KR20080065629A - Ｌ-메티오닌을 제조하기 위한 미생물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 L-메티오닌과 같은 L-아미노산의 효과적인 제조를 위한 미생물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 메티오닌 경로에서 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적을 감소시키고/시키거나 예방하는 미생물 및 방법에 관한 것이다.

L-메티오닌, 메티오닌 경로, 호모란티오닌, 미생물

Description

Ｌ-메티오닌을 제조하기 위한 미생물 및 방법{MICROORGANISM AND PROCESS FOR THE PREPARATION OF L-METHIONINE}

본 발명은 L-메티오닌의 효과적인 제조를 위한 미생물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 메티오닌 경로에서 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적을 감소시키고/시키거나 예방하는 미생물 및 방법에 관한 것이다.

현재 메티오닌의 전세계적 연간 생산량은 약 500,000톤이다. 메티오닌은 가축류인 가금류의 사료에서 제1 제한 아미노산이며, 이로 인해 주로 사료 보충물로서 적용된다. 다른 공업용 아미노산과 달리, 메티오닌은 화학 합성에 의해 제조된 라세미체로서 거의 전적으로 적용된다. 동물은 메티오닌의 양 입체 이성질체를 대사할 수 있기 때문에, 화학적으로 제조된 라세미 혼합물의 직접 공급이 가능하다 (문헌 [D'Mello and Lewis, Effect of Nutrition Deficiencies in Animals: Amino Acids, Rechgigl (Ed.), CRC Handbook Series in Nutrition and Food, 441-490, 1978]).

그러나, 현존하는 화학적 제조법을 생명 공학적 공정으로 대체하고자 하는 것은 여전히 큰 관심 사항이다. 이는 낮은 보충물 수준에서 L-메티오닌이 D-메티오닌보다 더 나은 황 아미노산의 공급원이기 때문이다 (문헌 [Katz and Baker, (1975) Poult. Sci., 545, 1667-74]). 또한, 화학적 공정은 꽤 유해한 화합물을 사용하며 상당한 폐스트림을 생성한다. 화학적 제조법의 이러한 모든 단점들은 효과적인 생명 공학적 공정에 의해 극복될 수 있다.

글루타메이트와 같은 다른 아미노산의 경우, 발효 방법을 사용하여 이들을 제조하는 것이 공지되어 있었다. 이들 목적을 위해서는, 특정한 미생물, 예컨대 에스케르키아 콜라이(Escherichia coli; 이. 콜라이(E. coli)) 및 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum; 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum))이 특히 적합하다고 증명되었다. 발효에 의한 아미노산의 제조는 또한 오직 L-아미노산만을 제조한다는 특별한 이점도 있다. 또한, 화학 합성에 사용되는 용매 등과 같이 환경적 문제가 있는 화학물질이 회피된다. 그러나, 만약 미생물에 의한 메티오닌의 발효적 제조가 화학적 제조시의 가격에 필적한 가격으로 상업적 규모로 가능할 경우에만 화학적 합성에 대한 대안이 될 것이다.

따라서, 요망되는 목적은 대량의 L-메티오닌을 제조하고 분비하기 위해 개발된 박테리아의 대규모 배양을 통한 L-메티오닌의 제조이다. 공정에 대한 개선은 발효법, 예컨대 교반 및 산소의 공급, 또는 영양 배지의 조성, 예컨대 발효 중 당 농도, 또는 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피에 의한 생성물의 후처리, 또는 미생물 자체의 고유한 생산 특성과 관련될 수 있다.

돌연변이 유발 방법, 선택 및 돌연변이체 선택을 사용하여 이들 미생물의 생산 특성을 개선한다. 항대사물질에 대한 내성이 있거나 조절이 중요한 대사산물에 대해 영양요구성이 있는 고생산 균주가 이러한 방식으로 획득된다.

또한 재조합 DNA 기술은 개별 아미노산 생합성 유전자를 증폭시키고 아미노산 제조에 대한 영향을 조사함으로써 L-아미노산을 제조하는 미생물 균주를 개선하기 위해 수년간 사용되었다.

문헌 [Rueckert et al., Journal of Biotechnology 2003, 104, 213-228]은 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 L-메티오닌 생합성 경로의 분석을 제공한다. MetZ(MetY로도 알려져 있음) 및 MetB의 알려진 기능을 확인할 수 있었고, MetC(AecD로도 알려져 있음)가 시스타티오닌-β-리아제임이 입증되었다. 또한, L-호모시스테인의 L-메티오닌으로의 전환을 촉매하는 MetE 및 MetH가 이 연구에서 확인되었다.

WO 02/097096호는 McbR 리프레서 유전자(MetD로도 알려져 있음)를 코딩하는 코리네형 박테리아로부터의 뉴클레오티드 서열, 및 이 McbR 리프레서 유전자가 감쇠된 박테리아를 사용하여 아미노산을 제조하는 공정을 사용한다. WO 02/097096호에 따르면, 전사 조절인자 McbR의 감쇠는 코리네형 박테리아에서의 L-메티오닌의 제조를 개선한다. WO 02/097096호에서는 또한, McbR 리프레서 유전자의 감쇠 이외에도, 시스타티오닌-γ-신타제를 코딩하는 MetB 유전자의 향상 또는 과다발현이 L-메티오닌의 제조에 바람직하다고 기재하고 있다.

특정 분자의 제조를 위해 개선된 균주의 선택은 시간 소모적이며 어려운 공정이다. 따라서, L-메티오닌을 효과적으로 제조하고/하거나 메티오닌 화합물을 얻기 위해 이용할 수 있는 L-메티오닌의 함량을 상당히 증가시키는 미생물에 대한 필요성은 여전히 크다.

<발명의 개요>

본 발명의 목적은 미생물에서 L-메티오닌의 효과적인 제조를 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 L-메티오닌을 효과적으로 제조하는 미생물을 제공하는 것이다.

본원의 기재로부터 명백해질 바와 같이 본 발명의 이러한 그리고 추가의 목적은 독립항의 청구 대상에 의해 얻어진다.

본 발명의 추가의 실시 형태는 종속항에 의해 한정된다.

본 발명의 한 실시 형태에 따르면, 특히 메티오닌 경로에서 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적을 감소시키고/시키거나 예방하는, L-메티오닌의 제조를 위한 미생물이 제공된다. 이러한 L-메티오닌의 생합성을 위한 경로에서 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적의 감소 및/또는 예방은 미생물이 목적하는 분자, 즉 L-메티오닌을 대량으로 제조하고 분비하도록 할 수 있다.

본 발명의 추가의 실시 형태에서, 전사 조절인자 단백질 McbR의 함량 및/또는 생물학적 활성이 야생형 미생물에 비해 감소되고, 특히 메티오닌 경로에서 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적을 감소시키고/시키거나 예방하는 미생물이 제공된다.

본 발명의 추가의 실시 형태에 따르면, 시스타티오닌-γ-신타제(MetB, EC 2.5.1.48)의 함량 및/또는 생물학적 활성을 야생형 미생물에 비해 감소시킴으로써 메티오닌 경로에서 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적을 감소시키고/시키거나 예방 하는 미생물이 제공된다.

본 발명의 다른 실시 형태에서, MetB의 함량 및/또는 생물학적 활성은 MetB를 코딩하는 유전자를 감쇠 또는 분열시키고/시키거나 제거함으로써 감소된다.

본 발명에 따른 방법의 추가의 실시 형태에 따르면, 분열된 MetB 유전자는 배양된 미생물에서의 기능성 MetB 단백질의 발현을 예방한다.

본 발명에 따른 미생물의 한 실시 형태에서, McbR을 코딩하는 유전자는 감쇠되고, 바람직하게는 분열되며, 더욱 바람직하게는 제거된다. 특히, 분열된 McbR 유전자는 본 발명에 따른 미생물에서 기능성 McbR 단백질의 발현을 예방할 수 있다.

추가의 실시 형태에 따르면, 호모시스테인을 메티오닌으로 효과적으로 전환시킬 수 있는 메티오닌 신타제를 코딩하는 동종 또는 이종 기원의 유전자, 즉 metE(EC 2.1.1.13) 및/또는 metH(EC 2.1.1.14)를 도입하고/하거나 과잉 제조하는 미생물이 제공된다.

본 발명의 추가 측면에 따르면,

- L-메티오닌을 제조하고, 메티오닌 경로에서 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적을 감소시키고/시키거나 예방하는 미생물을 배양 및/또는 발효시키는 단계, 및

- L-메티오닌을 단리시키는 단계

를 포함하는, L-메티오닌의 제조 방법이 제공된다.

본 발명에 따른 방법의 추가의 실시 형태에 따르면, 전사 조절인자 단백질 McbR의 함량 및/또는 생물학적 활성이 야생형 미생물에 비해 감소된 유기체가 배양 된다.

본 발명의 방법의 추가의 실시 형태에 따르면, McbR을 코딩하는 유전자가 감쇠되고/되거나 분열되고/되거나 제거된 미생물이 배양된다.

본 발명의 방법의 추가의 실시 형태에 따르면, 분열된 McbR 유전자는 기능성 McbR 단백질의 발현을 예방한다.

본 발명의 방법의 추가의 실시 형태에 따르면, 호모란티오닌을 호모시스테인으로 효과적으로 전환시킬 수 있는 시스타티오닌-β-리아제(MetC) 돌연변이체를 코딩하는 이종 유전자가 도입된 미생물이 배양된다.

본 발명의 방법의 추가의 실시 형태에 따르면, O-아세틸-호모세린 및 시스테인을 시스타티온으로 효과적으로 전환시킬 수 있고, O-아세틸-호모세린 및 호모시스테인을 호모란티오닌으로 전환시킬 수는 없는 시스타티오닌-γ-신타제(MetB)를 코딩하는 이종 유전자가 도입된 미생물이 배양된다.

본 발명의 방법의 추가의 실시 형태에 따르면, O-아세틸-호모세린 술프히드롤라제(MetZ), 코브(I)알라민 의존성 메티오닌 신타제 I(MetH) 및 코브(I)알라민 독립성 메티오닌 신타제 II(MetE)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 단백질의 함량 및/또는 생물학적 활성이 야생형 미생물에 비해 증가된 미생물이 배양된다.

