이 출원에 기술되어 있다.

메티오닌 생산을 개선하기 위해, 미생물이 하기를 나타낼 수 있다:

- 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 증가:

ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 원형질막주위공간 술페이트 결합 단백질을 코딩하는 cysP,

ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 술페이트 ABC 전달체의 성분을 코딩하는 cysU,

ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 막에 결합된 술페이트 전달 단백질을 코딩하는 cysW,

ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 술페이트 퍼미아제(permease)를 코딩하는 cysA,

ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, O-아세틸 세린 술프히드랄라제(sulfhydralase)를 코딩하는 cysM,

ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 술파이트 리덕타제의 알파 및 베타 서브유닛을 각각 코딩하는 cysI 및 cysJ. 바람직하게는, cysI 및 cysJ가 함께 과발현된다,

ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 아데닐릴술페이트 리덕타제를 코딩하는 cysH,

ㆍ WO2007/077041에 기술된 바와 같은, 세린 아실트랜스퍼라제를 코딩하는 cysE,

ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 포스포글리세레이트 데히드로게나제를 코딩하는 serA,

ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 포스포세린 포스파타제(phosphatase)를 코딩하는 serB,

ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 serC,

ㆍ WO2005/111202에 기술된 바와 같은, S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대한 피드백 감수성이 감소된 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제를 코딩하는 metA 대립유전자,

ㆍ WO2009/043803 및 WO2005/111202에 기술된 바와 같은, 아스파르토키나제/호모세린 데히드로게나제를 코딩하는 thrA 또는 트레오닌에 대한 피드백 억제가 감소된 thrA 대립유전자,

- 또는 하기의 유전자들 중 하나 이상의 발현 억제:

ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 피루베이트 키나제(kinase)를 코딩하는 pykA,

ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 피루베이트 키나제를 코딩하는 pykF,

ㆍ WO2007/077041 및 WO2009/043803에 기술된 바와 같은, 포르밀테트라히드로폴레이트 데포르밀라제(deformylase)를 코딩하는 purU,

ㆍ WO2010/020681에 기술된 바와 같은, N-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 yncA,

ㆍ WO2005/111202에 기술된 바와 같은, 메티오닌 생합성 경로의 억제인자를 코딩하는 metJ.

본 발명의 특정한 실시양태에서, 유전자들이 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 특허 출원 PCT/FR2009/052520에는 유도성 프로모터의 제어 하의 cysE 및 트레오닌에 대한 피드백 억제가 감소된 thrA 대립유전자를 발현한 메티오닌 생산 균주가 기술되어 있다. 이러한 출원은 본 출원에 참고로 포함된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, thrA 유전자 또는 대립유전자는 온도 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 가장 바람직한 실시양태에서, 사용된 온도 유도성 프로모터는 P_R 프로모터들의 패밀리에 속한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 피루베이트 카르복실라제(carboxylase)의 활성이 증강된다. 피루베이트 카르복실라제의 활성을 증가시키는 것은 상응하는 유전자를 과발현시킴으로써 또는 활성이 개선된 효소를 발현하도록 이러한 유전자의 핵산 서열을 변형시킴으로써 수득된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, pyc 유전자가 재조합에 의해 하나의 카피 또는 여러 카피로 염색체 상에 도입되거나, 또는 변형된 미생물 내에 하나 이상의 카피로 존재하는 플라스미드에 보유된다. pyc 유전자는 리조비움 에틀리(Rhizobium etli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 종으로부터 유래된다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 과발현된 유전자는 염색체 상의 이들의 천연 위치에 있거나, 또는 비-천연 위치에서 통합된다. 최적의 메티오닌 생산을 위해, 유전자의 여러 카피가 필요할 수 있고, 이러한 다중 카피가 특정 유전자좌 내로 통합되며, 이의 변형은 메티오닌 생산에 대한 음성적인 영향이 없다.

세포 대사를 방해하지 않으면서 유전자가 통합될 수 있는 유전자좌의 예는 하기와 같다:

본 발명은

- 배양 배지로부터 메티오닌 또는 이의 한 유도체를 회수하는 단계

를 포함하고, 이때 상기 미생물이 PntAB의 증강된 트랜스히드로게나제 활성을 나타내도록 변형된, 메티오닌 생산 방법에 또한 관련된다.

배양 조건

"발효 공정", "배양" 또는 "발효"라는 용어들은 단순 탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 함유하는 적합한 성장 배지 상에서의 박테리아의 성장을 나타내도록 상호교환가능하게 사용된다.

적합한 배양 배지는 미생물의 배양 및 성장에 적합한 배지이다. 이같은 배지는 배양될 미생물에 따라 미생물 발효 업계에 주지되어 있다.

본 발명에 따른 "탄소 공급원"이라는 용어는 미생물의 정상적인 성장을 지지하도록 당업자가 사용할 수 있는 임의의 탄소 공급원을 나타내고, 이는 6탄당 예컨대 글루코스, 갈락토스 또는 락토스; 5탄당; 단당류; 이당류 예컨대 수크로스, 셀로비오스 또는 말토스; 올리고당; 당밀; 전분 또는 이의 유도체; 헤미셀룰로스; 글리세롤 및 이들의 조합물일 수 있다. 특히 바람직한 탄소 공급원은 글루코스이다. 또 다른 바람직한 탄소 공급원은 수크로스이다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 탄소 공급원은 재생가능한 공급 원료(feed-stock)로부터 유래된다. 재생가능한 공급 원료는 원하는 생성물로의 변환을 허용하는 충분한 양으로 짧은 지체 시간 내에 재생될 수 있는 특정 산업 공정에 필요한 원료로 정의된다. 식물성 바이오매스(biomass) (처리 또는 미처리)가 흥미로운 재생가능한 탄소 공급원이다.

본 발명에 따른 "황 공급원"이라는 용어는 술페이트, 티오술페이트, 황화수소, 디티오네이트, 디티오나이트, 술파이트, 메틸메르캅탄, 디메틸디술피드 또는 기타 메틸-캡핑(capped) 술피드 또는 상이한 공급원들의 조합물을 지칭한다. 더욱 우선적으로, 배양 배지 내의 황 공급원은 술페이트 또는 티오술페이트, 또는 이들의 혼합물이다.

"질소 공급원"이라는 용어는 암모늄 염 또는 암모니아 기체에 상응한다. 질소 공급원은 암모늄 또는 암모니아 형태로 공급된다.

본 발명의 특정한 측면에서, 무기 기질, 특히 포스페이트 및/또는 칼륨에 대해 미생물이 제한되거나 고갈되는 조건에서 배양이 수행된다. 유기체를 무기 기질 제한에 적용하는 것은 약한 성장을 여전히 허용하는 공급된 무기 화학물질의 양에 미생물 성장이 좌우되는 조건을 정의한다. 미생물을 무기 기질에 대해 고갈시키는 것은 무기 기질의 부재로 인해 미생물 성장이 완전히 정지되는 조건을 정의한다.

일반적으로 발효는 하나 이상의 단순 탄소 공급원을 함유하고 필요하다면 대사산물의 생산을 위한 공동-기질을 함유하는, 사용될 미생물에 대해 개조된 적합한 배양 배지가 있는 발효기에서 수행된다.

당업자는 본 발명에 따른 미생물에 대한 배양 조건을 정의할 수 있다. 특히, 박테리아를 20℃ 내지 55℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 발효시키고, 더욱 구체적으로는 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum)에 대해서는 약 30℃, 이. 콜라이에 대해서는 약 37℃에서 발효시킨다.

이. 콜라이에 대한 공지된 배양 배지의 예로서, 배양 배지는 M9 배지 (문헌 [Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128]), M63 배지 (문헌 [Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]) 또는 문헌 [Schaefer et al., 1999, Anal. Biochem. 270: 88-96]에서 정의된 바와 같은 배지와 조성이 동일하거나 유사할 수 있다.

씨. 글루타미쿰에 대한 공지된 배양 배지의 예로서, 배양 배지는 BMCG 배지 (문헌 [Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210]) 또는 문헌 [Riedel et al., 2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583]에 기술된 바와 같은 배지와 조성이 동일하거나 유사할 수 있다.

메티오닌 회수

"배양 배지로부터 메티오닌을 회수하는" 작용은 메티오닌 또는 이의 유도체 중 하나, 특히 SAM 및 NAM 및 유용할 수 있는 모든 기타 유도체를 회수하는 작용을 가리킨다.

본 발명은 임의로 최종 생성물 내에 부분적으로 또는 총량으로 (0-100％) 잔존하는 발효 브로스(broth) 및/또는 바이오매스로부터 메티오닌, 이의 전구체 또는 유도체를 단리하는 단계를 포함하는, 메티오닌 생산 방법에 또한 관련된다.

발효 후, L-메티오닌, 이의 전구체 또는 이로부터 유래된 화합물을 회수하고, 필요하다면 정제한다. 배양 배지 내의 메티오닌, S-아데노실-메티오닌 및 N-아세틸-메티오닌과 같은 생산된 화합물의 회수 및 정제 방법이 당업자에게 주지되어 있다 (WO 2005/007862, WO 2005/059155).

임의로, 바이오매스의 0 내지 100％, 우선적으로는 90％ 이상, 더욱 우선적으로는 95％, 더욱 더 우선적으로는 99％ 이상이 발효 생성물의 정제 동안 유지될 수 있다.

임의로, 메티오닌을 회수하기 전에, 메티오닌 유도체인 N-아세틸-메티오닌이 탈아실화에 의해 메티오닌으로 변환된다.

실시예

프로토콜

몇몇 프로토콜이 메티오닌 생산 균주를 구축하는데 사용되었고, 하기의 예에서 기술된다.

프로토콜 1: 상동 재조합에 의한 염색체 변형 및 재조합체의 선별 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000)])

특정 염색체 유전자좌에서의 대립유전자 교체 또는 유전자 파괴를 문헌 [Datsenko. & Wanner (2000)]에 기술된 바와 같이 상동 재조합에 의해 수행하였다. Flp 인식 부위가 측면에 있는, 클로람페니콜 (Cm) 저항성 cat 유전자, 카나마이신 (Km) 저항성 kan 유전자 또는 젠타마이신 (Gt) 저항성 gm 유전자를 pKD3 또는 pKD4 또는 p34S-Gm (문헌 [Dennis et Zyltra, AEM july 1998, p 2710-2715]) 플라스미드를 각각 주형으로 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 생성된 PCR 산물을 사용하여, λ 레드 (γ,β,엑소) 리컴비나제를 발현하는 플라스미드 pKD46이 들어 있는 수용자 이. 콜라이 균주를 형질전환시켰다. 그 후, 항생제-저항성 형질전환체를 선별하고, 돌연변이된 유전자좌의 염색체 구조를 표 2에 열거된 적합한 프라이머로의 PCR에 의해 확인하였다.

pCP20 플라스미드가 들어 있는 클론을 LB에서 37℃에서 배양한 후, 30℃에서 항생제 저항성의 상실에 대해 테스트한 것을 제외하고는, 문헌 [Datsenko. & Wanner (2000)]에 기술된 바와 같이 플라스미드 pCP20을 사용하여 cat, kan 및 gm-저항성 유전자를 제거하였다. 그 후, 항생제 민감성 클론을 표 2에 열거된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인하였다.

프로토콜 2: P1 파지 형질도입

P1 형질도입에 의해 소정의 이. 콜라이 수용자 균주에 염색체 변형을 전달하였다. 이러한 프로토콜은 2개의 단계로 구성된다: (i) 저항성과 관련된 염색체 변형을 함유하는 공여자 균주 상에서의 파지 용해물의 제조 및 (ii) 이러한 파지 용해물에 의한 수용자 균주의 감염.

파지 용해물의 제조

- 관심 있는 염색체 변형이 있는 균주 MG1655의 철야 배양물 100 ㎕를 10 ㎖의 LB + Cm 30 ㎍/㎖ 또는 Km 50 ㎍/㎖ 또는 Gt 10 ㎍/㎖ + 글루코스 0.2％ + CaCl₂ 5 mM에 접종한다.

- 진탕시키면서 30분 동안 37℃에서 인큐베이션한다.

- 제조된 P1 파지 용해물 100 ㎕를 공여체 균주 MG1655 상에 첨가한다 (약 1 × 10⁹개의 파지/㎖).

- 세포가 완전히 용해될 때까지 3시간 동안 37℃에서 진탕시킨다.

- 클로로포름 200 ㎕를 첨가하고, 와동시킨다.

- 10분 동안 4500 g에서 원심분리하여 세포 잔해물을 제거한다.

- 상청액을 멸균 튜브로 옮긴다.

- 용해물을 4℃에서 보관한다.

형질도입

- LB 배지에서 배양된 이. 콜라이 수용자 균주의 철야 배양물 5 ㎖를 10분 동안 1500 g에서 원심분리한다.

- 세포 펠릿을 2.5 ㎖의 MgSO₄ 10 mM, CaCl₂ 5 mM에 현탁시킨다.