본 발명의 방법의 추가의 실시 형태에 따르면, O-아세틸-호모세린 술프히드롤라제(MetZ), 코브(I)알라민 의존성 메티오닌 신타제 I(MetH) 및 코브(I)알라민 독립성 메티오닌 신타제 II(MetE)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 단백질을 코딩하는 1종 이상의 유전자가 야생형 미생물에 비해 향상되고/향상되거나 과다발현된 미생물이 배양된다.

본 발명의 방법의 추가의 실시 형태에 따르면, 미생물은 코리네형 박테리아, 미코박테리아, 스트렙토마이세타세에(streptomycetaceae), 살모넬라(Salmonella), 에스케르키아 콜라이, 시겔라(Shigella), 바실루스(Bacillus), 세라티아(Serratia) 및 슈도모나스(Pseudomonas)로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

본 발명의 방법의 바람직한 추가의 실시 형태에 따르면, 유기체는 코리네박테리움 글루타미쿰, 에스케르키아 콜라이, 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)이다.

본 발명의 방법의 추가의 실시 형태에 따르면, 목적하는 L-아미노산은 배지 내 또는 미생물의 세포 내에 농축된다.

본 발명의 추가 측면에서,

- L-메티오닌을 제조하고, 발효 배지에서 메티오닌 경로 중 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적을 감소시키고/시키거나 예방하는 미생물을 배양 및/또는 발효시키는 단계,

- L-메티오닌-함유 발효 브로쓰로부터 물을 제거하는 단계,

- 발효 도중 형성된 바이오매스의 0 내지 100 중량％, 예컨대 10 내지 90 중량％ 또는 20 내지 80 중량％ 또는 30 내지 70 중량％ 또는 40 내지 60 중량％ 또는 약 50 중량％를 제거하는 단계, 및

- 발효 브로쓰를 건조시켜 분말 또는 과립 형태의 동물 사료 첨가제를 얻는 단계

를 포함하는, 발효 브로쓰로부터 L-메티오닌 함유 동물 사료 첨가제를 제조하는 방법이 제공된다.

또한, 본 발명의 또 다른 측면은 L-메티오닌의 제조를 위해, 메티오닌 경로에서 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적을 감소시키고/감소시키거나 예방하는 미생물, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰의 용도에 관한 것이다.

도 1a는 미생물, 예컨대 씨. 글루타미쿰에서의 L-메티오닌 생합성을 위한 경로 모델이다. 관련된 효소는 MetA(호모세린 트랜스아세틸라제), MetB(시스타티오닌-γ-신타제), MetZ(O-아세틸호모세린 술프히드롤라제), MetC(시스타티오닌-β-리아제), 코브(I)알라민 의존성 메티오닌 신타제I(MetH) 및 코브(I)알라민 독립성 메티오닌 신타제 II(MetE)이다.

도 1b는 L-호모란티오닌(S-[(3S)-3-아미노-3-카르복시프로필]-L-호모시스테인)의 구조식을 나타낸다.

도 2는 MetC 검정법(도 2a) 및 MetB 검정법(도 2b)의 여러 시간 지점에서 412 nm에서의 유리 SH기의 측광 스펙트럼을 나타낸다. 80 내지 140분 사이에서 x축의 끊긴 부분은 한외여과에 의해 MetB를 분리하기 위한 시간에 상당한다. MetC의 첨가는 회색 점선 화살표로 표시한다. HPLC로 측정되는 상응하는 기질 및 생성물 농도는 각각 표 3a 및 3b에 기재된다.

도 3은 MBDSTFA-유도체화된 시스타티오닌 (A) 및 호모란티오닌 (B)의 GC/MS 질량 스펙트럼을 도시한다. m/z = 678 및 m/z = 692는 각각 시스타티오닌 및 호모 란티오닌의 m-시그널이다. 특징적 m-15, m-57 및 m-302는 또한 질량 변이 14로 관찰될 수도 있다. m/z = 170, m/z = 244 및 m/z = 272는 양 분자에서 호모시스테인 잔기의 특징적 단편이다.

도 4는 플라스미드 pH430 ΔMcbR (a), pH238 델타 Δhom/Δhsdh-hsk (b) 및 pSL315 (c)를 나타낸다.

<예시적 실시 형태의 상세한 설명>

본 발명의 예시적 실시 형태를 자세히 설명하기 전에, 하기 정의를 내린다.

용어 "메티오닌의 합성 효율"은 메티오닌의 탄소 수율을 말한다. 이 효율은 탄소 기질 형태의 계로 들어온 에너지 투입률로서 계산된다. 본 발명에 있어서, 달리 지적되지 않는 한 이 값은 백분율 값((mol 메티오닌) (mol 탄소 기질)^-1 x 100)이다.

용어 "호모란티오닌의 합성 효율"은 호모란티오닌의 탄소 수율을 말한다. 이 효율은 탄소 기질 형태의 계로 들어온 에너지 투입률로서 계산된다. 본 발명에 있어서, 달리 지적되지 않는 한 이 값은 백분율 값((mol 호모란티오닌) (mol 탄소 기질)^-1 x 100)이다.

본 발명에 따른 바람직한 탄소 공급원은 당류, 예컨대 단당류, 이당류 또는 다당류이다. 예를 들어, 글루코스, 프룩토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 락토스, 말토스, 수크로스, 라피노스, 전분 또는 셀룰로스로 이루어지는 군 중에서 선택되는 당류가 특히 바람직한 탄소 공급원으로서 기능할 수 있다.

용어 "메티오닌 합성의 증가된 효율"은 유전학적으로 변형된 유기체간의 비교에 관한 것으로, 초기 야생형 유기체에 비해 메티오닌의 합성 효율이 더 높다.

용어 "메티오닌 수율"은 세포 덩어리 중량당 얻어지는 메티오닌의 양으로 계산되는 메티오닌의 수율을 말한다.

용어 "메티오닌 경로"는 당업계에 인식되어 있고, 야생형 유기체에서 일어나며 메티오닌의 생합성을 유도하는 일련의 반응을 말한다. 경로는 유기체마다 다를 수 있다. 유기체-특이적 경로의 상세는 웹사이트 [http://www.genome.jp/hegg/metabolism.html]에 열거된 교재 및 과학기술 문헌으로부터 알 수 있다. 특히, 본 발명의 의미에 속하는 메티오닌 경로를 도 1에 나타낸다.

용어 "호모란티오닌의 수율"은 세포 덩어리 중량당 얻어진 호모란티오닌의 양으로 계산되는 호모란티오닌의 수율을 말한다.

메티오닌 경로에서의 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적의 감소 및/또는 예방이란, 본 발명에 따라서 MetB, MetC, MetZ, MetE 및/또는 MetH와 같은 메티오닌 경로의 효소 활성을 변경시키지 않은 메티오닌-제조 미생물의 효율 및/또는 수율 및/또는 양에 비해, 호모란티오닌을 바람직하게는 90％ 미만, 70％ 미만, 50％ 미만, 30％ 미만, 25％ 미만, 20％ 미만, 15％ 미만, 10％ 미만, 5％ 미만 또는 2％ 미만의 효율 및/또는 수율 및/또는 양으로 제조하는 것을 의미한다.

메티오닌 및 호모란티오닌과 관련하여 상기 주어진 정의는 메티오닌 경로의 다른 대사산물에 대해서도 상응하게 적용된다.

본 발명의 목적에 있어서 용어 "유기체" 또는 "미생물"은 메티오닌과 같은 아미노산의 제조를 위해 통상 사용되는 임의의 유기체를 가리킨다. 특히, 용어 "유기체"는 원핵세포, 하등 진핵생물 및 식물과 관련된다. 상술한 유기체의 바람직한 군은 악티노 박테리아, 시아노 박테리아, 프로테오 박테리아, 클로로플렉수스 오란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus), 피렐룰라(Pirellula sp . 1), 할로 박테리아 및/또는 메타노콕시(methanococci), 바람직하게는 코리네형 박테리아, 미코박테리아, 스트렙토마이세스(streptomyces), 살모넬라, 에스케르키아 콜라이, 시겔라 및/또는 슈도모나스를 포함한다. 특히 바람직한 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰, 에스케르키아 콜라이, 바실루스속의 미생물, 특히 바실루스 섭틸리스, 및 스트렙토마이세스속의 미생물로부터 선택된다.

그러나, 본 발명의 유기체는 이스트, 예컨대 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 또는 세레비시에 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함할 수도 있다.

본 발명의 목적에 있이서 용어 "L-메티오닌 과잉 제조 미생물"이란, 야생형 미생물과 비교하여, 메티오닌 제조의 효율 및/또는 수율 및/또는 양이 100％ 이상, 200％ 이상, 300％ 이상, 400％ 이상, 500％ 이상, 600％ 이상, 700％ 이상, 800％ 이상, 900％ 이상 또는 1000％ 이상 증가한 미생물을 가리킨다.

식물 역시 미생물의 제조를 위해 본 발명에서 고려된다. 이러한 식물은 외떡잎 식물 또는 쌍떡잎 식물, 예컨대 외떡잎 또는 쌍떡잎 작물, 식용 식물 또는 마초 식물일 수 있다. 외떡잎 식물의 예에는 귀리속, 밀속, 호밀속, 보리속, 벼속, 기장속, 수크령속, 강아지풀속, 수수속, 옥수수속 등에 속하는 식물이 있다.

쌍떡잎 작물로는 그 중에서도 목화, 레구미노세스(leguminoses)와 같은 콩류 및 특히 자주개자리, 대두, 평지씨, 토마토, 사탕무, 감자, 장식용 식물뿐만 아니라 나무를 들 수 있다. 추가의 작물로는 과일(특히 사과, 배, 체리, 포도, 감귤, 파인애플 및 바나나), 기름야자나무, 차 나무, 카카오 나무, 커피 나무, 담배, 사이잘뿐만 아니라 관련 약용 식물, 인도사목 및 디기탈리스를 들 수 있다. 특히 바람직한 것은 곡물인 밀, 호밀, 귀리, 보리, 벼, 옥수수 및 수수, 사탕무, 평지씨, 대두, 토마토, 감자 및 담배이다. 추가의 작물은 US 6,137,030호에서 알 수 있다.

용어 "야생형 유기체" 또는 "야생형 미생물"은 유전학적으로 변형되지 않은 유기체를 가리킨다.

용어 "대사산물"은 전구체, 중간체 및/또는 최종 생성물로서 유기체의 대사 경로에 사용되는 화학적 화합물을 가리킨다. 이러한 대사산물은 화학적 구축 단위로서 기능할 뿐만 아니라 효소 상에서 조절 활성 및 그들의 촉매 활성을 발휘할 수 있다. 이러한 대사산물이 효소의 활성을 억제하거나 촉진할 수 있다는 것은 문헌에 공지되어 있다 (문헌 [Stryer, Biochemistry, (1995) W.H. Freeman & Company, New York]).

본 발명의 목적에 있어서 용어 "외부 대사산물"은 글루코스, 술페이트, 티오술페이트, 술파이트, 술피드, 암모니아, 산소 등과 같은 기질을 포함한다. 어떤 실시 형태에서 (외부) 대사산물은 소위 C1-대사산물을 포함한다. 후자의 대사산물은 예를 들어 메틸 공여체로서 기능할 수 있고, 포름에이트, 포름알데히드, 메탄올, 메탄티올, 디메틸-디술피드 등의 화합물을 포함할 수 있다.

용어 "생성물"은 메티오닌, 바이오매스, CO₂ 등을 포함한다.

아미노산은 모든 단백질의 기본 구조 단위를 구성하며, 그 자체로 유기체에서 정상적인 세포 기능을 위해 필수적이다. 용어 "아미노산"은 당업계에 널리 알려져 있다. 20종이 있는 단백질원성 아미노산은 펩티드 결합에 의해 연결되어 있는 단백질을 위한 구조 단위로서 기능하지만, 비단백질원성 아미노산은 통상 단백질에서는 발견되지 않는다 (문헌 [Ullmann's Encyclopaedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pages 57-97, VCH, Weinheim (1985)] 참조). 아미노산은 D- 또는 L-광학 배열일 수 있지만, L-아미노산만이 일반적으로 자연 발생하는 단백질에서 발견되는 형태이다. 20종의 단백질원성 아미노산 각각의 생합성 및 분해 경로는 원핵세포 및 진핵세포 모두에 있어서 잘 규명되어 있다 (예를 들어 문헌 [Stryer, L. Biochemistry, 3rd edition, pages 578-590 (1988)] 참조). 생합성의 복잡함으로 인해 일반적으로 필수 영양소인 필수 아미노산, 즉 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발린은 간단한 생합성 경로에 의해 나머지 11종의 비필수 아미노산, 즉 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르테이트, 시스테인, 글루타메이트, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린 및 티로신으로 쉽게 전환된다. 고등 동물은 이들 아미노산의 일부를 합성하는 능력을 보유하고 있지만, 필수 아미노산은 정상적인 단백질 합성이 일어나도록 하기 위해 음식물로부터 공급되어야 한다. 단백질 생합성에서의 그들의 기능뿐만 아니라, 이들 아미노산은 그 자체로 유익한 화학물질이며, 다수는 식품, 사료, 화학물질, 화장품, 농업 및 제약 산업에서 여러 용도를 갖는 것으로 밝혀지고 있다. 리신은 영양면에서 사람뿐만 아니라 단위(單胃) 동물, 예컨대 가금류 및 돼지에게도 중요한 아미노산이다. 글루타메이트는 조미료 첨가제로서 가장 흔히 사용되며, 식품 산업에서 널리 사용되는 것은 아스파르테이트, 페닐알라닌, 글리신 및 시스테인이다. 글리신, L-메티오닌 및 트립토판은 모두 제약 산업에서 이용된다. 글루타민, 발린, 류신, 이소류신, 히스티딘, 아르기닌, 프롤린, 세린 및 알라닌은 제약 및 화장품 산업 모두에 있어서 유용하다. 트레오닌, 트립토판 및 D/L-메티오닌은 통상적인 사료 첨가제이다 (문헌 [Leuchtenberger, W. (1996), Amino acids - technical production and use, p.466-502 in Rehm et al. (editors) Biotechnology, Vol. 6, Chapter 14a, VCH: Weinheim]). 또한, 이들 아미노산은 합성 아미노산 및 단백질의 합성을 위한 전구체, 예컨대 N-아세틸 시스테인, S-카르복시메틸-L-시스테인, (S)-5-히드록시트립토판 및 문헌 [Ullmann's Encyclopaedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, p.57-97, VCH: Weinheim, 1985]에 기재된 그 외의 것이 유용하다고 발견되었다.

이들 천연 아미노산을 제조할 수 있는 유기체, 예컨대 박테리아에서의 이들 천연 아미노산의 생합성은 잘 규명되어 있다 (박테리아 아미노산 생합성 및 그의 조절에 대한 개설 참조(문헌 [Umbarger H. E. (1978), Ann. Rev. Biochem. 47:533-606] 참조)). 글루타메이트는 시트르산 사이클의 중간체인 α-케토글루타레이트의 환원적 아미노화에 의해 합성된다. 그 후에 글루타메이트로부터 글루타민, 프롤린 및 아르기닌이 각각 제조된다. 세린의 생합성은 3-포스포글리세레이트(해당(解糖) 작용의 중간체)로 시작해서, 산화, 아미노기 전달 반응 및 가수분해 단계 후에 이 아미노산을 생성하는 3단계 공정이다. 시스테인 및 글리신은 모두 세린으로부터 제조되며, 전자는 호모시스테인을 세린과 축합시켜서 제조되며, 후자는 세린 트랜스히드록시메틸라제에 의해 촉매되는 반응에서 측쇄 β-탄소 원자를 테트라히드로폴레이트로 전이시켜 제조된다. 페닐알라닌 및 티로신은, 프레페네이트의 합성 이후에 최후의 두 단계만이 상이한 9단계 생합성 경로에서, 해당 작용성 및 펜토스 포스페이트 경로 전구체 에리트로스-4-포스페이트 및 포스포에놀피루베이트로부터 합성된다. 또한 트립토판은 상기 두 초기 분자로부터 제조되지만, 그 합성은 11 단계 경로이다. 또한 티로신은 페닐알라닌 히드록실라제에 의해 촉매되는 반응에서 페닐알라닌으로부터 합성될 수 있다. 알라닌, 발린 및 류신은 모두 해당 작용의 최종 생성물인 피루베이트의 생합성 생성물이다. 아스파르테이트는 시트르산 사이클의 중간체인 옥살로아세테이트로부터 형성된다. 아스파라긴, 메티오닌, 트레오닌 및 리신은 각각 아스파르테이트의 전환에 의해 제조된다. 이소류신은 트레오닌으로부터 형성될 수 있다. 복잡한 9 단계 경로는 활성화 당인 5-포스포리보실-1-파이로포스페이트로부터 히스티딘을 제조한다.

세포의 단백질 합성 필요량보다 과잉의 아미노산은 저장되지 않으며, 대신 분해되어 세포의 주요 대사 경로를 위한 중간체를 제공한다 (문헌 [Stryer, L., Biochemistry, 3rd edition, Chapter 21 "Amino acid degradation and the urea cycle", p. 495-516 (1988)]의 보고를 참조). 세포는 원치않는 아미노산을 유용한 대사 중간체로 전환할 수 있지만, 아미노산 제조는 에너지, 전구체 분자, 및 이들의 합성에 필요한 효소 면에서 고비용이다. 따라서, 아미노산 생합성이 피드백 억제에 의해 조절되는 것, 즉 특정한 아미노산의 존재가 그 자신의 제조를 늦추거나 완전히 멈추게 하는 것은 놀라운 일이 아니다 (아미노산 생합성 경로에서 피드백 기전의 개관, 문헌 [Stryer, L., Biochemistry, 3rd edition, Chapter 24: "Biosynthesis of amino acids and heme", p.575-600 (1988)] 참조). 따라서, 임의의 특정한 아미노산의 산출량은 세포 내 존재하는 아미노산의 양에 의해 제한된다.

그람 양성 토양 박테리아 코리네박테리움 글루타미쿰은 다양한 아미노산의 공업적 제조에 널리 사용된다. 주요 공업적 생성물인 리신 및 글루타메이트의 생합성이 오랫동안 연구되어 왔지만, 메티오닌 생합성 경로의 조절에 대한 지식은 제한되어 있다. 적어도 주요 효소의 경로는 공지되어 있다 (도 1 참조). 씨. 글루타미쿰은 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제(MetA) (EC 2.3.1.31)와의 아세틸화에 의해 호모세린을 활성화시킨다. 황 전환 작용 및 직접 술프히드릴화를 모두 사용하여 호모시스테인을 제조하는 것을 더 나타내었다 (문헌 [Hwang, B. J., Yeom, H. J., Kim, Y., Lee, H. S., J. Bacteriol. 2002, 1845, 1277-86]). 황 전환 작용은 시스타티오닌-γ-신타제(MetB) (EC 2.5.1.48)에 의해 촉매된다 (문헌 [Hwang, B. J., Kim, Y., Kim, H. B., Hwang, H. J., Kim, J. H., Lee, H. S., Mol Cells 1999, 93, 300-8]). 이 반응에서, 시스테인 및 O-아세틸-호모세린은 결합하여 시스타티오닌이 되고, 이는 시스타티오닌-β-리아제(AecD로도 알려져 있는 MetC) (EC 4.4.1.8) (문헌 [Kim, J. W., Kim, H. J., Kim, Y., Lee, M. S., Lee, H. S., MoI Cells 2001, 112, 220-5, 문헌 [Ruckert et al., 2003, 상기 참조])에 의해 호모시스테인, 피루베이트 및 암모니아로 가수분해된다. 직접 술프히드릴화에서, O-아세틸호모세린 술프히드롤라제(MetY로도 알려져 있는 MetZ) (EC 2.5.1.49) (문헌 [Ruckert et al., 2003, 상기 참조])는 O-아세틸호모세린 및 술피드를 호모시스테인 및 아세테이트로 전환시킨다. 최종적으로, 씨. 글루타미쿰은 메티오닌을 산출하는 호모시스테인의 S-메틸화를 위한 2종의 상이한 효소 (문헌 [Lee, H. S., Hwang, B. J., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003, 625-6, 459-67], 문헌 [Ruckert et al., 2003, 상기 참조]), 즉 코브(I)알라민 의존성 메티오닌 신타제 I(MetH) (EC 2.1.1.13) 및 코브(I)알라민 독립성 메티오닌 신타제 II(MetE) (EC 2.1.1.14)를 갖는다. 메틸 공여체로서, 전자는 5-메틸테트라히드로폴레이트를 이용하고, 후자는 5-메틸테트라히드로프테로일트리-L-글루타메이트를 이용한다.