- 세포 100 ㎕를 염색체 상의 변형이 있는 균주 MG1655의 P1 파지 100 ㎕로 감염시키고 (테스트 튜브), 대조군 튜브는 P1 파지가 없는 세포 100 ㎕ 및 세포가 없는 P1 파지 100 ㎕이다.

- 진탕시키지 않으면서 30분 동안 30℃에서 인큐베이션한다.

- 각각의 튜브에 1 M 시트르산나트륨 100 ㎕를 첨가하고, 와동시킨다.

- LB 1 ㎖를 첨가한다.

- 진탕시키면서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다.

- 3분 동안 7000 rpm에서 원심분리한다.

- LB + Cm 30 ㎍/㎖ 또는 Km 50 ㎍/㎖ 또는 Gt 10 ㎍/㎖에 플레이팅한다

- 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.

그 후, 항생제-저항성 형질도입체를 선별하고, 돌연변이된 유전자좌의 염색체 구조를 표 2에 열거된 적합한 프라이머로의 PCR 분석에 의해 확인하였다.

I. 실시예 1: 균주 7, MG1655 metA *11 P trc - metH P trcF - cysPUWAM P trcF - cysJIH P trc09-gcvTHP P trc36 - metF :: Km P trc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA Δm a lS:: TTadc - CI857 - P lambdaR *(-35)- thrA *1- cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC :: Gt 의 구축

I.1. 균주 1의 구축

본 출원에 참고로 포함된 특허 출원 WO2007/077041에 메티오닌 생산 균주 1 (표 1)이 기술되어 있다.

I.2. 균주 2의 구축

TTadc - CI857 - PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE 단편을 2 단계로 malS 유전자좌에 삽입하였다. 먼저, 플라스미드 pUC18-DmalS :: TTadc - CI857 - PlambdaR *(-35)- thrA *1-cysE::Km을 구축하고, 다음으로 malS 유전자좌와 상동성인 상류 및 하류 서열을 함유하는 TTadc - CI857 - PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE :: Km 단편을 염색체 내로 도입하였다. 이어서, 저항성 카세트를 프로토콜 1에 따라 제거하였다.

하기에서 제시된 염색체 상의 상이한 유전자좌들에서의 통합에 대한 모든 설명은 동일한 방법을 따른다; 1) 관심 유전자좌의 상류 및 하류 상동성 서열, DNA 단편 및 저항성 카세트를 함유하는 복제 벡터의 구축 2) 관심 염색체 변형을 함유하는 최소 균주 (MG1655)의 구축 및 3) 복합 균주 (이미 여러 변형을 함유하는 MG1655) 내로의 형질도입.

I.2.1. pUC18 -Δ malS :: TTadc - CI857 - PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE :: Km 플라스미드의 구축

특허 출원 PCT/FR2009/052520에 기술되어 있는 플라스미드 pSCB-TTadc -cI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE 및 pUC18-ΔmalS::MCS::Km으로부터 플라스미드 pUC18-ΔmalS :: TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE가 유래된다. 간략하게, ApaI/BamHI로 소화된 TTadc - cI857 - PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE 단편을 pUC18-ΔmalS::MCS-Km의 ApaI 부위와 BamHI 부위 사이에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 DNA 서열분석에 의해 확인하고, pUC18-ΔmalS :: TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)- thrA *1-cysE::Km으로 칭하였다.

I.2.2. 균주 MG1655 metA *11 Δ malS :: TTadc - CI857 -PlambdaR *(-35)-thrA*1-cysE::Km ( pKD46 )의 구축

malS 유전자를 TTadc - CI857 - PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE :: Km DNA 단편으로 교체하기 위해, pUC18-DmalS :: TTadc - CI857 - PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE :: Km을 ScaI 및 EcoRV로 소화시키고, malS 유전자좌와 상동성인 상류 및 하류 서열을 함유하는 남은 소화된 단편 TTadc - CI857 - PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE :: Km을 프로토콜 1에 따라 균주 MG1655 metA *11 pKD46 내로 도입하였다.

카나마이신 저항성 재조합체를 선별하고,ΔmalS :: TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)-thrA*1-cysE::Km 염색체 변형의 존재를 프라이머 Ome 0826-malS-F (서열 1) 및 Ome 0827-malS-R (서열 2) (표 2)로의 PCR 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 확인 및 선별된 균주를 MG1655 metA *11 pKD46 ΔmalS :: TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)-thrA*1-cysE::Km으로 칭했다.

I.2.3. 균주 1 내로의 Δ malS :: TTadc - CI857 - PlambdaR *(-35)- thrA *1-cysE::Km의 형질도입 및 저항성 카세트의 제거

ΔmalS :: TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE :: Km 염색체 변형을 프로토콜 2에 따라 상기에 기술된 균주 MG1655 metA *11 pKD46 Δ malS :: TTadc - CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km으로부터의 P1 파지 용해물과 함께 균주 MG1655 metA*11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 -metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA 내로 형질도입하였다.

카나마이신 저항성 형질도입체를 선별하고, Δ malS :: TTadc - CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE::Km 염색체 변형의 존재를 프라이머 Ome 0826-malS-F (서열 1) 및 Ome 0827-malS-R (서열 2) (표 2)로의 PCR에 의해 확인하였다. 생성된 균주의 유전자형은 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU ΔyncA Δ malS :: TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE :: Km이다.

마지막으로, 상기 균주의 카나마이신 저항성을 프로토콜 1에 따라 제거하였다.

카나마이신 저항성 카세트의 상실을 프라이머 Ome 0826-malS-F (서열 1) 및 Ome 0827-malS-R (서열 2) (표 2)을 사용함으로써 PCR에 의해 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE를 균주 2로 칭하였다.

I.3. 균주 3의 구축

I.3.1. 플라스미드 pUC18 -Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc - PlambdaR *(-35)- RBS01 -thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm의 구축

하기에 기술된 플라스미드 pCL1920-TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1-cysE-PgapA-metA*11 및 pUC18-Δ pgaABCD :: TT02-MCS::Cm으로부터 플라스미드 pUC18-Δp gaAB CD:: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE - PgapA - metA *11:: Cm이 유래된다.

플라스미드 pCL1920 - TTadc - P lambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE - P gapA - metA *11 의 구축

특허 출원 PCT/FR2009/052520에 기술된 플라스미드 pCL1920-TTadc - CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11로부터 플라스미드 pCL1920-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11이 유래된다.

플라스미드 pCL1920-TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE - PgapA - metA *11을 구축하기 위해, 플라스미드 pCL1920-TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE-PgapA-metA*11을 프라이머 PR-RBS01_F (서열 3) 및 TTadc-pCL1920_R (서열 4)로 증폭시켰다. 모 DNA 주형을 제거하기 위해 PCR 생성물을 DpnI로 소화시켰다. 남은 점착성(cohesive) 돌출부를 인산화시키고, 이. 콜라이 균주 내로 도입하여, 플라스미드 pCL1920-TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA - metA *11을 형성시켰다. TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA - metA *11 삽입물, 특히 thrA 유전자의 상류의 RBS01 서열의 존재를 하기의 프라이머들을 사용하여 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.

PR-RBS01_F (서열 3)

[서열에서,

- 대문자 서열은 람다 박테리오파지 P_R 프로모터 (PlambdaR *(-35), 문헌 [Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148]; [Tsurimoto T, Hase T, Matsubara H, Matsubara K, Mol Gen Genet. 1982;187(1):79-86])와 상동성이고,

- 밑줄친 대문자 서열은 PsiI 제한 부위가 있는 RBS01 서열에 상응하고

- 볼드체 대문자 서열은 thrA의 5' 끝부분 (1-20)에 상응한다]

TTadc-pCL1920_R (서열 4)

[서열에서,

- 대문자 서열은 TTadc 전사 종결인자 서열 (pSLO1 메가플라스미드의 179847 내지 179807과 상동성인, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)으로부터의 adc 유전자의 전사 종결인자)와 상동성이고.

- 볼드체 대문자 서열은 pCL1920-TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE-PgapA -metA*11 플라스미드와 상동성이다]

pUC18 -Δ pgaABCD :: TT02 - MCS :: Cm 플라스미드의 구축

Δ pgaABCD :: TT02 - MCS :: Cm 단편을 구축하기 위해, pgaA의 상류 영역 (uppgaA), TT02 전사 종결인자, 다중 클로닝 부위 (MCS) 및 pgaD의 하류 영역 (downpgaD)을 PCR로 연결시켰다. 이어서 클로람페니콜 카세트 (Cm)를 증폭시키고, 앞의 구축물에 부가하였다.

먼저, uppgaA-TT02를 이. 콜라이 MG1655 게놈 DNA로부터 프라이머 Ome 1687-ΔpgaABCD_amont_EcoRI_F (서열 5) 및 Ome 1688-ΔpgaABCD_amont_TT02_BstZ17I_R (서열 6)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 그 후, TT02-MCS-down-pgaD 단편을 이. 콜라이 MG1655 게놈 DNA로부터 프라이머 Ome 1689-ΔpgaABCD_aval_MCS_BstZ17I_F (서열 7) 및 Ome 1690-ΔpgaABCD_aval_EcoRI_R (서열 8)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 프라이머 Ome 1688-ΔpgaABCD_amont_TT02_BstZ17I_R (서열 6) 및 Ome 1689-ΔpgaABCD_aval_MCS_BstZ17I_F (서열 7)는 뉴클레오티드 36개 길이의 영역에 걸쳐 중첩되도록 디자인되었다. 마지막으로, uppgaA-TT02-MCS-downpgaD 단편을 uppgaA-TT02 및 TT02-MCS-down-pgaD 증폭 생성물을 프라이머 Ome 1687-ΔpgaABCD_amont_EcoRI_F (서열 5) 및 Ome 1690-ΔpgaABCD_aval_EcoRI_R (서열 8)을 사용하여 혼합함으로써 증폭시켰다. 생성된 융합 PCR 생성물을 HpaI로 소화시키고, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제(Polymerase) I의 대형 (클레노우(Klenow)) 단편으로 처리된 pUC18 플라스미드의 HindIII와 EcoRI 사이에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 DNA 서열분석에 의해 확인하고, pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS로 칭하였다.

Ome 1687-ΔpgaABCD_amont_EcoRI_F (서열 5)

[서열에서,

- 볼드체 대문자 서열은 HpaI 및 EcoRI 제한 부위 및 여분 염기((extrabase)에 대한 것이고,

- 대문자 서열은 pgaA 유전자의 상류의 서열 (1092609-1092576, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)과 상동성이다]

Ome 1688-ΔpgaABCD_amont_TT02_BstZ17I_R (서열 6)

[서열에서,

- 볼드체 대문자 서열은 BstZ17I 제한 부위 및 여분 염기에 대한 것이고,

- 밑줄친 대문자 서열은 이. 콜라이 rrnB의 전사 종결인자 T ₁ (문헌 [Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9])에 상응하며,

- 대문자 서열은 pgaA 유전자의 상류의 서열 (1091829-1091851, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)과 상동성이다]

Ome 1689-ΔpgaABCD_aval_MCS_BstZ17I_F (서열 7)

[서열에서,

　- 볼드체 대문자 서열은 이. 콜라이 rrnB의 전사 종결인자 T ₁ (문헌 [Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9])의 3' 끝부분 서열에 상보적이고,

　- 밑줄친 대문자 서열은 BstZ17I, HindIII, PacI, ApaI, BamHI인 MCS 다중 클로닝 부위를 함유하며,

- 대문자 서열은 pgaD 유전자의 상류의 서열 (1085325-1085304, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)과 상동성이다]

Ome 1690-ΔpgaABCD_aval_EcoRI_R (서열 8)

[서열에서,

- 볼드체 대문자 서열은 HpaI 및 EcoRI 제한 부위 및 여분 염기에 대한 것이고,

- 대문자 서열은 pgaD 유전자의 상류의 서열 (1084714-1084733, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)과 상동성이다]

마지막으로, 프라이머 Ome 1603-K7_Cm_ampl_SmaI_BstZ17I_F (서열 9) 및 Ome 1604-K7_Cm_ampl_HindIII_R (서열 10)을 사용하여 클로람페니콜 카세트 및 FRT 서열을 플라스미드 pKD3으로부터 증폭시키고, 이러한 단편을 플라스미드 pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS의 BstZ17I 부위와 HindIII 부위 사이에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 DNA 서열분석에 의해 확인하고, pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS::Cm으로 칭하였다.