최근, TetR족의 추정 전사 조절인자 단백질이 발견되었다 (문헌 [Rey et al., Journal of Biotechnology 2003, 103, 51-65]). 이 조절인자는 메티오닌 및 황 대사에 속하는 몇몇 유전자의 전사를 억제함을 보여주었다. 조절인자 단백질의 유전자 녹아웃(gene knockout)은 hom 코딩 호모세린 데히드로게나제, metZ 코딩 O-아세틸호모세린 술프히드롤라제, metK 코딩 S-아데노실메티오닌(SAM) 신타제(EC 2.5.1.6), cysK 코딩 시스테인 신타제(EC 2.5.1.47), cysI 코딩 추정 NADPH 의존성 술파이트 리덕타제, 및 마지막으로 ssuD 코딩 추정 알칸술포네이트 모노옥시게나제의 발현을 증가시켰다. 레이(Rey) 외 (문헌 [Molecular Microbiology 2005, 56, 871-887)] 역시 metB 유전자가 mcbR을 뺀 균주에서 현저히 유도된다는 것을 발견하였다.

본 발명은 호모란티오닌의 형성의 감소 및/또는 예방, 특히 메티오닌 경로에서 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적의 감소 및/또는 예방이 미생물 내에 바람직한 화합물, 예컨대 L-메티오닌의 합성 효율 및/또는 수율을 증가시킬 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 근거하고 있다.

메티오닌 경로에서 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적은 효율 및/또는 수율을 감소시키거나, 또는 O-아세틸-호모세린 및 호모시스테인이 MetB-촉매되어 호모란티오닌으로 전환되는 것을 저해함으로써, 감소시키고/시키거나 예방할 수 있다. 효율의 감소, 또는 O-아세틸-호모세린 및 호모시스테인이 MetB-촉매되어 호모란티오닌으로 전환되는 것은 MetB의 활성이 변경되지 않은 메티오닌-제조 미생물의 효율 및/또는 수율 및/또는 양에 비해 90％ 미만, 70％ 미만, 50％ 미만, 30％ 미만, 25％ 미만, 20％ 미만, 15％ 미만, 10％ 미만, 5％ 미만 또는 2％ 미만의 효율 및/또는 수율 및/또는 양으로 호모란티오닌이 제조됨을 의미한다.

추가로 또는 별법으로, 메티오닌 경로에서 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적은 호모란티오닌이 물에 의해 호모시스테인, 2-옥소부타노에이트 및 NH₄ ⁺로 MetC-촉매된 분할을 일으키는 것에 대한 효율 및/또는 수율을 증가시킴으로써 감소시키고/시키거나 예방할 수 있다. 호모란티오닌이 물에 의해 호모시스테인, 2-옥소부타노에이트 및 NH₄ ⁺로 MetC-촉매된 분할을 일으키는 것에 대한 효율을 증가시키는 것은 호모란티오닌으로부터의 호모시스테인의 제조 효율 및/또는 수율 및/또는 양이 MetB 및/또는 MetC의 활성이 변경되지 않은 메티오닌-제조 미생물에서의 효율 및/또는 수율 및/또는 양에 비해 40％ 이상, 45％ 이상, 50％ 이상, 55％ 이상, 60％ 이상, 65％ 이상, 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상 또는 98％ 이상 증가됨을 의미한다.

미생물 내 L-메티오닌의 합성 효율 및/또는 수율은, 전사 조절인자 단백질 McbR의 함량 및/또는 생물학적 활성이 야생형 미생물에 비해 감소된다면 추가로 더 증가할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 측면에서, 전사 조절인자 단백질 McbR의 함량 및/또는 생물학적 활성이 야생형 미생물에 비해 감소되고, 메티오닌 경로에서 호모란티오닌의 형성이 예방된 미생물이 제공된다.

코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 미생물 내 전사 조절인자 McbR의 녹아웃은 세포 대사에 심각한 결과를 가져온다. 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 전사 리프레서 McbR의 녹아웃은 세포 대사에 강한 영향을 준다. 표현형은 성장 감소, 바이오매스 수율 감소 및 세포내 시스테인 및 호모시스테인과 같은 메티오닌 전구체의 축적을 포함한다. 흥미롭게도, 메티오닌 축적은 관찰되지 않았다. 그러나, 본원에서 McbR의 녹아웃은 또한 호모란티오닌을 축적시키고, 트레오닌 독립적 이소류신을 합성시키는 것이 발견되었다.

다른 유기체에 의한 호모란티오닌의 축적은 종래 문헌에 기재되어 있다. 이. 콜라이의 메티오닌 영양요구성 균주는 대량의 호모란티오닌을 축적한다 (문헌 [Huang, H. T., Biochemistry 1963, 2, 296-8]). 또한, 메티오닌 영양요구성 아스페르길루스 니두란스(Aspergillus nidulans)는 호모란티오닌을 축적한다 (문헌 [Paszewski, A., Grabski, J., Acta Biochim. Pol. 1975, 223, 263-8]). 양 유기체에서 공통적으로 조사된 것은 메티오닌 신타제의 녹아웃이었다. 그뿐 아니라 사람 간의 시스타티오나제는 호모란티오닌을 축적할 수 있다 (문헌 [Tallan, H. H. et al., Biochem Biophys Res Commun 1971, 432, 303-10]). 또한, 스트렙토마이세스 파에오크로모게네스(Streptomyces phaeochromogenes)의 시스타티오나제를 호모란티오닌의 시험관내 합성에 사용하였고 (문헌 [Kanzaki, H. et al., Agric Biol Chem 1986, 502, 391-397]), 애기장대로부터의 시스타티오닌-γ-신타제는 시험관내에서 호모시스테인 및 O-아세틸-호모세린으로부터 호모란티오닌을 제조하였다 (문헌 [Ravanel, S. et al., Biochem J 1998, 331 (Pt 2), 639-48]).

씨. 글루타미쿰과 같은 유기체에 있어서, 호모란티오닌의 형성(도 3 참조)은 세포내 호모시스테인의 높은 수준으로 인한 MetB의 부반응임이 발견되고 있다. 낮은 기질 특이성 및 상승된 호모시스테인 역가로 인해, MetB는 O-아세틸-호모세린과 함께 기질로서 시스테인 대신 뜻하지 않게 호모시스테인을 사용한다. 이 반응은 시스타티오닌 대신 호모란티오닌을 생성한다. 호모란티오닌의 MetC에 의한 분할이 불량하면 호모란티오닌이 다량 축적된다.

특히 McbR-녹아웃 균주(씨. 글루타미쿰 ΔMcbR 균주라 부르기도 함)에서 호모시스테인 수준의 상승은 호모세린 데히드로게나제(Hom), O-아세틸호모세린 술프히드롤라제(MetZ) 및 S-아데노실메티오닌 신타제(MetK)의 과다발현에 의한 것일 수 있다 (문헌 [Rey et al., 2003, 상기 참조]). Hom 및 MetZ는 호모시스테인 역가의 직접적 증가를 유도할 수 있지만, MetK는 메티오닌을 SAM으로 전환하고, 그 후 SAM은 S-아데노실 호모시스테인에 의해 호모시스테인으로 재전환된다. 상승된 호모시스테인 수준 이외에도, McbR 녹아웃 균주 내 MetB의 과다발현은 호모란티오닌의 형성을 선호한다. 이는 현재 McbR 녹아웃 균주의 조 추출물은 야생형에 비해 약 3배의 MetB 활성을 나타낼 수 있음을 보여주고 있다.

호모란티오닌이 MetB의 부반응에 의해 씨. 글루타미쿰 내에 형성됨을 확인하기 위해, MetB를 씨. 글루타미쿰 ΔMcbR에서 녹아웃시켰다. MetB의 녹아웃이 씨. 글루타미쿰 ΔMcbR에서 호모란티오닌의 축적을 완전히 예방함으로써, 본원의 발견이 지지된다. 호모란티오닌의 MetC에 의한 느린 분할은, 호모시스테인이 재순환되지만 O-아세틸-호모세린이 아세테이트, 2-옥소부타노에이트 및 암모니아로 전환되는 개방 대사 사이클을 유도한다. 이 사이클은 아세틸-CoA를 소모할 뿐 아니라 중요한 이소류신 전구체: 2-옥소부타노에이트를 공급한다. 이는 ΔMcbR 균주가 트레오닌 독립적 경로를 통해 이소류신을 합성할 수 있도록 한다.

따라서, 본 발명의 또 다른 실시 형태에 따르면, 시스타티오닌-γ-신타제(MetB)의 함량 및/또는 생물학적 활성을 야생형 미생물에 비해 감소시킴으로써, 미생물의 메티오닌 경로에서 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적은 감소되고/되거나 예방된다. MetB를 코딩하는 유전자를 감쇠하고/하거나 분열하고/하거나 제거함으로써, 시스타티오닌-γ-신타제(MetB)의 함량 및/또는 생물학적 활성을 야생형 미생물에 비해 감소시킬 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 미생물에서 분열된 MetB 유전자는 기능성 MetB 단백질의 발현을 예방한다. 실시예에서 보는 바와 같이, MetB의 녹아웃은 코리네박테리움 글루타미쿰 및 씨. 글루타미쿰 ΔMcbR과 같은 미생물에서 호모란티오닌의 축적을 완전히 예방한다.

또한, 호모란티오닌을 호모시스테인으로 효과적으로 전환시킬 수 있는 시스타티오닌-β-리아제(MetC) 돌연변이체를 코딩하는 이종 유전자를 도입함으로써, 메티오닌 경로에서 호모란티오닌의 형성을 감소시키고/시키거나 예방할 수 있다.

호모란티오닌을 호모시스테인으로 효과적으로 전환시킬 수 있는 시스타티오닌-β-리아제(MetC) 돌연변이체는 호모란티오닌으로부터의 호모시스테인의 제조 효율 및/또는 수율 및/또는 양이 MetB 및/또는 MetC의 활성이 변경되지 않은 메티오닌-제조 미생물에서의 효율 및/또는 수율 및/또는 양과 비교하여 40％ 이상, 45％ 이상, 50％ 이상, 55％ 이상, 60％ 이상, 65％ 이상, 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상 또는 98％ 이상인 것을 특징으로 한다.

호모시스테인 및 시스테인의 축적은 메티오닌 과잉 제조, 특히 축적된 호모시스테인이 metH 및/또는 metE의 활성에 의해 촉매된 메티오닌으로 추가 대사되는 경우에 유익하다고 간주될 수 있다.

또한, O-아세틸-호모세린 및 시스테인을 시스타티온으로 효과적으로 전환시킬수 있고, O-아세틸-호모세린 및 호모시스테인을 호모란티오닌으로 전환시킬 수 없는 시스타티오닌-γ-신타제(MetB) 돌연변이체를 코딩하는 이종 유전자를 도입함으로써, 메티오닌 경로에서 호모란티오닌의 형성을 감소시키고/시키거나 예방할 수 있다.

O-아세틸-호모세린 및 시스테인을 시스타티온으로 효과적으로 전환할 수 있는 시스타티오닌-γ-신타제(MetB) 돌연변이체는 시스테인 및 O-아세틸-호모세린으로부터 시스타티온의 제조 효율 및/또는 수율 및/또는 양이, MetB의 활성이 변경되지 않은 메티오닌-제조 미생물에서의 효율 및/또는 수율 및/또는 양과 비교하여 40％ 이상, 45％ 이상, 50％ 이상, 55％ 이상, 60％ 이상, 65％ 이상, 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상 또는 98％ 이상 증가되는 것을 특징으로 한다.

O-아세틸-호모세린 및 호모시스테인을 호모란티오닌으로 전환시킬 수 없는 시스타티오닌-γ-신타제(MetB) 돌연변이체는 MetB의 활성이 변경되지 않은 메티오닌-제조 미생물에서의 효율 및/또는 수율 및/또는 양과 비교하여 70％ 미만, 50％ 미만, 30％ 미만, 25％ 미만, 20％ 미만, 15％ 미만, 10％ 미만 또는 5％ 미만의 효율 및/또는 수율 및/또는 양으로 호모란티오닌을 제조하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 추가의 실시 형태에 따르면, O-아세틸-호모세린 술프히드롤라제 (MetZ), 코브(I)알라민 의존성 메티오닌 신타제 I(MetH) 및 코브(I)알라민 독립성 메티오닌 신타제 II(MetE)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 단백질의 함량 및/또는 생물학적 활성이 야생형 미생물과 비교하여 향상되고/되거나 과다발현된 미생물이 제공된다.

효소의 함량 또는 양 및/또는 생물학적 활성의 증가 또는 감소는 반응이 더 추진되거나 채널링되어야 하는 방향과 관련하여 이해되어야 한다. 효소의 함량 및/또는 생물학적 활성의 증가, 또는 효소의 함량 및/또는 생물학적 활성의 감소는 도 1에 나타낸 경로에 따라 더 많거나 더 적은 생성물을 얻는 방식으로 효소의 양 및/또는 활성에 영향을 미치는 것으로 이해된다.

본 발명의 한 실시 형태에서는, 메티오닌 경로의 오직 하나의 효소의 양 및/또는 활성을 변형하기에 충분할 수 있다. 별법으로, 이 대사 경로의 여러 효소의 양 및/또는 활성은 변형될 수 있다. 별법으로, 메티오닌 경로의 여러 또는 모든 효소의 양 및/또는 활성은 동시에 영향을 받을 수 있다. 유전학적 변형에 의해 이러한 유기체를 얻을 수 있는 방법은 당업계의 일반 상식에 속한다.

하기 표에서는, 메티오닌 합성의 효율을 증가시키기 위해 함량 및/또는 생물학적 활성을 변형시킬 수 있는 메티오닌 경로에서의 효소를 위한 특이적 실시예가 주어진다.

본 발명에 따른 유기체를 유전학적으로 변형함으로써, 메티오닌의 합성 효율 및/또는 수율을 증가시켜, 이들 메티오닌-과잉 제조 유기체가 메티오닌을 바람직하게는 50％ 이상, 60％ 이상, 65％ 이상, 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상 또는 85％ 이상의 효율 및/또는 수율로 제조하는 것을 특징으로 하도록 할 수 있다. 야생형 미생물과 비교하여, 본 발명에 따른 메티오닌-과잉 제조 유기체에서 메티오닌의 제조 효율 및/또는 수율 및/또는 양은 바람직하게는 100％ 이상, 200％ 이상, 300％ 이상, 400％ 이상, 500％ 이상, 600％ 이상, 700％ 이상, 800％ 이상, 900％ 이상 또는 10000％ 이상 증가한다.

본 발명에 따른 미생물은 코리네형 박테리아, 미코박테리아, 스트렙토마이세테스(streptomycetes), 살모넬라, 에스케르키아 콜라이, 시겔라, 바실루스, 세라티아 및 슈도모나스로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 유기체는 바람직하게는 코리네박테리움(Corynebacterium)속의 미생물, 특히 코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum), 씨. 아세토글루타미쿰(C. acetoglutamicum), 씨. 아세토필룸(C. acetophilum), 씨. 암모니아게네스(C. ammoniagenes), 씨. 글루타미쿰, 씨. 릴리움(C. lilium), 씨. 니트릴로필루스(C. nitrilophilus) 또는 씨. 스펙(C. spec)을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 유기체는 또한 브레비박테리움(Brevibacterium)속의 구성원, 예컨대 브레비박테리움 하르모니아게네스(Brevibacterium harmoniagenes), 브레비박테리움 보타니쿰(Brevibacterium botanicum), 비. 디바라티쿰(B. divaraticum), 비. 플라밤(B. flavam), 비. 헤알릴(B. healil), 비. 케토글루타미쿰(B. ketoglutamicum), 비. 케토소레둑툼(B. ketosoreductum), 비. 락토페르멘툼(B. lactofermentum), 비. 린넨스(B. linens), 비. 파라피놀리티쿰(B. paraphinolyticum) 및 비. 스펙(B. spec)을 포함한다. 특히, 코리네박테리움 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(ATCC 13032), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(ATCC 15806), 코리네박테리움 아세토아시도필룸(ATCC 13870), 코리네박테리움 테르모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes) (FERM BP-1539), 코리네박테리움 멜라스세콜라(Corynebacterium melassecola) (ATCC 17965), 코리네박테리움 글루타미쿰(KFCC 10065), 코리네박테리움 글루타미쿰(DSM 17322), 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens) (YS-314) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 (ATCC21608)으로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다.

약자 KFCC는 한국 종균협회를 의미하며, 약자 ATCC는 미국 미생물 보존 센터를 의미한다. 약자 DSM은 독일 생물 자원 센터를 의미한다.

에스케리키아속 미생물은 에스케르키아 콜라이를 포함하는 군 중에서 선택할 수 있다. 살모넬라속 미생물은 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)을 포함하는 군 중에서 선택할 수 있다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 유기체는 코리네박테리움 글루타미쿰, 에스케르키아 콜라이, 사카로마이세스 세레비시에 및 바실루스 섭틸리스로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

효소의 함량 또는 양 및/또는 생물학적 활성의 증가 또는 감소와 관련하여, 상술한 유기체와 같은 숙주에서 단백질의 양 및/또는 활성을 증가시키기 위해 당업계에 알려진 모든 방법을 사용할 수 있다.

효소의 양은 각 단백질의 외인성 버전의 발현에 의해 증가할 수 있다. 또한, 내인성 단백질의 발현은 프로모터 및/또는 인핸서 요소의 활성 및/또는, 전사, 번역 또는 후번역 수준에 대한 개별 단백질의 활성을 조절하는 다른 조절 활성, 예컨대 포스포릴화, 수모일화, 유비퀴틸화 등에 영향을 줌으로써 증가시킬 수 있다.

예를 들어 상술한 효소의 양을 단순히 증가시키는 것 이외에도, 효소의 활성을 증가시키는 특이적 돌연변이를 갖는 효소를 사용함으로써 단백질의 활성을 증가시킬 수 있다. 이러한 돌연변이는, 예를 들어 피드백 억제를 담당하는 효소 영역을 불활성화시킬 수 있다. 예를 들어 비보존성 돌연변이를 도입하여 효소를 돌연변이시킴으로써, 효소가 더 이상 피드백 조절을 제공하지 않아 생성물이 더 제조되더라도 효소의 활성은 하강 조절되지 않는다. 돌연변이는 효소의 내인성 카피로 도입되거나, 또는 외인성 효소의 상응하는 돌연변이체 형태를 과다발현함으로써 제공될 수 있다. 이러한 돌연변이로는 포인트 돌연변이, 결실형 돌연변이 또는 삽입형 돌연변이를 들 수 있다. 포인트 돌연변이는 보존성 또는 비보존성일 수 있다. 또한, 결실형 돌연변이는 오직 2종 또는 3종의 아미노산 내지 최대 각각의 단백질의 도메인을 포함할 수 있다.

따라서, 단백질의 활성 및 양의 증가는 여러 경로, 예를 들어 전사, 번역, 또는 단백질 수준에서 억제 조절 기전을 차단하거나, 또는 예를 들어 내인성 metC 유전자를 도입하거나 또는 MetC를 코딩하기 위한 핵산을 도입함으로써 이들 단백질을 코딩하는 핵산의 유전자 발현을 야생형에 비해 증가시킴으로써 달성할 수 있다.