Ome 1603- K7_Cm_ampl_SmaI_BstZ17I_F (서열 9)

[서열에서,

- 밑줄친 대문자 서열은 BstZ17I 및 SmaI 제한 부위 및 여분 염기에 대한 것이고,

- 대문자 서열은 플라스미드 pKD3의 부위 프라이머 1 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645])에 상응한다]

Ome 1604-K7_Cm_ampl_HindIII_R (서열 10)

[서열에서,

- 밑줄친 대문자 서열은 HindIII 제한 부위 및 여분 염기에 대한 것이고,

- 대문자 서열은 pKD3 플라스미드의 부위 프라이머 2 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645])에 상응한다]

pUC18 -Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc - P lambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE - P gapA -metA*11::Cm 의 구축

pUC18-ΔpgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11::Cm을 구축하기 위해, 상기에 기술된 pCL1920-TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11로부터 단리된 ApaI/BamHI 단편 TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11을 상기에 기술된 플라스미드 pUC18-ΔpgaABCD::TT02-MCS::Cm의 ApaI 부위와 BamHI 부위 사이에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 DNA 서열분석에 의해 확인하고, pUC18-ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm으로 칭하였다.

I.3.2. 균주 MG1655 metA *11 Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc - PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm ( pKD46 )의 구축

pgaABCD 오페론을 TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11::Cm 영역으로 교체하기 위해, pUC18-ΔpgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm을 SapI 및 AatII 제한 효소로 소화시키고, 남은 소화된 단편 ΔpgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1-cysE-PgapA-metA*11::Cm을 프로토콜 1에 따라 균주 MG1655 metA *11 pKD46 내로 도입하였다.

클로람페니콜 저항성 재조합체를 선별하고, ΔpgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm 염색체 변형의 존재를 프라이머 Ome 1691-DpgaABCD_verif_F (서열 11) 및 Ome 1692-DpgaABCD_verif_R (서열 12) (표 2)로의 PCR 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 확인 및 선별된 균주를 MG1655 metA *11 Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11::Cm (pKD46)으로 칭하였다.

I.3.3. 균주 2 내로의 Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc - PlambdaR *(-35)- RBS01 -thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm의 형질도입

Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11::Cm 염색체 변형을 프로토콜 2에 따라 상기에 기술된 균주 MG1655 metA *11 pKD46 Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc - PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11::Cm으로부터의 P1 파지 용해물과 함께 상기에 기술된 균주 2 (표 1) 내로 형질도입하였다.

클로람페니콜 저항성 형질도입체를 선별하고, ΔpgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm 염색체 변형의 존재를 Ome 1691-DpgaABCD_verif_F (서열 11) 및 Ome 1692-DpgaABCD_verif_R (서열 12) (표 2)로의 PCR에 의해 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF -cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δp y kF Δ pykA Δ purU Δ yncA Δ malS :: TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm을 균주 3으로 칭하였다.

I.4. 균주 4의 구축

I.4.1. pUC18 -Δ uxaCA :: TT07 - TTadc - PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE -PgapA-metA*11::Km 플라스미드의 구축

플라스미드 pUC18-ΔuxaCA::TT07-MCS-Km을 구축하기 위해, ΔuxaCA::TT07-MCS-Km 단편을 이. 콜라이 MG1655 ΔuxaCA::TT07-MCS-Km 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 PCR에 의해 수득하고, pUC18 (문헌 [Norrander et al., 1983, Gene 26,101-106]) 내로 클로닝하였다.

균주 MG1655 Δ uxa CA :: TT07 - MCS - Km pKD46 의 구축

uxaCA 영역을 TT07-MCS-Km 단편으로 교체하기 위해, 프라이머 Ome 1506-DuxaCA-MCS-F (서열 13) 및 Ome 1507-DuxaCA-MCS-R (서열 14)을 사용하여 pKD4 플라스미드로부터 카나마이신 저항성 카세트를 증폭시키는 것을 제외하고는 프로토콜 1을 사용하였다.

Ome 1506-DuxaCA-MCS-F (서열 13)

[서열에서,

- 이탤릭체 대문자 서열은 uxaCA 유전자좌의 상류의 서열 (3242797-3242724, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)과 상동성이고,

- 밑줄친 대문자 서열은 파지 T7으로부터의 T7Te 전사 종결인자 서열 (문헌 [Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24])에 대한 것이고,

　- 대문자 서열은 플라스미드 pKD4의 프라이머 부위 2 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645])에 상응한다]

Ome 1507-DuxaCA-MCS-R (서열 14)

[서열에서,

- 이탤릭체 대문자 서열은 uxaCA 유전자좌의 하류의 서열 (3239830-3239879, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)과 상동성이고,

- 밑줄친 대문자는 제한 부위 ApaI, BstZ17I, SacII, XhoI, AvaI, BamHI, SmaI, KpnI, SacI, EcoRI의 서열을 함유하는 MCS에 대한 영역이고,

- 대문자는 플라스미드 pKD4의 프라이머 부위 1 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645])에 상응한다]

카나마이신 저항성 재조합체를 선별하고, 저항성 카세트의 삽입을 프라이머 Ome 1612-uxaCA_R3 (서열 15) 및 Ome 1774-DuxaCA_F (서열 16) (표 2)로의 PCR 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 확인 및 선별된 균주를 MG1655 ΔuxaCA::TT07-MCS-Km pKD46으로 칭하였다.

플라스미드 pUC18 -Δ uxa CA :: TT07 - MCS :: Km 의 구축

ΔuxaCA::TT07-MCS-Km 영역을 프라이머 Ome 1515-uxaCA-R2 (서열 17) 및 Ome 1516-uxaCA-F2 (서열 18)와 함께 주형으로서의 상기에 기술된 이. 콜라이 MG1655 ΔuxaCA::TT07-MCS-Km 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭시켰다.

Ome 1515-uxaCA R2 (서열 17)

uxaCA 유전자좌의 하류의 서열 (3239021-3239044)과 상동성인,

Ome 1516-uxaCA F2 (서열 18)

[서열에서,

- 밑줄친 대문자 서열은 제한 부위 EcoRV 및 여분 염기에 대한 것이고,

- 이탤릭체 대문자 서열은 uxaCA 유전자좌의 상류의 서열 (3243425-3243402)과 상동성이다]

그 후, 생성된 PCR 생성물 (평활-말단(blunt-end) DNA 폴리머라제로 수득됨)을 제한 효소 EcoRV로 소화시키고, pUC18의 SmaI 부위 내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 DNA 서열분석에 의해 확인하고, pUC18-ΔuxaCA::TT07-MCS-Km으로 칭하였다.

pUC18 -Δ uxa CA - TT07 - TTadc - P lambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE - P gapA - metA *11:: Km 의 구축

pUC18-ΔuxaCA-TT07 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11::Km을 구축하기 위해, 상기에 기술된 pCL1920-TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11로부터의 ApaI/BamH1로 소화된 TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 단편을 상기에 기술된 pUC18-ΔuxaCA::TT07-MCS-Km의 ApaI 및 BamHI 부위 내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 DNA 서열분석에 의해 확인하고, pUC18-ΔuxaCA-TT07 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA-metA*11::Km으로 칭하였다.

I.4.2. 균주 MG1655 metA *11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc - PlambdaR *(-35)- RBS01 -thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ( pKD46 )의 구축

uxaCA 오페론을 TT07 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11::Km 영역으로 교체하기 위해, pUC18-Δ uxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km을 BamHI 및 AhdI로 소화시키고, 남은 소화된 단편 ΔuxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11::Km을 프로토콜 1에 따라 균주 MG1655 metA *11 pKD46 내로 도입하였다.

카나마이신 저항성 재조합체를 선별하고, ΔuxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km 염색체 변형의 존재를 프라이머 Ome 1612-uxaCA_R3 (서열 15) 및 Ome 1774-DuxaCA_F (서열 16) (표 2)로의 PCR 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 생성된 균주를 MG1655 metA *11 Δ uxaCA :: TT07 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km (pKD46)으로 명명하였다.

I.4.3. 균주 3 내로의 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc - PlambdaR *(-35)- RBS01 -thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km의 형질도입

ΔuxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA - metA *11:: Km 염색체 변형을 프로토콜 2에 따라 상기에 기술된 균주 MG1655 metA *11 pKD46 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km으로부터의 P1 파지 용해물과 함께 상기에 기술된 균주 3 (표 1) 내로 형질도입하였다.

Δ uxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA - metA *11:: Km 염색체 변형을 Ome 1612-uxaCA_R3 (서열 15) 및 Ome 1774-DuxaCA_F (서열 16) (표 2)로의 PCR에 의해 확인하였다. 생성된 균주를 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF -cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δp y kF Δ pykA Δ purU Δ yncA Δ malS :: TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km으로 칭하였다

마지막으로, 상기 균주의 클로람페니콜 및 카나마이신 저항성 카세트를 프로토콜 1에 따라 제거하였다. 클로람페니콜 및 카나마이신 저항성 카세트의 상실을 프라이머 Ome 1691-DpgaABCD_verif_F (서열 11), Ome 1692-DpgaABCD_verif_R (서열 12), Ome 1612-uxaCA_R3 (서열 15) 및 Ome 1774-DuxaCA_F (서열 16) (표 2)로의 PCR에 의해 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF ΔpykA Δ purU Δ yncA Δ malS :: TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11을 균주 4로 칭하였다.

I.5. 균주 5의 구축

I.5.1. 플라스미드 pMA - DCP4 -6:: TT02 - TTadc - PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE -PgapA-metA*11::Km의 구축

상기에 기술된 pCL1920-TTadc -PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11 및 하기에 기술된 pMA-ΔCP4 -6:: TT02-MCS::Km으로부터 플라스미드 pMA-ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km이 유래된다.

플라스미드 pMA -Δ CP4 -6:: TT02 - MCS :: Km 의 구축

먼저, 진아트(GeneArt) (http://www.geneart.com/)에 의해 pMA-ΔCP4 -6::TT02-MCS를 합성하였다. ΔCP4 -6:: TT02-MCS 단편을 플라스미드 pMA의 AscI 및 PacI 부위 내로 클로닝하였고, 이는 서열 19로 확인되는 하기의 서열을 함유한다:

[서열에서,

- 소문자는 AscI, StuI 및 AvrII 제한 부위에 상응하고,

- 밑줄친 소문자는 CP4 -6 유전자좌의 상류의 서열 (260955-261980, http://ecogene.org/)과 상동성이고.

- 볼드체 대문자는 이. 콜라이 rrnB 유전자의 T ₁ 으로부터의 TT02 전사 종결인자 서열 (문헌 [Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9])에 상응하고,

　- 이탤릭체 대문자 서열은 BstZ17I, HindIII, ApaI, SmaI 및 BamH1 제한 부위를 함유하는 MCS에 상응하고,

- 대문자는 CP4 -6 유전자좌의 하류의 서열 (296511-297581, http://ecogene.org/)과 상동성이며,

- 밑줄친 소문자는 KpnI 및 PacI 제한 부위에 상응한다]

다음으로, 프라이머 Ome 1605-K7_Km_ampl_SmaI_BstZ17I_F (서열 20) 및 Ome 1606-K7_Km_ampl_HindIII_R (서열 21)을 사용하여, 플라스미드 pKD4로부터 카나마이신 카세트를 증폭시키고, 이어서 이를 pMA-ΔCP4 -6:: TT02-MCS의 BstZ17I 부위와 HindIII 부위 사이에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 DNA 서열분석에 의해 확인하고, pMA-ΔCP4 -6:: TT02-MCS-Km으로 칭하였다.

Ome 1605-K7_Km_ampl_SmaI_BstZ17I_F (서열 20)

[서열에서,

- 밑줄친 대문자 서열은 BstZ17I 및 SmaI 제한 부위 및 여분 염기에 대한 것이고,

- 대문자 서열은 플라스미드 pKD4의 부위 프라이머 1 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645])에 상응한다]

Ome 1606-K7_Km_ampl_HindIII_R (서열 21)

[서열에서,

- 대문자 서열은 플라스미드 pKD4의 부위 프라이머 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645])에 상응한다]

pMA-ΔCP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11::Km을 구축하기 위해, 상기에 기술된 pCL1920-TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 -thrA*1-cysE-PgapA-metA*11로부터의 ApaI/BamHI로 소화된 TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 단편을 상기에 기술된 pMA-ΔCP4-6:: TT02-MCS-Km의 ApaI 및 BamHI 부위 내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 DNA 서열분석에 의해 확인하고, pMA-Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11::Km으로 칭하였다.

I.5.2. 균주 MG1655 metA *11 DCP4 -6:: TT02 - TTadc - PlambdaR *(-35)- RBS01 -thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km ( pKD46 )의 구축

CP4 -6 오페론을 TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11::Km 단편으로 교체하기 위해, 플라스미드 pMA-Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km을 KpnI 및 AvrII로 소화시키고, 남은 소화된 단편 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA-metA*11::Km을 프로토콜 1에 따라 균주 MG1655 metA *11 pKD46 내로 도입하였다.

카나마이신 저항성 재조합체를 선별하고, ΔCP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km 염색체 변형의 존재를 프라이머 Ome1775-DCP4-6_verif_F (서열 22) 및 Ome1776-DCP4-6_verif_R (서열 23) (표 2)로의 PCR 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 생성된 균주를 MG1655 metA *11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km (pKD46)으로 칭하였다.