한 실시 형태에서, 효소 활성 및 양을 각각 야생형에 비해 증가시키는 것은 이러한 효소, 예컨대 MetC, MetZ, MetE 및 MetH를 코딩하는 핵산의 유전자 발현을증가시켜 달성한다. 서열은 각각의 데이터베이스, 예를 들어 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), EMBL(http://www.embl.org), Expasy(http://www.expasy.org/), KEGG(http://www.genome.ad.jp/kegg/kegg.html) 등에서 구할 수 있다. 예는 표 1에 주어진다.

추가의 실시 형태에서, 표 1의 효소의 양 및/또는 활성의 증가는 표 1의 효소를 코딩하는 핵산을 유기체, 바람직하게는 씨. 글루타미쿰 또는 이. 콜라이에 도입함으로써 달성된다.

양 및/또는 활성의 증가를 도모한다면, 원칙상 표 1에 열거된 단백질의 효소 활성을 갖는 다양한 유기체의 단백질을 사용할 수 있다. 인트론을 함유하는 진핵 공급원으로부터 이러한 효소의 게놈 핵산 서열과 함께, 상응하는 cDNA와 같이 이미 처리된 핵산 서열은 숙주 유기체가 상응하는 mRNA를 스플라이싱할 수 없거나 스플라이싱 할 수 없게 되는 경우에 사용된다. 본원에 언급된 모든 핵산은 예를 들어 RNA, DNA 또는 cDNA 서열일 수 있다.

메티오닌의 합성 효율이 증가된 유기체를 제조하기 위한 본 발명에 따른 한 방법에서, 상술한 기능성 또는 비기능성, 피드백-조절되거나 피드백과 무관한 효소들 중 하나를 코딩하는 핵산 서열이 씨. 글루타미쿰 또는 이. 콜라이와 같은 미생물 각각에 전이된다. 이 전이는 각각의 효소의 발현을 증가시키고, 대응하여 목적하는 반응 경로를 통해 대사 흐름을 늘린다.

본 발명에 따르면, 단백질의 양 및/또는 활성의 증가 또는 감소는 통상적으로

a) 본 발명의 유기체 내 기능성 프로모터 서열; 그에 작용적으로 연결된, 표 1의 단백질 또는 그의 기능적 등가 부분을 코딩하는 DNA 서열; 및 본 발명의 유기체 내 기능성 종결 서열인 핵산 서열들, 바람직하게는 DNA 서열들을 포함하는 벡터를 5'-3'-배향에서 제조하는 단계, 및

b) 단계 a)로부터의 벡터를 씨. 글루타미쿰 또는 이. 콜라이와 같은 본 발명의 유기체에 전이하고, 임의로 각각의 게놈 내로 통합하는 단계

를 포함한다.

효소의 기능적 등가 부분이 본 발명의 범위 내에 있다고 언급되는 경우, 표 1의 효소를 코딩하는 핵산 서열의 단편은 그 발현이 각각의 전장 단백질의 효소 활성을 갖는 단백질을 생성함을 의미한다.

본 발명에 따르면, 비기능성 효소는 각각 기능성 효소 및 그의 기능적 등가 부분과 동일한 핵산 서열 및 아미노산 서열을 가지나, 일부 지점에서는 비기능성 효소가 각각의 반응을 촉매하지 않거나 또는 아주 제한된 범위에서 촉매할 수 있는 효과를 갖는 뉴클레오티드 또는 아미노산의 포인트 돌연변이, 삽입형 돌연변이 또는 결실형 돌연변이를 갖는다. 이들 비기능성 효소는 여전히 각각의 반응을 촉매할 수 있지만 더 이상 피드백 조절되지 않는 효소와 다르다. 비기능성 효소는 또한 핵산 서열 수준 또는 아미노산 서열 수준에서 포인트 돌연변이, 삽입형 돌연변이, 또는 결실형 돌연변이를 갖는 표 1의 효소를 포함하고, 그렇더라도 효소의 생리적 결합 파트너와 상호 반응할 수 없다. 이러한 생리적 결합 파트너는 예를 들어 각각의 기질을 포함한다. 비기능성 돌연변이체는 돌연변이체를 유도하는 야생형 효소가 촉매할 수 있는 반응을 촉매할 수 없다.

본 발명에 따르면, 용어 "비기능성 효소"는 각각의 아미노산 수준 및 핵산 수준에서 각각의 기능성 효소에 대해 필수 서열 상동성을 갖지 않는 유전자 또는 단백질을 포함하지 않는다. 따라서, 각각의 반응을 촉매할 수 없고 각각의 효소와의 필수 서열 상동성을 갖지 않는 단백질은 정의에 의해 본 발명의 용어 "비기능성 효소"를 의미하지 않는다. 본 발명의 범위 내에 있는 비기능성 효소는 비활성화 또는 비활성 효소라고도 한다.

따라서, 상술한 포인트 돌연변이, 삽입형 돌연변이 및/또는 결실형 돌연변이를 갖는 본 발명에 따른 표 1의 비기능성 효소는 본 발명에 따른 표 1의 야생형 효소 또는 그의 기능적 등가 부분에 대해 필수 서열 상동성을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 실질적인 서열 상동성은 일반적으로 DNA 분자 또는 단백질 각각의 핵산 서열 또는 아미노산 서열이 표 1의 단백질 또는 그의 기능적 등가 부분 각각의 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 40％ 이상, 바람직하게는 50％ 이상, 더욱 바람직하게는 60％ 이상, 보다 바람직하게는 70％ 이상, 특히 바람직하게는 90％ 이상, 더욱 특히 바람직하게는 95％ 이상, 가장 바람직하게는 98％ 이상 동일함을 나타내는 것으로 이해된다.

두 단백질의 동일성은 단백질 각각의 전체 길이에 걸친 아미노산의 동일성, 특히 CLUSTAL 방법(문헌 [Higgins et al., (1989), Comput. Appl. Biosci., 5(2), 151])을 적용한 디엔에이 스타 인크.(DNA Star, Inc.; 미국 위스콘신주 매디슨 소재)의 레이저진(Lasergene) 소프트웨어의 도움을 받아 비교 계산된 동일성으로 이해된다.

상동성은 또한 CLUSTAL 방법(문헌 [Higgins et al., (1989), Comput. Appl. Biosci., 5(2), 151])을 적용한 디엔에이 스타 인크.(미국 위스콘신주 매디슨 소재)의 레이저진 소프트웨어의 도움을 받아 계산할 수도 있다.

DNA 서열의 동일성은 대응하여 이해된다.

상술한 방법을 사용하여 표 1의 기능성 또는 비기능성, 피드백-조절되거나 피드백과 무관한 효소 또는 그의 기능적 등가 부분을 코딩하는 DNA 서열의 발현을 증가시킬 수 있다. 프로모터 및 종결 서열과 같은 조절 서열을 포함하는 이러한 벡터의 용도는 당업자에게 알려져 있다. 또한, 당업자는 단계 a)로부터의 벡터를 씨. 글루타미쿰 또는 이. 콜라이와 같은 유기체로 전이시키는 방법, 및 유기체의 게놈 내로 통합될 수 있도록 벡터가 가져야 하는 특성을 알고 있다.

예를 들어 이. 콜라이와 같은 다른 유기체로부터 효소를 코딩하는 핵산을 전이함으로써 씨. 글루타미쿰과 같은 유기체 내 효소 함량이 증가된다면, 유전자 코드에 따라 폴리펩티드 서열의 역번역에 의해 예를 들어 이. 콜라이로부터의 핵산 서열에 의해 구성된 아미노산 서열을, 유기체-특이적 코돈 사용으로 인해 더 자주 사용되는 코돈을 주로 포함하는 핵산 서열 내로 전이하는 것을 권할 만하다. 코돈 사용량은 관련 유기체의 다른 공지된 유전자의 컴퓨터 평가에 의해 측정할 수 있다.

본 발명에 따르면, 표 1의 효소를 코딩하는 핵산의 유전자 발현 및 활성 각각은 또한 유기체, 특히 씨. 글루타미쿰 또는 이. 콜라이 각각의 내인성 효소의 발현 조작으로도 이해된다. 이는 예를 들어 이들 효소를 코딩하는 유전자를 위한 프로모터 DNA 서열을 변경함으로써 달성할 수 있다. 이들 효소의 발현율을 변경, 바람직하게는 증가시키는 이러한 변경은 DNA 서열을 제거 또는 삽입함으로써 달성할 수 있다.

내인성 유전자의 프로모터 서열의 변경은 통상 유전자의 발현량을 변경시키므로, 세포 내 또는 유기체 내에서 측정가능한 활성을 변경시킨다.

또한, 내인성 유전자 발현의 변경 및 증가는 각각 형질전환된 유기체를 발생하지 않으며, 이들 유전자의 프로모터와 상호 반응하는 조절 단백질에 의해 달성될 수 있다. 이러한 조절인자는 예를 들어 WO 96/06166호에 기재된 DNA 결합 도메인 및 전사 활성제 도메인로 이루어진 키메라 단백질일 수 있다.

내인성 유전자의 활성 및 함량을 증가시키기 위한 추가의 방법은 내인성 유전자의 전사에 관여하는 전사 인자를 예를 들어 과다발현에 의해 상승 조절하는 것이다. 전사 인자의 과다발현 방법은 당업자에게 알려져 있고, 본 발명의 범위 내에 있는 표 1의 효소의 경우에도 개시된다.

또한, 내인성 유전자의 활성 변경은 내인성 유전자 카피의 타켓 돌연변이 유발에 의해 달성될 수 있다.

표 1의 효소를 코딩하는 내인성 유전자의 변경은 또한 효소의 후번역 변형에 영향을 주어 달성할 수 있다. 이는 예를 들어 과다발현 또는 유전자 사일런싱과 같은 상응하는 방법에 의해 효소의 후번역 변형에 관여하는 키나제 또는 포스파타제와 같은 효소의 활성을 조절함으로써 일어날 수 있다.

또 다른 실시 형태에서, 효소는 효율, 또는 화합물 제조의 피드백 억제를 예방할 수 있도록 녹아웃된 효소의 알로스테릭 제어 영역이 개선될 수 있다. 유사하게, 분해 효소는 결실되거나, 그의 분해 활성이 세포의 생존률을 손상시키지 않고 표 1의 목적하는 효소에 대해 감소되도록 치환, 결실 또는 첨가에 의해 변형될 수 있다. 각각의 경우, 목적하는 이들 정밀 화학물질 중 하나의 전체 수율 또는 제조율을 증가시킬 수 있다.

표 1의 단백질 및 뉴클레오티드 분자에서의 이러한 변경은 시스테인 또는 글루타티온 같은 다른 황 함유 화합물, 다른 아미노산, 비타민, 보조인자, 건강 기능 식품, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 및 트레할로스와 같은 메티오닌 이외의 정밀 화학 제품의 제조를 개선시킬 수 있다. 임의의 한 화합물의 대사는 세포 내에서 다른 생합성 및 분해 경로와 얽히기 마련이고, 한 경로에서 필요한 보조인자, 중간체 또는 기질은 이러한 다른 경로에 의해 공급 또는 제한될 것이다. 따라서, 표 1의 1종 이상의 단백질의 활성, 다른 정밀 화학 제품의 제조 또는 활성 효율을 조정함으로써, 메티오닌을 생성하는 것 이외의 생합성 또는 분해 경로에 영향을 줄 수 있다.

효소의 발현 및 기능은 여러 대사 공정으로부터 세포 수준의 화합물에 근거하여 조절할 수도 있고, 기본적 성장에 필요한 세포 수준의 분자, 예컨대 아미노산 및 뉴클레오티드는 대규모 배양에서 미생물의 생존률에 결정적으로 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 더 이상 피드백 억제에 응답하지 않도록 또는 효율이나 전환을 개선시키도록 표 1의 아미노산 생합성 효소를 조정하는 것은 메티오닌 제조 경로를 통한 대사 흐름을 늘린다.

표 1의 효소의 양 및/또는 활성의 증가 또는 도입을 위한 상술한 이들 전략은 제한하려는 의도는 아니며, 이들 전략의 변형은 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.

표 1의 임의의 효소의 양 또는 함량 및/또는 활성의 감소 또는 저해 또는 저감을 위해, 여러 전략을 또한 사용할 수 있다.

표 1의 내인성 효소의 발현은 예를 들어 유전자의 프로모터 서열에 특이적으로 결합된 앱타머(aptamer)의 발현을 통해 조절할 수 있다. 자극 또는 억제 프로모터 영역에 대한 앱타머 결합에 따라서, 양 및 따라서 이 경우 표 1의 효소의 활성은 증가하거나 감소한다.

앱타머는 또한 효소 자체에 특이적으로 결합되고, 예를 들어 각각의 효소의 촉매 중심에 결합함으로써 효소의 활성을 감소시키기 위한 방식으로 디자인될 수 있다. 앱타머의 발현은 통상 벡터-기반 과다발현(상기 참조), 또한 당업자에게 널리 알려진 앱타머의 디자인 및 선택에 의해 달성된다 (문헌 [Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol., 243, 123-36]).

또한, 표 1의 내인성 효소의 양 및 활성의 감소는 당업자에게 널리 알려진 각종 실험적 측정에 의해 달성될 수 있다. 이들 측정은 통상 용어 "유전자 사일런싱" 또는 "유전자 감쇠" 또는 "유전자 분열" 또는 "유전자 제거" 항목 하에 요약되어 있다. 예를 들어, 내인성 유전자의 발현은 효소 또는 그의 일부를 안티센스 순서로 코딩하는 DNA 서열을 갖는 상술한 벡터를 씨. 글루타미쿰 및 이. 콜라이와 같은 유기체로 전이함으로써 사일런싱할 수 있다. 이는 이러한 벡터의 세포 내 전사가 RNA를 유도하고, 이는 내인성 유전자에 의해 전사된 mRNA와 혼성화하여 그의 번역을 예방할 수 있다는 사실에 기초한 것이다.

안티센스 배향으로 클로닝된 핵산에 작용적으로 연결된 조절 서열은 다양한 세포형, 예를 들어 바이러스 프로모터 및/또는 인핸서에서 안티센스 RNA 분자의 연속 발현을 유도하도록 선택될 수 있거나, 또는 조절 서열은 안티센스 RNA의 구성적, 조직 특이적 또는 세포형 특이적 발현을 유도하도록 선택될 수 있다. 안티센스 발현 벡터는 안티센스 핵산이 고효율 조절 영역의 제어하에 제조되는 재조합 플라스미드, 파지미드(phagemid) 또는 감쇠된 바이러스의 형태일 수 있고, 그의 활성은 벡터가 도입되는 세포형에 의해 측정될 수 있다. 안티센스 유전자를 사용하는 유전자 발현의 조절에 대한 고찰은 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol.1 (1), 1986]을 참조한다.

원칙상, 안티센스 전략은 리보자임 방법과 커플링할 수 있다. 리보자임은 안티센스 서열에 커플링되면, 타겟 서열을 촉매적으로 분열하는 촉매 활성 RNA 서열이다 (문헌 [Tanner et al., (1999) FEMS Microbiol Rev. 23 (3), 257-75]). 이는 안티센스 전략의 효율을 향상시킬 수 있다.

식물에서, 유전자 사일런싱은 동시저해로도 알려진 RNA 간섭 또는 공정에 의해 달성될 수 있다.

추가의 방법은 RNA/DNA 올리고뉴클레오티드를 유기체로 도입하거나 (문헌 [Zhu et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18 (5), 555-558]) 또는 상동성 재조합의 도움으로 녹아웃 돌연변이체를 생성함 (문헌 [Hohn et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 8321-8323])으로써 무의미 돌연변이를 내인성 유전자 내로 도입하는 것이다.

상동성 재조합 미생물을 생성하기 위해, 결실, 첨가 또는 치환이 도입되어 내인성 유전자를 변경, 예를 들어 기능적으로 분열하는 표 1의 효소를 코딩하는 유전자의 적어도 일부를 함유하는 벡터를 제조한다.

바람직하게는, 이 내인성 유전자는 씨. 글루타미쿰 또는 이. 콜라이 유전자이지만, 관련 박테리움 또는 심지어 이스트 또는 식물 공급원으로부터의 상동체일 수 있다. 한 실시 형태에서, 벡터는 상동성 재조합상 내인성 유전자를 기능적으로 분열하여, 즉 "녹아웃" 벡터라고도 불리는 기능성 단백질을 더 이상 코딩하지 않도록 디자인된다. 별법으로, 벡터는 상동성 재조합상 내인성 유전자가 돌연변이화되거나 그렇지 않으면 변경되지만 여전히 기능성 단백질을 코딩하도록 디자인된다 (예를 들어, 상류 조절 영역은 변경되어 표 1의 내인성 효소의 발현을 변경할 수 있다). 상동성 재조합 벡터에서, 내인성 유전자의 변경 부분은 벡터가 갖는 외인성 유전자와 유기체(또는 미생물)에서 내인성 유전자 사이에서 상동성 재조합을 발생시키기 위해 내인성 유전자의 추가 핵산에 의해 그의 5' 및 3' 말단에서 플랭킹한다. 내인성 핵산의 추가 플랭킹은 내인성 유전자와 함께 성공적인 상동성 재조합을 위해 충분한 길이이다. 통상적으로, 수백 베이스에서 킬로베이스의 플랭킹 DNA(모두 5' 및 3' 말단에서)는 벡터 내에 포함된다 (예를 들어, 상동성 재조합 벡터의 기술에 관한 문헌 [Thomas, K. R., and Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503 and Schaefer et al. Gene. 1994 145:69-73] 참조).

벡터는 (예를 들어 전기 천공에 의해) 미생물 내에 도입되고, 도입된 내인성 유전자가 표 1의 내인성 효소와 상동성으로 재조합된 세포는 공지된 기술을 사용하여 선택된다.

또 다른 실시 형태에서, 숙주 세포 내 표 1의 효소의 내인성 유전자는 그의 단백질 생성물의 발현이 일어나지 않도록 (예를 들어 상동성 재조합 또는 당업계에 공지된 다른 유전학적 수단에 의해) 분열된다. 또 다른 실시 형태에서, 숙주 세포 내 표 1의 효소의 내인성 또는 도입된 유전자는 1종 이상의 포인트 돌연변이, 결실형 돌연변이 또는 역위 돌연변이에 의해 변경되었지만, 여전히 기능성 효소를 코딩한다. 또 다른 실시 형태에서, 유기체(또는 미생물) 내 표 1의 효소에 대한 내인성 유전자의 하나 이상의 조절 영역(예를 들어, 프로모터, 리프레서 또는 인듀서)은 내인성 유전자의 발현이 조절되도록 (예를 들어, 결실형 돌연변이, 절단형 돌연변이, 역위 돌연변이 또는 포인트 돌연변이에 의해) 변경되었다. 당업자는, 표 1의 효소 및 단백질 변형물을 코딩하는 1종을 초과하는 유전자를 함유하는 숙주 세포는 본 발명의 방법을 사용하여 손쉽게 제조할 수 있으며, 본 발명의 범위 내에 포함됨을 의미한다는 것을 이해할 것이다.

또한, 유전자 억압(및 유전자 과다발현)은 특이적 DNA-결합 인자, 예를 들어 징크 핑거 전사 인자형의 인자에 의해서도 가능하다. 또한, 타겟 단백질 자체를 억제하는 인자를 세포 내에 도입할 수 있다. 단백질-결합 인자는 예를 들어 상술한 앱타머일 수 있다 (문헌 [Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol. 243, 123-36]).

유기체에서 그의 발현이 표 1의 효소의 양 및/또는 활성을 감소시키는 추가의 단백질-결합 인자는 효소-특이적 항체로부터 선택된다. 단클론, 다클론 또는 재조합 효소-특이적 항체의 제조는 표준 프로토콜에 따른다 (문헌 [Guide to Protein Purification, Meth. Enzymol. 182, pp. 663-679 (1990), M. P. Deutscher, ed.]). 항체의 발현 역시 문헌에 공지되어 있다 (문헌 [Fiedler et al., (1997) Immunotechnology 3, 205-216], 문헌 [Maynard and Georgiou (2000) Annu. Rev. Biomed. Eng. 2, 339-76]).