I.5.3. 균주 4 내로의 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc - PlambdaR *(-35)- RBS01 -thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km의 형질도입 및 저항성 카세트의 제거

ΔCP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA - metA *11:: Km 염색체 변형을 프로토콜 2에 따라 상기에 기술된 균주 MG1655 metA *11 pKD46 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km으로부터의 P1 파지 용해물과 함께 상기에 기술된 균주 4 (표 1) 내로 형질도입하였다.

카나마이신 저항성 형질도입체를 선별하고, Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km 염색체 변형의 존재를 Ome1775-DCP4-6_verif_F (서열 22) 및 Ome1776-DCP4-6_verif_R (서열 23) (표 2)로의 PCR에 의해 확인하였다. 생성된 균주를 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF -cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δp y kF Δ pykA Δ purU Δ yncA Δ malS :: TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ CP4 -6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Km으로 칭하였다.

마지막으로, 상기 균주의 카나마이신 저항성 카세트를 프로토콜 1에 따라 제거하였다. 카나마이신 저항성 카세트의 상실을 프라이머 Ome1775-DCP4-6_verif_F (서열 22) 및 Ome1776-DCP4-6_verif_R (서열 23) (표 2)을 사용함으로써 PCR에 의해 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF -cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA ΔpurU Δ yncA Δ malS :: TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE Δ pgaABCD :: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11을 균주 5로 칭하였다.

I.6. 균주 6의 구축

treBC 유전자좌에서 이. 콜라이 포스포글리세레이트 데히드로게나제 및 포스포세린 아미노트랜스퍼라제를 각각 코딩하는 TT02 - serA - serC 영역을 삽입하기 위해, 2-단계 방법을 사용하였다. 먼저, 플라스미드 pMA-ΔtreBC :: TT02 - serA - serC :: Gt를구축하고, 다음으로 treBC 유전자좌와 상동성인 상류 및 하류 영역을 함유하는 ΔtreBC::TT02 - serA - serC :: Gt 단편을 프로토콜 1에 따라 염색체 내로 재조합시켰다.

I.6.1. 플라스미드 pMA -Δ treBC :: TT02 - serA - serC :: Gt 의 구축

하기에 기술된 pMA -Δ treBC :: TT02 - MCS :: Gt, p34S-Gm (문헌 [Dennis et Zyltra, AEM july 1998, p 2710-2715]), 및 특허 출원 PCT/FR2009/052520에 기술되어 있는 pUC18-serA - serC로부터 플라스미드 pMA-ΔtreBC :: TT02 - serA - serC :: Gt가 유래된다.

먼저, 진아트 (http://www.geneart.com/)에 의해 플라스미드 pMA-ΔtreBC::TT02-MCS를 합성하였다. Δ treBC :: TT02-MCS 단편을 진아트로부터의 플라스미드 pMA의 AscI 및 PacI 부위 내로 클로닝하였고, 이는 서열 24로 확인되는 하기의 서열을 함유한다:

[서열에서,

- 소문자는 AscI 제한 부위에 상응하고,

- 밑줄친 대문자는 treBC 유전자좌의 상류의 서열 (4460477-4461034)과 상동성이고,

- 볼드체 대문자는 이. 콜라이 rrnB 유전자의 T ₁ 종결인자로부터의 TT02 전사 종결인자 서열 (문헌 [Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9])에 상응하고,

- 이탤릭체 대문자는 BstZ17I, HindIII, ApaI, SmaI 및 BamH1 제한 부위를 함유하는 다중 클로닝 부위에 상응하고,

- 대문자는 treBC 유전자좌의 하류의 서열 (4464294-4464787)과 상동성이며,

- 이탤릭체 소문자는 PacI 제한 부위에 상응한다]

플라스미드 pMA-Δ treBC :: TT02-MCS::Gt를 구축하기 위해, p34S-Gm을 주형으로 사용하여 프라이머 BstZ17I-FRT-Gt-F (서열 25) 및 HindIII-FRT-Gt-R (서열 26)로의 PCR에 의해 FRT-Gt-FRT 저항성 카세트를 증폭시켰다.

BstZ17I-FRT-Gt-F (서열 25)

[서열에서,

- 밑줄친 대문자 서열은 SmaI 및 BstZ17I 제한 부위 및 여분 염기에 대한 것이고,

- 볼드체 대문자 서열은 FRT 서열 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645])에 상응하고,

- 대문자 서열은 p34S-Gm 상에 위치하는 젠타마이신 유전자의 서열 (문헌 [Dennis et Zyltra, AEM July 1998, p 2710-2715])과 상동성이다]

HindIII-FRT-Gt-R (서열 26)

[서열에서,

그 후, FRT-Gt-FRT PCR 생성물을 pMA-Δ treB :: TT02-MCS의 BstZ17I 부위와 HindIII 부위 사이에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 DNA 서열분석에 의해 확인하고, pMA-ΔtreBC :: TT02-MCS-Gt로 칭하였다.

최종 플라스미드 pMA-Δ treBC :: TT02 - serA - serC :: Gt를 구축하기 위해, pUC18-serA-serC를 HindIII로 소화시키고, 소화된 serA - serC 단편을 HindIII로 선형화된 pMA-Δ treBC :: TT02-MCS-Gt 내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 소화 및 DNA 서열분석에 의해 확인하고, pMA-Δ treBC :: TT02 - serA - serC::Gt로 칭하였다.

I.6.2. 균주 MG1655 metA *11 pKD46 Δ treBC :: TT02 - serA - serC :: Gt 의 구축

treBC 유전자를 TT02 - serA - serC :: Gt 단편으로 교체하기 위해, pMA-ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt를 ApaI 및 SalI로 소화시키고, 남은 소화된 단편 ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt를 프로토콜 1에 따라 균주 MG1655 metA *11 pKD46 내로 도입하였다.

젠타마이신 저항성 재조합체를 선별하고, Δ treBC :: TT02 - serA - serC :: Gt 단편의 존재를 프라이머 Ome 1595-DtreB_verif_F (서열 27) 및 Ome 1596- DtreB_verif_R (서열 28) (표 2)로의 PCR 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 생성된 균주를 MG1655 metA *11 pKD46 Δ treBC :: TT02 - serA - serC :: Gt로 칭하였다.

I.6.3. 균주 5 내로의 Δ treBC :: TT02 - serA - serC :: Gt 의 형질도입

그 후, Δ treBC :: TT02 - serA - serC :: Gt 염색체 변형을 프로토콜 2에 따라 상기에 기술된 균주 MG1655 metA *11 pKD46 Δ treBC :: TT02 - serA - serC :: Gt로부터의 P1 파지 용해물과 함께 균주 5 (표 1) 내로 형질도입하였다.

젠타마이신 저항성 형질도입체를 선별하고, DtreBC::TT02-serA-serC::Gt 염색체 변형의 존재를 Ome 1595-DtreB_verif_F (서열 27) 및 Ome 1596-DtreB_verif_R (서열 28) (표 2)로의 PCR에 의해 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc -metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 -serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA Δ malS :: TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)-thrA*1-cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE -PgapA - metA *11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC::Gt를 균주 6으로 칭하였다.

I.7. 균주 6 내로의 P trc36 - metF :: Km 의 형질도입에 의한 균주 7의 구축

metF 유전자좌에서 염색체 내로 통합된 인공 프로모터로부터의 metF 유전자의 과발현인 균주 MG1655 metA *11 ΔmetJ Ptrc36 - metF :: Km이 특허 출원 WO 2007/077041에 기술되어 있다.

Ptrc36 - metF :: Km 프로모터 구축물을 프로토콜 2에 따라 균주 MG1655 metA *11 Δm e tJ Ptrc36 - metF :: Km으로부터의 P1 파지 용해물과 함께 균주 6 (표 1) 내로 형질도입하였다.

카나마이신 저항성 형질도입체를 선별하고, Ptrc36 - metF :: Km 프로모터 구축물의 존재를 프라이머 Ome0726-PtrcmetF-F (서열 29) 및 Ome0727-PtrcmetF-R (서열 30) (표 2)로의 PCR에 의해 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA ΔpurU Δ yncA Δ malS :: TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE Δ pgaABCD :: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC :: Gt Ptrc36-metF::Km을 균주 7로 칭하였다.

II . 실시예 2 : 균주 9, MG1655 metA *11 P trc - metH P trcF - cysPUWAM P trcF - cysJIH P trc09-gcvTHP P trc36 - metF P trc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA Δ malS :: TTadc - CI857 - P lambdaR *(-35)- thrA *1- cysE Δ pgaABCD :: TT02 -TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC :: Gt P trc01-pntAB::Cm Δ udhA :: Km 의 구축

II .1. 균주 8의 구축

II .1.1. 카나마이신 저항성 카세트의 제거에 의한 MG1655 metA *11 Δ metJ Ptrc36-metF의 구축

특허 출원 WO2007/077041에 기술된 균주 MG1655 metA *11 ΔmetJ Ptrc36 -metF::Km의 카나마이신 저항성을 프로토콜 1에 따라 제거하였다. 카나마이신 저항성 카세트의 상실을 프라이머 Ome0726-PtrcmetF-F (서열 29) 및 Ome0727-PtrcmetF-R(서열 30) (표 2)을 사용함으로써 PCR에 의해 확인하였다. 생성된 균주를 MG1655 metA*11 ΔmetJ Ptrc36 - metF로 칭하였다.

II .1.2. MG1655 metA *11 ΔmetJ Ptrc36 - metF Δ udhA :: Km pKD46 의 구축

MG1655 metA *11 ΔmetJ Ptrc36 - metF에서 udhA 유전자를 결실시키기 위해, 프라이머 Ome0032-DUdhAF (서열 31) 및 Ome0034-DUdhAR (서열 32)을 사용하여 플라스미드 pKD4로부터 카나마이신 저항성 카세트를 증폭시킨 것을 제외하고는 프로토콜 1을 사용하였다.

카나마이신 저항성 재조합체를 선별하였다. 저항성 카세트의 삽입을 프라이머 Oag0055-udhAF2 (서열 33) 및 Oag0056-udhAR2 (서열 34) (표 2)로의 PCR 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 생성된 균주를 MG1655 metA *11 ΔmetJ Ptrc36 - metF Δu d hA:: Km pKD46으로 칭하였다.

Ome0032-DUdhAF (서열 31)

[서열에서,

- 대문자 서열은 udhA 유전자의 상류의 서열 (4158729-4158650, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)과 상동성이고,

- 밑줄친 대문자 서열은 플라스미드 pKD4의 프라이머 부위 1 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645])에 상응한다]

Ome0034-DUdhAR (서열 32)

[서열에서,

- 대문자 서열은 udhA 유전자의 하류의 서열 (4157588-4157667, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)과 상동성이고,

- 밑줄친 대문자 서열은 플라스미드 pKD4의 프라이머 부위 2 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645])에 상응한다]

II .1.3. 균주 6 내로의 Ptrc36 - metF Δ udhA :: Km 의 공동-형질도입

udhA 및 metF 유전자는 각각 89.61 min 및 89.03 min으로 이. 콜라이 염색체 상에서 인접하고, 파지 P1에 2 min의 이. 콜라이 염색체가 패키징(packaging)될 수 있기 때문에, udhA 및 metF 유전자가 공동-형질도입될 수 있다. 이에 의해, 상기에 기술된 Ptrc36 - metF 프로모터 변형 및 Δ udhA :: Km 결실을 프로토콜 2에 따라 상기에 기술된 균주 MG1655 metA *11 Δ metJ Ptrc36 - metF Δ udhA :: Km pKD46으로부터의 P1 파지 용해물을 사용하는 것에 의해 균주 6 (표 1) 내로 공동-형질도입하였다.

카나마이신 저항성 형질도입체를 선별하였다. Ptrc36-metF 프로모터 변형의 존재를 프라이머 Ome0726-PtrcmetF-F (서열 29) 및 Ome0727-PtrcmetF-R (서열 30)로의 PCR에 이어서 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. DudhA::Km 결실의 존재를 프라이머 Oag0055-udhAF2 (서열 33) 및 Oag0056-udhAR2 (서열 34) (표 2)로의 PCR에 의해 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA ΔpurU Δ yncA Δ malS :: TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE Δ pgaABCD :: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC :: Gt ΔudhA::Km를 균주 8로 칭하였다.

II .2. 균주 9의 구축

II .2.1. 균주 MG1655 metA *11 pKD46 Ptrc01 - pntAB :: Cm 의 구축

피리딘 뉴클레오티드 트랜스히드로게나제 알파 및 베타 서브유닛인 PntA 및 PntB의 발현 수준을 증가시키기 위해, 프라이머 Ome1149-Ptrc-pntAF (서열 35) 및 Ome 1150-Ptrc-pntAR (서열 36)을 사용하여 플라스미드 pKD3으로부터 클로람페니콜 저항성 카세트를 증폭시킨 것을 제외하고는 프로토콜 1에 따라 균주 MG1655 metA*11 pKD46 내로 구성적 인공 trc01 프로모터를 pntAB 오페론의 상류에 부가하였다.

클로람페니콜 저항성 재조합체를 선별하였다. 인공 프로모터 Ptrc01의 존재 및 저항성 카세트의 삽입을 프라이머 Ome1151-pntAF (서열 37) 및 Ome1152-pntAR (서열 38) (표 2)로의 PCR 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 생성된 균주를 MG1655 metA *11 pKD46 Ptrc01 - pntAB :: Cm으로 칭하였다.

Ome 1149-Ptrc-pntAF (서열 35)

[서열에서,

- 대문자 서열은 pntA 유전자의 상류의 서열 (1676002-1675941 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)과 상동성이고,

- 밑줄친 대문자 서열은 파지 T7로부터의 T7Te 전사 종결인자 서열 (문헌 [Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24])에 대한 것이고,

　- 이탤릭체 대문자 서열은 플라스미드 pKD3의 프라이머 부위 1 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645])에 상응한다]

Ome 1150-Ptrc-pntAR (서열 36)

[서열에서,

- 대문자 서열은 pntA 유전자의 상류의 서열 (1675875-1675940, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)과 상동성이고,

- 밑줄친 대문자 서열은 trc 프로모터 서열에 대한 것이며,

- 이탤릭체 대문자 서열은 플라스미드 pKD3의 프라이머 부위 2 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645])에 상응한다]

II .2.2. 균주 8 내로의 Ptrc01 - pntAB :: Cm 의 형질도입

Ptrc01 - pntAB :: Cm 프로모터 변형을 프로토콜 2에 따라 상기에 기술된 균주 MG1655 metA *11 pKD46 Ptrc01 - pntAB :: Cm으로부터의 P1 파지 용해물을 사용하는 것에 의해 균주 8 (표 1) 내로 형질도입하였다.

클로람페니콜 저항성 형질도입체를 선별하고, Ptrc01 - pntAB :: Cm 염색체 변형의 존재를 Ome1151-pntAF (서열 37) 및 Ome1152-pntAR (서열 38) (표 2)로의 PCR에 의해 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF -cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA Δ malS :: TTadc -CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC :: Gt Ptrc01-pntAB::Cm Δ udhA :: Km을 균주 9로 칭하였다.

III . 실시예 3 : 균주 10, MG1655 metA *11 P trc - metH P trcF - cysPUWAM P trcF - cysJIH P trc09-gcvTHP P trc36 - ARNmst17 - metF P trc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU ΔyncA Δ malS :: TTadc - CI857 - P lambdaR *(-35)- thrA *1- cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc - P lambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC 의 구축

III .1. 플라스미드 pUC18 - Δ wcaM :: TT02 - TTadc - P lambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1-cysE-PgapA-metA*11::Cm 의 구축

상기에 기술된 플라스미드 pCL1920-TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1-cysE-PgapA-metA*11 및 하기에 기술된 플라스미드 pUC18-Δ wcaM :: TT02-MCS::Cm으로부터 플라스미드 pUC18-Δ wcaM :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA-metA*11::Cm이 유래된다.

III .1.1. 플라스미드 pUC18 -Δwca M :: TT02 - MCS :: Cm 의 구축

DwcaM :: TT02 - MCS :: Cm 단편을 구축하기 위해, wcaM의 상류 영역 (upwcaM), TT02 전사 종결인자, 다중 클로닝 부위 (MCS) 및 wcaM의 하류 영역 (downwcaM) 사이의 중첩 PCR을 수행하고, 이어서 클로람페니콜 카세트 (Cm)를 증폭시키고 클로닝하였다.

먼저, upwcaM-TT02 단편을 이. 콜라이 MG1655 게놈 DNA로부터 프라이머 Ome 1703-DwcaM-HpaI-EcoRI-F (서열 39) 및 Ome 1704-DwcaM-TT02-BstZ17I-R (서열 40)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 그 후, TT02-MCS-downwcaM 단편을 이. 콜라이 MG1655 게놈 DNA로부터 프라이머 Ome 1705-DwcaM-MCS-BstZ17I-F (서열 41) 및 Ome 1706-DwcaM-EcoRI-R (서열 42)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 프라이머 Ome 1704-DwcaM-TT02-BstZ17I-R (서열 40) 및 Ome 1705-DwcaM-MCS-BstZ17I-F (서열 41)는 뉴클레오티드 36개 길이의 영역에 걸쳐 중첩되도록 디자인되었다. 마지막으로, upwcaM-TT02 및 TT02-MCS-downwcaM 앰플리콘(amplicon)을 혼합하고 프라이머 Ome 1703-DwcaM-HpaI-EcoRI-F (서열 39) 및 Ome 1706-DwcaM-EcoRI-R (서열 42)을 사용하는 것에 의해 upwcaM-TT02-MCS-downwcaM 단편을 증폭시켰다. 생성된 융합 PCR 생성물을 HpaI로 소화시키고, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 대형 (클레노우) 단편으로 처리된 플라스미드 pUC18의 HindIII 부위와 EcoRI 부위 사이에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 DNA 서열분석에 의해 확인하고, pUC18-Δ wcaM :: TT02-MCS로 칭하였다.

Ome 1703-DwcaM-HpaI-EcoRI-F (서열 39)

[서열에서,

- 밑줄친 대문자 서열은 HpaI 및 EcoRI 제한 부위 및 여분 염기에 대한 것이고,

- 대문자 서열은 wcaM 유전자의 하류의 서열 (2114909-2114938, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)과 상동성이다]

Ome 1704-DwcaM-TT02-BstZ17I-R (서열 40)

[서열에서,

- 밑줄친 대문자 서열은 이. 콜라이 rrnB의 전사 종결인자 T₁ (문헌 [Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9])에 상응하고,

- 대문자 서열은 wcaM 유전자의 하류의 서열 (2113921-2113950, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)과 상동성이다]

Ome 1705 (DwcaM-MCS-BstZ17I-F) (서열 41)

[서열에서,

- 볼드체 대문자 서열은 이. 콜라이 rrnB의 전사 종결인자 T₁ (문헌 [Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9])의 3' 끝부분 서열에 상보적이고,

- 대문자 서열은 wcaM 유전자의 상류의 서열 (2112496-2112525, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)과 상동성이다]

Ome 1706 (DwcaM-EcoRI-R) (서열 42)

[서열에서,

- 볼드체 대문자 서열은 HpaI 및 EcoRI 제한 부위 및 여분 염기에 대한 것이고,

- 대문자 서열은 wcaM 유전자의 상류의 서열 (2111497-2111527, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)과 상동성이다]

마지막으로, 상기에 기술된 프라이머 Ome 1603- K7_Cm_ampl_SmaI_BstZ17I_F (서열 9) 및 Ome 1604-K7_Cm_ampl_HindIII_R (서열 10)을 사용하여 플라스미드 pKD3으로부터 클로람페니콜 카세트를 증폭시켰다. 그 후, 카세트를 플라스미드 pUC18-ΔwcaM :: TT02-MCS의 BstZ17I 부위와 HindIII 부위 사이에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 DNA 서열분석에 의해 확인하고, pUC18-ΔwcaM :: TT02-MCS-Cm으로 칭하였다.

III .1.2. 플라스미드 pUC18 -Δ wcaM :: TT02 - TTadc - PlambdaR *(-35)- RBS01 -thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm의 구축

pUC18-Δ wcaM :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11::Cm을 구축하기 위해, 상기에 기술된 pCL1920-TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 -thrA*1-cysE-PgapA-metA*11로부터의 ApaI/BamHI로 소화된 TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 단편을 상기에 기술된 pUC18-Δ wcaM :: TT02-MCS-Cm의 ApaI 부위와 BamHI 부위 사이에 클로닝하였다. 수득된 플라스미드를 DNA 서열분석에 의해 확인하고, pUC18-Δ wcaM :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1-cysE-PgapA-metA*11::Cm으로 칭하였다.

III .2. 균주 MG1655 metA *11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc - P lambdaR *(-35)- RBS01 -thrA*1-cysE -P gapA-metA*11::Cm pKD46 의 구축

wcaM 유전자를 TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11::Cm 영역으로 교체하기 위해, 플라스미드 pUC18-Δ wcaM :: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm을 BspHI로 소화시키고, 남은 소화된 단편 Δ wcaM :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11::Cm을 프로토콜 1에 따라 균주 MG1655 metA *11 pKD46 내로 도입하였다.

클로람페니콜 저항성 재조합체를 선별하고, Δ wcaM :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm 염색체 변형의 존재를 프라이머 Ome1707-DwcaM_verif_F (서열 43) 및 Ome1708-DwcaM_verif_R (서열 44) (표 2)로의 PCR 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 확인 및 선별된 균주를 MG1655 metA *11 Δw c aM:: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA - metA *11:: Cm (pKD46)으로 칭하였다.

III .3. 균주 6 내로의 DwcaM :: TT02 - TTadc - PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1-cysE-PgapA-metA*11::Cm의 형질도입 및 저항성 카세트의 제거

Δ wcaM :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA - metA *11:: Cm 염색체 변형을 프로토콜 2에 따라 상기에 기술된 균주 MG1655 metA *11 pKD46 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm으로부터의 P1 파지 용해물과 함께 상기에 기술된 균주 6 (표 1) 내로 형질도입하였다.

클로람페니콜 저항성 형질도입체를 선별하고, Δ wcaM :: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11::Cm 염색체 변형의 존재를 Ome1707-DwcaM_verif_F (서열 43) 및 Ome1708-DwcaM_verif_R (서열 44) (표 2)로의 PCR에 의해 확인하였다. 생성된 균주를 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF ΔpykA Δ purU Δ yncA Δ malS :: TTadc - CI857 - PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ CP4 -6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 -serA-serC::Gt Δ wcaM :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11::Cm으로 칭하였다.

그 후, 상기 균주의 젠타마이신 및 클로람페니콜 카세트를 프로토콜 1에 따라 제거하였다. 젠타마이신 및 클로람페니콜 저항성 카세트의 상실을 각각 프라이머 Ome 1595-DtreB_verif_F (서열 27) 및 Ome 1596-DtreB_verif_R (서열 28) 및 프라이머 Ome1707-DwcaM_verif_F (서열 43) 및 Ome1708-DwcaM_verif_R (서열 44) (표 2)을 사용하는 것에 의해 PCR에 의해 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc-metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07-serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA Δ malS :: TTadc - CI857 -PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1-cysE-PgapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA - metA *11 ΔtreBC::TT02-serA-serC를 균주 10으로 칭하였다.

IV . 실시예 4 : 균주 12, MG1655 metA *11 P trc - metH P trcF - cysPUWAM P trcF - cysJIH P trc09-gcvTHP P trc36 - ARNmst17 - metF P trc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU ΔyncA Δ malS :: TTadc - CI857 - PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc -PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc - P lambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC P trc01 - pntAB :: Cm pCL1920-PgapA-pycre-TT07 의 구축

IV .1. 균주 10 내로의 Ptrc01 - pntAB :: Cm 의 형질도입에 의한 균주 11의 구축

상기 기술된 Ptrc01 - pntAB :: Cm 프로모터 변형을 프로토콜 2에 따라 상기에 기술된 균주 MG1655 metA *11 pKD46 Ptrc01 - pntAB :: Cm으로부터의 P1 파지 용해물을 사용하는 것에 의해 균주 10 (표 1) 내로 형질도입하였다.

클로람페니콜 저항성 형질도입체를 선별하고, Ptrc01 - pntAB :: Cm 염색체 변형의 존재를 프라이머 Ome1151-pntAF (서열 37) 및 Ome1152-pntAR (서열 38) (표 2)로의 PCR에 의해 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF -cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δp y kF Δ pykA Δ purU Δ yncA Δ malS :: TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ CP4 -6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC Ptrc01-pntAB::Cm을 균주 11로 칭하였다.

IV .2. pCL1920 - PgapA - pycRe - TT07 의 구축 및 균주 11 내로의 도입

리조비움 에틀리의 피루베이트 카르복실라제 유전자를 과발현시키기 위해, 플라스미드 pCL1920 (문헌 [Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631])으로부터 유래되는 플라스미드 pCL1920-PgapA - pycRe - TT07을 구축하였다.

PgapA - pycRe - TT07 삽입물을 구축하기 위해, gapA 프로모터, 이의 리보솜 결합 부위 (RBS) 및 리조비움 에틀리의 pycRe 유전자 사이의 중첩 PCR을 사용하였다.

먼저, gapA 프로모터 및 RBS 영역 (gapA 개시 코돈의 상류의 -156 내지 -1 영역에 상응함)을 이. 콜라이 MG1655 게놈 DNA로부터 프라이머 PgapA-SalI-F (서열 45) 및 PgapA-pycRe-R (서열 46)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 그 후, pycRe 유전자를 리조비움 에틀리 CFN 42 게놈 DNA로부터 프라이머 PgapA-pycRe F (서열 47) 및 pycRe-TT07-SmaI-R (서열 48)을 사용하여 증폭시켰다. 프라이머 PgapA-pycRe-R (서열 46) 및 PgapA-pycRe F (서열 47)는 뉴클레오티드 42개 길이의 영역에 걸쳐 중첩되도록 디자인되었다. 마지막으로, 프라이머 PgapA-SalI-F (서열 45) 및 pycRe-TT07-SmaI-R (서열 48)을 사용하여 gapA 프로모터-RBS 및 pycRe 앰플리콘을 혼합함으로써 PgapA - RBSgapA - pycRe - TT07 단편을 증폭시켰다. 생성된 융합 PCR 생성물을 플라스미드 pCL1920의 SalI 부위와 SmaI 부위 사이에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 DNA 서열분석에 의해 확인하고, pCL1920-PgapA-pycRe-TT07로 칭하였다.

PgapA-SalI-F (서열 45)

[서열에서,

- 밑줄친 대문자 서열은 SalI, ClaI, HindIII 및 PmeI 제한 부위 및 여분 염기에 대한 것이고,

- 볼드체 대문자 서열은 gapA 프로모터 서열 (1860640-1860658, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)과 상동성이다]

PgapA-pycRe-R (서열 46)

[서열에서,

- 볼드체 대문자 서열은 gapA 유전자의 프로모터 (1860772-1860791, 웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)와 상동성이고,

- 대문자 서열은 pycRe 유전자의 GTG 개시 코돈이 ATG로 교체된 것을 제외하고는 pycRe 유전자와 상동성이다 (4236889-4236906, 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 상의 참조 서열)].

PgapA-pycRe F (서열 47)

[서열에서,

pycRe-TT07-SmaI-R (서열 48)

[서열에서,

- 밑줄친 대문자 서열은 SmaI, BamHI 및 EcoRI 제한 부위 및 여분 염기에 대한 것이고,

- 대문자 서열은 T7 파지로부터의 T7Te 전사 종결인자 서열 (문헌 [Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24])에 상응하고,

- 이탤릭체 대문자 서열은 XhoI 제한 부위 및 여분 염기에 대한 것이고,

- 볼드체 대문자 서열은 pycRe 유전자의 하류의 서열 (4240332-4240388, 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 상의 참조 서열)과 상동성이다]

그 후, pCL1920-PgapA - pycRe-TT07을 전기천공에 의해 균주 11 (표 1) 내로 도입하였다. 플라스미드 pCL1920-PgapA - pycRe-TT07의 존재를 확인하고, 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 -ARNmst17-metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA Δ malS :: TTadc -CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 -thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1-cysE-PgapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC Ptrc01 - pntAB :: Cm pCL1920-PgapA - pycRe-TT07을 균주 12로 칭하였다.

V. 실시예 5 : 균주 13, MG1655 metA *11 P trc - metH P trcF - cysPUWAM P trcF - cysJIH P trc09-gcvTHP P trc36 - ARNmst17 - metF P trc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU ΔyncA Δ malS :: TTadc - CI857 - PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc -PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc - P lambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC P trc01 - pntAB :: Cm Δu d hA:: Km 의 구축

이전에 기술된 Δ udhA :: Km 결실을 프로토콜 2에 따라 상기에 기술된 균주 MG1655 metA *11 ΔmetJ Ptrc36 - metF Δ udhA :: Km pKD46으로부터의 P1 파지 용해물을 사용하는 것에 의해 균주 11 (표 1) 내로 형질도입하였다.

카나마이신 저항성 형질도입체를 선별하였다. Ptrc36 - ARNmst17 - metF 프로모터 변형의 존재를 프라이머 Ome0726-PtrcmetF-F (서열 29) 및 Ome0727-PtrcmetF-R (서열 30)로의 PCR에 이어서 DNA 서열분석에 의해 확인하고, Δ udhA::Km 결실의 존재를 프라이머 Oag0055-udhAF2 (서열 33) 및 Oag0056-udhAR2 (서열 34) (표 2)로의 PCR에 의해 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA Δ malS :: TTadc - CI857 - PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ CP4 -6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC Ptrc01-pntAB::Cm Δ udhA :: Km을 균주 13으로 칭하였다.

VI . 실시예 6 : 균주 14 MG1655 metA *11 P trc - metH P trcF - cysPUWAM P trcF -cysJIH P trc09 - gcvTHP P trc36 - metF P trc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU ΔyncA Δ malS :: TTadc - CI857 - P lambdaR *(-35)- thrA *1- cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc - P lambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - ser C P trc01 - pntAB :: Cm Δu d hA:: Km 의 구축

udhA 및 metF 유전자는 각각 89.61 min 및 89.03 min으로 이. 콜라이 염색체 상에서 인접하고, 파지 P1에 2 min의 이. 콜라이 염색체가 패키징될 수 있기 때문에, udhA 및 metF 유전자가 공동-형질도입될 수 있다. 이에 의해, 상기에 기술된 Ptrc36-metF 프로모터 변형 및 Δ udhA :: Km 결실을 프로토콜 2에 따라 상기에 기술된 균주 MG1655 metA *11 ΔmetJ Ptrc36 - metF Δ udhA :: Km pKD46으로부터의 P1 파지 용해물을 사용하는 것에 의해 균주 11 (표 1) 내로 공동-형질도입하였다.

카나마이신 저항성 형질도입체를 선별하였다. Ptrc36 - metF 프로모터 변형의 존재를 프라이머 Ome0726-PtrcmetF-F (서열 29) 및 Ome0727-PtrcmetF-R (서열 30)로의 PCR에 이어서 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. Δ udhA :: Km 결실의 존재를 프라이머 Oag0055-udhAF2 (서열 33) 및 Oag0056-udhAR2 (서열 34) (표 2)로의 PCR에 의해 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA ΔpurU Δ yncA Δ malS :: TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE Δ pgaABCD :: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1-cysE-PgapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC Ptrc01 - pntAB :: Cm Δu d hA:: Km을 균주 14로 칭하였다.

VII . 실시예 7 : 균주 15, MG1655 metA *11 P trc - metH P trcF - cysPUWAM P trcF - cysJIH P trc09-gcvTHP P trc36 - ARNmst17 - metF P trc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU ΔyncA Δ malS :: TTadc - CI857 - P lambdaR *(-35)- thrA *1- cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc -PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc - P lambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC P trc01 - pntAB :: Cm Δu d hA:: Km pCL1920 - PgapA - pycre - TT07 의 구축

이전에 기술된 pCL1920-PgapA - pycRe-TT07을 전기천공에 의해 균주 13 (표 1) 내로 도입하였다. 플라스미드 pCL1920-PgapA - pycRe-TT07의 존재를 확인하고, 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc -PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC Ptrc01 - pntAB :: Cm Δu d hA:: Km pCL1920-PgapA - pycre -TT07을 균주 15로 칭하였다.

VIII . 실시예 8 : 균주 18, MG1655 metA *11 P trc - metH P trcF - cysPUWAM P trcF - cysJIH P trc09-gcvTHP P trc36 - ARNmst17 - metF P trc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU ΔyncA Δ malS :: TTadc - CI857 - P lambdaR *(-35)- thrA *1- cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc -PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc - P lambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC P trc30 - pntAB :: Cm Δu d hA pCL1920 - PgapA - pycRe - TT07 의 구축

VIII .1. 균주 13의 저항성 카세트의 제거에 의한 균주 16의 구축

상기에 기술된 균주 13의 카나마이신 및 클로람페니콜 저항성 카세트를 프로토콜 1에 따라 제거하였다. 카나마이신 및 클로람페니콜 저항성 카세트의 상실을 프라이머 Oag0055-udhAF2 (서열 33), Oag0056-udhAR2 (서열 34), Ome1151-pntAF (서열 37) 및 Ome1152-pntAR (서열 38) (표 2)을 사용함으로써 PCR에 의해 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU ΔyncA Δ malS :: TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc -PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC Ptrc01 - pntAB ΔudhA pCL1920 - PgapA - pycRe - TT07을 균주 16으로 칭하였다.

VIII .2. 균주 MG1655 metA *11 pKD46 Ptrc30 - pntAB :: Cm 의 구축

피리딘 뉴클레오티드 트랜스히드로게나제 알파 및 베타 서브유닛인 PntA 및 PntB의 발현 수준을 증가시키기 위해, 프라이머 Ome2104 Ptrc30-pntAR (서열 49) 및 Ome 1150-Ptrc-pntAF (서열 36)를 사용하여 pKD3 플라스미드로부터 클로람페니콜 저항성 카세트를 증폭시킨 것을 제외하고는 프로토콜 1에 따라 균주 MG1655 metA*11 pKD46 내로 구성적 인공 trc30 프로모터를 pntA - pntB 오페론의 상류에 부가하였다.

클로람페니콜 저항성 재조합체를 선별하였다. 인공 프로모터 trc30의 존재 및 저항성 카세트의 삽입을 프라이머 Ome1151-pntAF (서열 37) 및 Ome1152-pntAR (서열 38) (표 2)로의 PCR 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 확인 및 선별된 균주를 MG1655 metA *11 pKD46 Ptr30 - pntAB :: Cm으로 칭하였다.

Ome2104 Ptrc30-pntA R (서열 49)

[서열에서,

- 밑줄친 대문자 서열은 trc30 프로모터 서열에 대한 것이고,

- 이탤릭체 대문자 서열은 pKD3 플라스미드의 프라이머 부위 2 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645])에 상응한다]

VIII .3. 균주 16 내로의 Ptrc30 - pntAB :: Cm 의 형질도입에 의한 균주 17의 구축

Ptrc30 - pntAB :: Cm 프로모터 변형을 프로토콜 2에 따라 상기에 기술된 균주 MG1655 metA *11 pKD46 Ptrc30 - pntAB :: Cm으로부터의 P1 파지 용해물을 사용하는 것에 의해 균주 16 (표 1) 내로 형질도입하였다.

클로람페니콜 저항성 형질도입체를 선별하고, Ptrc30 - pntAB :: Cm 염색체 변형의 존재를 Ome1151-pntAF (서열 37) 및 Ome1152-pntAR (서열 38) (표 2)로의 PCR에 의해 확인하였다. 확인 및 선별된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF ΔpykA Δ purU Δ yncA Δ malS :: TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ CP4 -6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC Ptrc30-pntAB::Cm Δ udhA를 균주 17로 칭하였다.

VIII .4. 균주 17 내로의 pCL1920 - PgapA - pycre - TT07 의 도입에 의한 균주 18의 구축

이전에 기술된 pCL1920-PgapA - pycRe-TT07을 전기천공에 의해 균주 17 (표 1) 내로 도입하였다. 플라스미드 pCL1920-PgapA - pycRe-TT07의 존재를 확인하고, 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC Ptrc30 - pntAB :: Cm Δu d hA pCL1920-PgapA - pycre-TT07을 균주 18로 칭하였다.

IX . 실시예 9 : 균주 20, MG1655 metA *11 P trc - metH P trcF - cysPUWAM P trcF - cysJIH P trc09-gcvTHP P trc36 - ARNmst17 - metF P trc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU ΔyncA Δ malS :: TTadc - CI857 - P lambdaR *(-35)- thrA *1- cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc -PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc - P lambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC P trc97 - pntAB :: Cm Δu d hA pCL1920 - PgapA - pycRe - TT07 의 구축

IX .1. 균주 MG1655 metA *11 pKD46 Ptrc97 - pntAB :: Cm 의 구축

피리딘 뉴클레오티드 트랜스히드로게나제 알파 및 베타 서브유닛인 PntA 및 PntB의 발현 수준을 증가시키기 위해, 프라이머 Ome2105 Ptrc97-pntAR (서열 50) 및 Ome 1150-Ptrc-pntAF (서열 36)를 사용하여 플라스미드 pKD3으로부터 클로람페니콜 저항성 카세트를 증폭시킨 것을 제외하고는 프로토콜 1에 따라 균주 MG1655 metA*11 pKD46 내로 구성적 인공 trc97 프로모터를 pntA - pntB 오페론의 상류에 부가하였다.

클로람페니콜 저항성 재조합체를 선별하였다. 인공 프로모터 trc97의 존재 및 저항성 카세트의 삽입을 프라이머 Ome1151-pntAF (서열 37) 및 Ome1152-pntAR (서열 38) (표 2)로의 PCR 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 확인 및 선별된 균주를 MG1655 metA *11 pKD46 Ptr97 - pntAB :: Cm으로 칭하였다.

Ome 2105 Ptrc97-pntAR (서열 50)

[서열에서,

- 밑줄친 대문자 서열은 trc97 프로모터 서열에 대한 것이고,

IX .2. 균주 16 내로의 Ptrc97 - pntAB :: Cm 의 형질도입에 의한 균주 19의 구축

Ptrc97 - pntAB :: Cm 프로모터 변형을 프로토콜 2에 따라 상기에 기술된 균주 MG1655 metA *11 pKD46 Ptrc97 - pntAB :: Cm으로부터의 P1 파지 용해물을 사용하는 것에 의해 균주 16 (표 1) 내로 형질도입하였다.

클로람페니콜 저항성 형질도입체를 선별하고, Ptrc97 - pntAB :: Cm 염색체 변형의 존재를 Ome1151-pntAF (서열 37) 및 Ome1152-pntAR (서열 38) (표 2)로의 PCR에 의해 확인하였다. 확인 및 선별된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF ΔpykA Δ purU Δ yncA Δ malS :: TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ CP4 -6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA -serC::Gt Ptrc97 - pntAB :: Cm Δ udhA를 균주 19로 칭하였다.

IX .3. 균주 19 내로의 pCL1920 - PgapA - pycre - TT07 의 도입에 의한 균주 20의 구축

이전에 기술된 pCL1920-PgapA - pycRe-TT07을 전기천공에 의해 균주 19 (표 1) 내로 도입하였다. 플라스미드 pCL1920-PgapA - pycRe-TT07의 존재를 확인하고, 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC Ptrc97 - pntAB :: Cm Δu d hA pCL1920-PgapA - pycre-TT07을 균주 20으로 칭하였다.

X. 실시예 10 : 균주 22, MG1655 metA *11 P trc - metH P trcF - cysPUWAM P trcF - cysJIH P trc09-gcvTHP P trc36 - ARNmst17 - metF P trc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU ΔyncA Δ malS :: TTadc - CI857 - P lambdaR *(-35)- thrA *1- cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc -PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc - P lambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC P trc55 - pntAB :: Cm Δu d hA pCL1920 - PgapA - pycRe - TT07 의 구축

X.1. 균주 MG1655 metA *11 pKD46 Ptrc55 - pntAB :: Cm 의 구축

피리딘 뉴클레오티드 트랜스히드로게나제 알파 및 베타 서브유닛인 PntA 및 PntB의 발현 수준을 증가시키기 위해, 프라이머 Oag 0699-Ptrc55-pntAB R (서열 51) 및 Ome 1150-Ptrc-pntAF (서열 36)를 사용하여 pKD3 플라스미드로부터 클로람페니콜 저항성 카세트를 증폭시킨 것을 제외하고는 프로토콜 1에 따라 균주 MG1655 metA*11 pKD46 내로 구성적 인공 trc55 프로모터를 pntA - pntB 오페론의 상류에 부가하였다.

클로람페니콜 저항성 재조합체를 선별하였다. 인공 프로모터 trc55의 존재 및 저항성 카세트의 삽입을 프라이머 Ome1151-pntAF (서열 37) 및 Ome1152-pntAR (서열 38) (표 2)로의 PCR 및 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 확인 및 선별된 균주를 MG1655 metA *11 pKD46 Ptr55 - pntAB :: Cm으로 칭하였다.

Oag 0699-Ptrc55-pntAB R (서열 51)

[서열에서,

- 밑줄친 대문자 서열은 trc55 프로모터 서열에 대한 것이고,

X.2. 균주 16 내로의 Ptrc55 - pntAB :: Cm 의 형질도입

Ptrc55 - pntAB :: Cm 프로모터 변형을 프로토콜 2에 따라 상기에 기술된 균주 MG1655 metA *11 pKD46 Ptrc55 - pntAB :: Cm으로부터의 P1 파지 용해물을 사용하는 것에 의해 균주 16 (표 1) 내로 형질도입하였다.

클로람페니콜 저항성 형질도입체를 선별하고, Ptrc55 - pntAB :: Cm 염색체 변형의 존재를 Ome1151-pntAF (서열 37) 및 Ome1152-pntAR (서열 38) (표 2)로의 PCR에 의해 확인하였다. 확인 및 선별된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF ΔpykA Δ purU Δ yncA Δ malS :: TTadc - CI857-PlambdaR *(-35)- thrA *1- cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ CP4 -6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 -TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA -serC::Gt Ptrc55 - pntAB :: Cm Δ udhA를 균주 21로 칭하였다.

X.3. 균주 21 내로의 pCL1920 - PgapA - pycre - TT07 의 도입에 의한 균주 22의 구축

이전에 기술된 pCL1920-PgapA - pycRe-TT07을 전기천공에 의해 균주 21 (표 1) 내로 도입하였다. 플라스미드 pCL1920-PgapA - pycRe-TT07의 존재를 확인하고, 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC Ptrc55 - pntAB :: Cm Δu d hA pCL1920-PgapA - pycre-TT07을 균주 22로 칭하였다.

XI . 실시예 11 : 균주 24, MG1655 metA *11 P trc - metH P trcF - cysPUWAM P trcF - cysJIH P trc09-gcvTHP P trc36 - ARNmst17 - metF P trc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU ΔyncA Δ malS :: TTadc - CI857 - P lambdaR *(-35)- thrA *1- cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc -PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc -P lambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc - P lambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE -P gapA-metA*11 DtreBC :: TT02 - serA - serC Δ udhA :: Km pCL1920-PgapA-pycRe-TT07 의 구축

XI .1. 균주 10 내로의 Δ udhA :: Km 의 형질도입에 의한 균주 23의 구축

이전에 기술된 Δ udhA :: Km 결실을 프로토콜 2에 따라 상기에 기술된 균주 MG1655 metA *11 ΔmetJ Ptrc36 - metF Δ udhA :: Km pKD46으로부터의 P1 파지 용해물을 사용하는 것에 의해 균주 10 (표 1) 내로 형질도입하였다.

카나마이신 저항성 형질도입체를 선별하였다. Ptrc36 - ARNmst17 - metF 프로모터 변형의 존재를 프라이머 Ome0726-PtrcmetF-F (서열 29) 및 Ome0727-PtrcmetF-R (서열 30)로의 PCR (실시예 6에 설명된 이유)에 이어서 DNA 서열분석에 의해 확인하고, Δ udhA::Km 결실의 존재를 프라이머 Oag0055-udhAF2 (서열 33) 및 Oag0056-udhAR2 (서열 34) (표 2)로의 PCR에 의해 확인하였다. 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc -metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36 - ARNmst17 - metF Ptrc07 -serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA Δ malS :: TTadc - CI857 - PlambdaR *(-35)-thrA*1-cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA -metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR *(-35)- RBS01 - thrA *1- cysE-PgapA - metA *11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Δ udhA :: Km을 균주 23으로 칭하였다.

XI .2. 균주 24의 구축: 균주 23 내로의 pCL1920 - PgapA - pycre - TT07 의 도입

이전에 기술된 pCL1920-PgapA - pycRe-TT07을 전기천공에 의해 균주 23 (표 1) 내로 도입하였다. 플라스미드 pCL1920-PgapA - pycRe-TT07의 존재를 확인하고, 생성된 균주 MG1655 metA *11 Ptrc - metH PtrcF - cysPUWAM PtrcF - cysJIH Ptrc09 - gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07 - serB Δ metJ Δ pykF Δ pykA Δ purU Δ yncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE Δ pgaABCD :: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ uxaCA :: TT07 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ CP4 -6:: TT02 - TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ wcaM :: TT02 - TTadc-PlambdaR *(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 Δ treBC :: TT02 - serA - serC Δ udhA :: Km pCL1920-PgapA-pycre-TT07을 균주 24로 칭하였다.

XII . 실시예 12: 진탕 플라스크에서의 발효에 의한 L-메티오닌 생산

생산 균주를 소형 삼각 플라스크에서 평가하였다. 5.5 ㎖ 예비배양물을 30℃에서 21시간 동안 혼합 배지 (10 ％ LB 배지 (LB 브로스 밀러(Miller) 25 g/ℓ) + 2.5 g/ℓ 글루코스 및 90 ％ 최소 배지 PC1)에서 성장시켰다. 이를 사용하여, PC1 배지의 50 ㎖ 배양물에 OD₆₀₀ 0.2로 접종하였다. 필요한 경우, 카나마이신 및 스펙티노마이신에 대해서는 50 ㎎/ℓ, 클로람페니콜에 대해서는 30 ㎎/ℓ, 젠타마이신에 대해서는 10 ㎎/ℓ의 농도로 항생제를 첨가하였다. 배양물의 온도를 2시간 동안 37℃에서, 2시간 동안 42℃에서, 그 후 배양 종료까지 37℃에서 유지시켰다. 배양물이 OD₆₀₀ 5 내지 7에 도달했을 때, 세포외 아미노산을 OPA/Fmoc 유도체화 후 HPLC에 의해 정량하였고, 기타 관련된 대사산물을 HPLC + 굴절측정 검출 (유기산 및 글루코스) 및 실릴화 후의 GC-MS를 사용하여 분석하였다. 각각의 균주에 대해, 여러 반복물을 제조하였다.

세포외 메티오닌 농도를 OPA/FMOC 유도체화 후 HPLC에 의해 정량하였다. 잔여 글루코스 농도를 HPLC + 굴절측정 검출을 사용하여 분석하였다. 하기와 같이 메티오닌 수율이 표현되었다:

표 4에서 볼 수 있듯이, pntAB 과발현 및/또는 udhA 결실 시 메티오닌/글루코스 수율 (Y_met)이 증가된다 (균주 9 및 14 대 균주 7의 비교 및 균주 12, 13, 15 및 24 대 균주 10의 비교).

metF 유전자의 강한 과발현 시에 수율 개선이 더욱 더 양호하다. metF 유전자 앞의 mRNA 안정화 서열과 pntAB 과발현 및 udhA 결실 양쪽 모두를 함유하는 균주 13이 C1 경로의 강한 과발현이 없는 균주 14보다 더 높은 수율을 나타낸다.

XIII . 실시예 13: 트랜스히드로게나제 및 5,10- 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제 활성

실시예 12, 표 4에 기술된 결과가 각각 PntAB 및 MetF가 보유하는 트랜스히드로게나제 및 5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제 활성의 분석에 의해 확증된다 (표 5). 소형 삼각 플라스크 배양물에서, 양쪽 활성이 과발현시 증가된다.

효소 활성을 시험관 내에서 결정하기 위해, 이. 콜라이 균주를 상기 기술된 바와 같은 최소 배지에서 배양하였다. 추출 방법에 앞서, 세포를 원심분리에 의해 배양 브로스로부터 회수하였다. 펠릿을 저온의 20 mM 인산칼륨 완충제 (pH 7.2)에 재현탁시키고, 세포를 프리셀라이스(Precellys) (버틴 테크놀러지즈(Bertin Technologies); 5000 rpm에서 2×10s, 2회의 단계 사이에 얼음 상에서 2분)로의 비드 비팅(bead beating)에 의해 용해시킨 후, 12000g (4℃)에서 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 탈염시키고, 분석에 사용하였다. 브래드포드(Bradford) 검정 시약을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다.

트랜스히드로게나제 활성 (TH)을 이전에 기술된 바와 같이 검정하였다 (문헌 [Yamagushi and Stout, 2003]). 50 mM MES-KOH 완충제 (pH 6.0), 0.2 mM NADH, 0.2 mM AcPyAD ± 10 μM NADPH 및 6 ㎍의 미정제 세포 추출물을 함유하는 37℃ 반응 혼합물에서 고리형 트랜스히드로게나제 활성을 분광광도법으로 30분 동안 375 nm에서 검정하였다. 모든 결과는 3회 이상의 측정치의 평균이다.

5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제 활성 (MTHFR)을 이전에 기술된 바와 같이 검정하였고 (문헌 [Matthews, 1986]), 이때 약간의 변형이 있었다. 이러한 방법이 반응식 1에서 제시된다.

[반응식 1]

메틸-THF + 메나디온 → 메틸렌-THF + 메나디올

메틸-THF가 기질로 사용되고, 메틸렌-THF의 형성을 포름알데히드가 산출되는 메틸렌-THF의 산 분해에 의해 측정한다. 생산된 포름알데히드가 지시약 NBDH와 반응하여, 530 nm에서 고도로 형광성인 히드라존 유도체를 형성한다. 50 mM 인산칼륨 완충제 (pH 6.7), 0.3 mM EDTA, 0.2 ％ (w/v) 소 혈청 알부민, 20％ 메탄올/80％ H₂O 내의 메나디온의 포화 용액, 및 20 ㎍의 미정제 세포 추출물을 함유하는 반응 혼합물에서 5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제 활성을 30분 동안 37℃에서 검정하였다. 인큐베이션 후, 아세트산나트륨 완충제 (pH 4.7)의 첨가 및 튜브를 100℃의 히터 블록에 2분 동안 놓는 것에 의해 반응을 종결시켰다. 10000g에서 5분 동안 원심분리한 후, 생산된 포름알데히드를 FLx800 형광 마이크로플레이트 판독기(Fluorescence Microplate Reader) (바이오텍(Biotek))으로 95％ 에탄올/6％ 인산 내의 0.001％ NBDH의 첨가에 의해 측정하였다.

XIV . 실시예 14: 생물반응기에서의 발효에 의한 L-메티오닌 생산

실질적인 양의 관심 대사산물을 생산한 균주를 이어서 유가식(fedbatch) 전략을 사용하여 2.5 ℓ 발효기 (피에르 게랑(Pierre Guerin))에서의 생산 조건 하에 테스트하였다.

간략하게, 10 ㎖ LB 배지 + 2.5 g/ℓ 글루코스에서 성장된 24시간 배양물을 사용하여 최소 배지 (B1a) 내의 24시간 예비배양물에 접종하였다. 회전식 진탕기 (200 RPM) 내의 50 ㎖의 최소 배지 (B1a)를 함유하는 500 ㎖ 배플(baffled) 플라스크에서 이러한 인큐베이션을 수행하였다. 제1 예비배양물은 30℃의 온도, 제2 예비배양물은 34℃의 온도에서 달성하였다.

5 ㎖의 농축 예비배양물이 1.2 g/ℓ의 바이오매스 농도로 접종된 200 ㎖의 최소 배지 (B1b)가 충전된 생물반응기 (식스포스(Sixfors))에서 제3 예비배양 단계를 수행하였다. 예비배양 온도를 34℃에서 일정하게 유지시켰고, pH를 10％ NH₄OH 용액을 사용하여 6.8의 값으로 자동으로 조정하였다. 공기 공급 및/또는 진탕으로 용존 산소 농도를 공기 분압 포화도 30％의 값으로 계속 조정하였다. 배치 배지로부터의 글루코스 고갈 후, 0.7 ㎖/h의 초기 유속으로 유가식 배양을 시작하였고, 약 18 g/ℓ의 최종 세포 농도를 수득하기 위해 0.13 /h의 성장 속도로 24시간 동안 지수적으로 증가시켰다.

이어서, 2.5 ℓ 발효기 (피에르 게랑)에 600 ㎖의 최소 배지 (B2)를 충전하였고, 2.1 g/ℓ의 바이오매스 농도로 55 내지 70 ㎖ 부피 범위의 예비배양물을 접종하였다.

배양 온도를 37℃에서 일정하게 유지시켰고, pH를 NH₄OH 용액 (9시간 동안은 NH₄OH 10％, 배양 종료까지는 NH₄OH 28％)의 자동 첨가에 의해 작동값 (6.8)으로 유지시켰다. 초기 진탕 속도를 배치 단계 동안은 200 RPM으로 설정하였고, 유가식 단계 동안 1000 RPM으로 증가시켰다. 초기 공기 유속을 배치 단계 동안은 40 NL/h로 설정하였고, 유가식 단계를 시작할 때 100 NL/h로 증진시켰다. 진탕을 증가시킴으로써 용존 산소 농도를 20 내지 40％, 바람직하게는 30％ 포화도의 값에서 유지시켰다.

세포 덩어리가 5 g/ℓ에 근접하는 농도에 도달했을 때, 5 ㎖/h의 초기 유속으로 유가식 배양을 시작하였다. 26시간의 성장 후에 24 ㎖/h에 도달하도록 유속을 증가시키면서 S자형 프로파일에 따라 공급 용액을 주입하였다. 하기의 식으로 정확한 공급 조건을 계산하였다:

[식 중, Q(t)는 600 ㎖의 배치 부피에 대한 ㎖/h 단위의 공급 유속이고, p1 = 1.80, p2 = 22.40, p3 = 0.270, p4 = 6.5이다].

26시간 후, 유가식 공급 용액 펌프를 정지시켰고, 글루코스 고갈 후 배양이 완결되었다.

세포외 아미노산을 OPA/Fmoc 유도체화 후 HPLC에 의해 정량하였고, 기타 관련된 대사산물을 HPLC + 굴절측정 검출 (유기산 및 글루코스) 및 실릴화 후의 GC-MS를 사용하여 분석하였다.

플라스크 실험에서 앞서 관찰된 바와 같이, 동일한 방식으로, 생물반응기에서, pntAB 과발현 및/또는 udhA 결실 시 메티오닌/글루코스 수율 (Y_met _max)이 증가된다 (표 10의 균주 10 및 13의 비교).

또한, 본 발명자들은 pntAB 과발현의 미세하게 조정된 조절이 상기 표 10의 균주 12, 15, 18, 20 및 22로 볼 수 있는 바와 같이 메티오닌 생산을 개선하였음을 나타낸다. 메티오닌 생산이 pntAB 유전자의 발현 수준에 의해 조정되고, 본 발명자들은 이것이 pntAB의 중등도의 과발현으로 더 양호하다는 것을 나타낸다.

pH를 조절하기 위해, 그리고 배양물에 공급하기 위해 첨가된 용액의 양을 초기 부피에 더하고, 샘플 작업에 사용되고 증발에 의해 손실된 부피를 빼서, 발효기 부피를 계산하였다.

공급 모액을 칭량함으로써 유가식 부피를 계속 추적하였다. 그 후, 주입된 글루코스의 양을 주입된 중량, 용액 밀도 및 브릭스(Brix) 방법으로 결정된 글루코스 농도 ([글루코스])를 기초로 계산하였다. 하기와 같이 메티오닌 수율이 표현되었다:

배양 동안 수득된 최대 수율이 여기에서 각각의 균주에 대해 제시된다.

상기 식에서 메티오닌₀ 및 메티오닌_t는 각각 초기 및 최종 메티오닌 농도이고, V₀ 및 V_t는 초기 및 t 시점의 부피이다.

소비된 글루코스를 하기와 같이 계산하였다:

주입된 글루코스_t = 공급된 부피_t * [글루코스]

소비된 글루코스_t = [글로코스]₀ * V₀ + 주입된 글루코스 - [글루코스]_잔여 * V_t

상기 식에서, [글루코스]₀, [글루코스], [글루코스]_잔여는 각각 초기 글루코스 농도, 공급된 글루코스 농도 및 잔여 글루코스 농도이다.

XV . 실시예 15: 트랜스히드로게나제 활성

실시예 14, 표 10에 기술된 결과가 PntAB가 보유하는 트랜스히드로게나제 활성의 분석에 의해 확증된다 (표 11). 이전에 플라스크 실험에서 관찰된 바와 같이, 트랜스히드로게나제 활성이 pntAB 과발현 시 증가된다 (표 11의 균주 10 및 13의 비교). 또한, pntAB 과발현의 미세하게 조정된 조절이 표 11의 균주 18로 볼 수 있는 바와 같이 트랜스히드로게나제 활성을 약 10배 감소시켰다.

실시예 13에서 이전에 기술된 바와 같이 트랜스히드로게나제 활성 (TH)을 검정하였다. 모든 결과는 3회 이상의 측정치의 평균이다.

참고 문헌

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1560 tatgggtatt tcccccggag gcgagaaagc actctccacg cccggccgca aggatcagga 1620 cgacgggggc aggcatgaat cctcctcctg atggagacgt acagaggcga cttctgccag 1680 cacggagagt gccagagtat gcgcatcccg ggctttgggg aatatcccga cgggtgcccg 1740 gatttgcgtt gtttcctccc tggaccatcc cagctcgtgg agcttttgca gacgtaacgt 1800 gtgggttcga tagctgccca atgcgccgag ataaaagggt tttgcttctc gcgcggcctg 1860 caacactggc agctcccggt tgagatcatg gcacagcaaa atgaccgccg tatcggtatc 1920 gatctgagcg ctggctgagg ccggaaaaag atcgaagata tggctgtcat agcctgtggc 1980 tgctgcaaga ctcgcggttg cctgcgcctc aagagaacgt ccgtaaatca tcagcctgac 2040 gcatggcctg aaccccacct caaagccatt gagattccag cccgtccggg tttgcgtggg 2100 caggcacacc agcgattgtg cttgcggatc gtagcgcagc cccaccggtt ttctctgttc 2160 caggcggttc agcacggcga gcagaggctg tgccgagcgt agggtacctc ttaattaa 2218 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 20 tcccccgggg tataccatat gaatatcctc cttag 35 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide 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Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 26 cccaagcttc atatgaatat cctccttagt tcctattccg aagttcctat tctctagaaa 60 gtataggaac ttcggcgcgg atgggtaccg agctcgaatt g 101 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 27 gttgccgaac atttgggagt gc 22 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 28 ggagatcaga ttcaccacat cc 22 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 29 gcccggtact catgttttcg ggtttatgg 29 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 30 ccgttattcc agtagtcgcg tgcaatgg 28 <210> 31 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 31 ggtgcgcgcg tcgcagttat cgagcgttat caaaatgttg gcggcggttg cacccactgg 60 ggcaccatcc cgtcgaaagc catatgaata tcctccttag 100 <210> 32 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 32 cccagaatct cttttgtttc ccgatggaac 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gtcccaggat tcagtaacgc 20 <210> 39 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 39 cgtagttaac gaattcctgc gccaccgagc cagccagacc ttgcgc 46 <210> 40 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 40 gcttgtatac aacagataaa acgaaaggcc cagtctttcg actgagcctt tcgttttatt 60 tgatggcgtt ctcctctata aagcctgcag caagc 95 <210> 41 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 41 agactgggcc tttcgtttta tctgttgtat acaagcttaa ttaagggccc gggcggatcc 60 atttgcgacc attcctggaa aaatggagtc 90 <210> 42 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 42 cgtagttaac gaattccgcc ccttctttca ggttgcgtag gccatac 47 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 43 gccgttcaac actggctgga cg 22 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 44 tgccattgca ggtgcatcgc 20 <210> 45 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 45 acgcgtcgac ggtatcgata agcttcgttt aaacaagccc aaaggaagag tga 53 <210> 46 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 46 gtatcttgga tatgggcata tgttccacca gctatttgtt ag 42 <210> 47 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 47 ctaacaaata gctggtggaa catatgccca tatccaagat ac 42 <210> 48 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 48 tccccccggg gatccgaatt cgcagaaagg cccacccgaa ggtgagccag ctcgagggca 60 aggacgggcg aacgaaacct ttcgtgccgt tcgctcatcc gccgtaaacc gccag 115 <210> 49 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 49 gctgcaacac gggtttcatt ggttaaccgt tctcttggta tgccaattcg catgatattc 60 ccttccttcc acacagtata cgagccggat gattaatcgt caacagctct gtaggctgga 120 gctgcttcg 129 <210> 50 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 50 gctgcaacac gggtttcatt ggttaaccgt tctcttggta tgccaattcg catgatattc 60 ccttccttcc acacatttta cgagccggat gattaatagc caacagctct gtaggctgga 120 gctgcttcg 129 <210> 51 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 51 gctgcaacac gggtttcatt ggttaaccgt tctcttggta tgccaattcg catgatattc 60 ccttccttcc acacactata cgagccggat gattaatggt caacagctct gtaggctgga 120 gctgcttcg 129

Claims

PntAB의 트랜스히드로게나제 활성을 증강시키도록 변형된, 메티오닌의 생산을 위한 미생물.
제1항에 있어서, PntAB를 코딩하는 유전자가 과발현된 미생물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 트랜스히드로게나제 UdhA의 활성을 약화시키도록 변형된 미생물.
제3항에 있어서, UdhA를 코딩하는 유전자가 결실된 미생물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 탄소 대사를 증가시키도록 변형된 미생물.
제5항에 있어서,
a. 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제인 MetF의 활성
b. 글리신 절단 복합체인 GcvTHP 및 Lpd의 활성
c. 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제인 GlyA의 활성
d. 메틸트랜스퍼라제인 MetH 또는 MetE의 활성
중 하나 이상의 활성이 증강된 미생물.
제6항에 있어서, MetF의 활성이 metF 유전자를 과발현시키고/거나 그의 번역을 최적화함으로써 증강되는 것인 미생물.
제7항에 있어서, metF 유전자가 Ptrc 패밀리 프로모터에 속하는 강한 프로모터의 제어 하에 있는 것인 미생물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysI, cysJ, cysH, cysE, serA, serB, serC, 피드백 감수성이 감소된 metA 대립유전자, thrA 또는 피드백 감수성이 감소된 thrA 대립유전자 중 하나 이상의 유전자의 발현이 증가된 미생물.
제9항에 있어서, 열거된 유전자들 중 하나 이상의 유전자가 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 것인 미생물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 유전자의 발현이 증강된 미생물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, pykA, pykF, purU, yncA 또는 metJ 중 하나 이상의 유전자의 발현이 약화된 미생물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 엔테로박테리아과(Enterobacteriaceae) 또는 코리네박테리아과(Corynebacteriaceae)에서 선택되는 미생물.
제13항에 있어서, 에쉐리키아(Escherichia), 클레브시엘라(Klebsiella) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속에서 선택되는 미생물.
- 변형된 메티오닌-생산 미생물을 탄소 공급원, 황 공급원 및 질소 공급원을 포함하는 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계, 및
- 배양 배지로부터 메티오닌 또는 이의 한 유도체를 회수하는 단계
를 포함하고, 이때 상기 미생물이 PntAB의 증강된 트랜스히드로게나제 활성을 나타내도록 변형된, 메티오닌의 생산 방법.