언급된 기술들은 당업자에게 널리 알려져 있다. 따라서, 예를 들어 안티센스 방법에 사용된 핵산 구성물은 어떤 크기를 가져야 하는지, 어떠한 상보성, 상동성 또는 동일성, 각각의 핵산 서열을 가져야 하는지 역시 널리 알려져 있다. 용어 상보성, 상동성 및 동일성은 당업자에게 알려져 있다.

본 발명의 범위 내에서, 서열 상동성 및 상동성은 각각 일반적으로 DNA 분자 또는 단백질 각각의 핵산 서열 또는 아미노산 서열 각각이 공지된 DNA 또는 RNA 분자 또는 단백질 각각의 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 40％ 이상, 바람직하게는 50％ 이상, 보다 바람직하게는 60％ 이상, 더욱 바람직하게는 70％ 이상, 특히 바람직하게는 90％ 이상, 더욱 특히 바람직하게는 95％ 이상, 가장 바람직하게는 98％ 이상 동일함을 의미하는 것으로 이해된다. 본원에서, 상동성 및 동일성의 정도는 각각 코딩 서열의 전체 길이를 가리킨다.

용어 "상보성"이란 2개의 상보적 염기 사이의 수소 결합으로 인해 한 핵산 분자가 다른 핵산 분자와 혼성화할 수 있는 능력을 의미한다. 당업자는 서로 혼성화할 수 있기 위해서는 두 핵산 분자가 100％의 상보성을 가져서는 안된다는 것을 알고 있다. 다른 핵산 서열과 혼성화되는 핵산 서열은 상기 다른 핵산 서열과 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 바람직하게는 70％ 이상, 특히 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 특히 바람직하게는 90％ 이상, 특히 바람직하게는 95％ 이상, 가장 바람직하게는 98％ 이상 또는 100％ 상보적인 것이 바람직하다.

동일한 5'-3'-순서로 동일한 뉴클레오티드를 갖는다면 핵산 분자는 동일하다.

안티센스 서열과 내인성 mRNA 서열의 혼성화는 통상 세포 조건하 생체내 또는 시험관내에서 일어난다. 본 발명에 따르면, 혼성화는 특이적 혼성화를 확보하기에 충분히 엄격한 조건하에 생체내 또는 시험관내에서 수행된다.

엄격한 시험관내 혼성화 조건은 당업자에게 알려져 있고, 문헌으로부터 알 수 있다 (예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press] 참조). 용어 "특이적 혼성화"는 핵산 서열이 예를 들어 DNA 또는 RNA 분자의 복합 혼합물의 일부인 경우, 분자가 엄격한 조건하에서 상기 특정한 핵산 서열에 우선적으로 결합하는 경우를 말한다.

따라서 용어 "엄격한 조건"은 핵산 서열이 타겟 서열에 우선적으로 결합하지만, 다른 서열에는 결합하지 않거나 또는 상당히 감소된 정도로 최소한으로 결합하는 조건을 말한다.

엄격한 조건은 환경에 좌우된다. 특이적으로 혼성화되는 서열은 고온일수록 길어진다. 일반적으로, 엄격한 조건은 혼성화 온도가 소정의 이온 강도 및 소정의 pH값을 갖는 특이적 서열의 융점(Tm)보다 약 5 ℃ 아래에 있도록 선택된다. Tm은 타겟 서열과 상보적인 분자의 50％가 상기 타겟 서열과 혼성화되는 온도(소정의 pH값, 소정의 이온 강도 및 소정의 핵산 농도로)이다. 통상적으로, 엄격한 조건은 0.01 M 내지 1.0 M의 나트륨 이온(또는 다른 염의 이온)인 염 농도 및 7.0 내지 8.3의 pH값을 포함한다. 온도는 짧은 분자(예를 들어 이러한 분자는 10 내지 50개의 뉴클레오티드를 포함함)의 경우 30 ℃ 이상이다. 또한, 엄격한 조건은 예를 들어 포름아미드와 같은 불안정화제의 첨가를 포함할 수 있다. 통상적인 혼성화 및 세척 완충액은 하기 조성을 갖는다.

예비-혼성화 용액:

0.5％ SDS

5x SSC

5O mM NaPO₄, pH 6.8

0.1％ Na-파이로포스페이트

5x 덴하르트(Denhardt) 시약

100 μg 연어 정자

혼성화 용액: 예비-혼성화 용액

1x10⁶ cpm/mL 프로브(5 내지 10분, 95 ℃)

2Ox SSC: 3 M NaCl

0.3 M 나트륨 시트레이트

ad pH 7의 HCl

50x 덴하르트 시약:5 g 피콜(Ficoll)

5 g 폴리비닐피롤리돈

5 g 소혈청 알부민

ad 500 mL A. dest.

혼성화를 위한 통상적인 절차는 하기와 같다.

임의 단계: 65 ℃에서 1x SSC/0.1％ SDS 중 30분 동안 블롯(Blot)을 세척함

예비-혼성화: 50 내지 55 ℃에서 2시간 이상

혼성화: 55 내지 60 ℃에서 밤새

세척: 5분 2x SSC/0.1％ SDS

혼성화 온도

30분 2x SSC/0.1％ SDS

혼성화 온도

30분 1x SSC/0.1％ SDS

혼성화 온도

45분 0.2x SSC/0.1％ SDS 65 ℃

분 0.1x SSC 실온

용어 "센스" 및 "안티센스"뿐만 아니라 "안티센스 배향"은 당업자에게 알려져 있다. 또한, 당업자는 안티센스 방법에 사용되는 핵산 분자가 얼마나 길어야 하는지, 그들의 타겟 서열과 관련하여 얼마나 상동성 또는 상보성을 가져야 하는지 알고 있다.

따라서, 당업자는 유전자 사일런싱 방법에 사용되는 핵산 분자가 얼마나 길어야 하는지 알고 있다. 안티센스 목적의 경우, 100개의 뉴클레오티드, 80개의 뉴클레오티드, 60개의 뉴클레오티드, 40개의 뉴클레오티드 및 20개의 뉴클레오티드의 서열 길이에 걸친 상보성은 충분할 수 있다. 또한 뉴클레오티드 길이가 길어도 확실히 충분할 것이다. 상술한 방법의 복합 적용도 생각할 수 있다.

본 발명에 따르면, 유기체 내 활성 프로모터에 5'-3'-배향으로 작용적으로 연결된 DNA 서열이 사용되는 경우, 벡터는 일반적으로 유기체의 세포에 전이된 후에 코딩 서열의 과다발현을 허용하거나 내인성 핵산 서열 및 그로부터 발현된 단백질 각각의 저해 또는 경쟁 및 차단을 유발하도록 구성된다.

또한 특정 효소의 활성은 유기체에서 그의 비기능성 돌연변이체를 과다발현함으로써 감소시킬 수도 있다. 따라서, 당해 반응을 촉매할 수 없지만 예를 들어 기질 또는 보조인자를 결합할 수 있는 비기능성 돌연변이체는 과다발현에 의해 내인성 효소와 경쟁하고 이에 따라 반응을 억제할 수 있다. 숙주 세포 내 효소의 양 및/또는 활성을 감소하기 위한 추가 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 표 1의 효소(또는 그의 일부)를 코딩하는 핵산 또는 그의 조합을 함유하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터에 관한 것이다. 본원에 사용되는 용어 "벡터"는 연결되는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터의 한 유형은 추가의 DNA 절편이 결찰될 수 있는 환상 이중 가닥 DNA 루프를 가리키는 "플라스미드"이다. 벡터의 다른 유형은 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다.

특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포 내에 자동 복제될 수 있다 (예를 들어, 박테리아 기원의 복제를 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물의 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물의 벡터)는 숙주 세포 내로 도입된 후 숙주 세포의 게놈으로 통합되고, 이에 따라 숙주 게놈을 따라 복제된다. 또한, 특정한 벡터는 이들이 작용적으로 연결되는 유전자의 발현을 유도할 수 있다.

이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"라 한다.

일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 플라스미드가 가장 자주 사용되는 형태의 벡터이므로 본원에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 호환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동일한 기능을 제공하는 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결손 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연합 바이러스)를 포함하도록 의도된다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 각각의 핵산의 발현에 적당한 형태로 표 1의 효소를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있고, 이는 재조합 발현 벡터가 발현되는 핵산 서열에 작용적으로 연결되며, 발현을 위해 사용되는 숙주 세포에 근거하여 선택되는 하나 이상의 조절 서열을 포함함을 의미한다.

재조합 발현 벡터에 있어서, "작용적으로 연결된"이란 관심있는 뉴클레오티드 서열이 조절 서열에 연결되어 뉴클레오티드 서열이 (예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템에서, 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입되는 경우 숙주 세포에서) 발현되도록 함을 의미하는 것으로 의도된다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 리프레서 결합 부위, 활성제 결합 부위, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소(예를 들어, 종결자, 폴리아데닐화 시그널, 또는 mRNA 이차 구조의 다른 요소)를 포함하도록 의도된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재되어 있다. 조절 서열은 다수 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 유도하는 것 및 오직 특정한 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도하는 것을 포함한다. 바람직한 조절 서열은, 예를 들어 바람직하게는 박테리아에서 사용되는 cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, arny, SP02, e-Pp-ore PL, sod, ef-tu, groE와 같은 프로모터이다. 추가의 조절 서열은 예를 들어 이스트 및 진균으로부터의 프로모터, 예컨대 ADCl, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, 식물로부터의 프로모터, 예컨대 CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos 또는 유비퀴틴- 또는 파세올린-프로모터이다. 또한, 인공 프로모터를 사용할 수도 있다. 당업자라면 발현 벡터의 디자인은 형질전환되는 숙주 세포, 목적하는 단백질의 발현 수준 등의 선택과 같은 인자에 좌우될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어, 표 1의 효소를 코딩하는 핵산에 의해 코딩되는 융합 단백질 또는 펩티드를 비롯한 단백질 또는 펩티드를 제조할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포에서 표 1의 효소의 발현을 위해 디자인될 수 있다. 예를 들어, 표 1의 효소를 위한 유전자는 씨. 글루타미쿰, 비. 섭틸리스 및 이. 콜라이와 같은 박테리아 세포, 곤충 세포(바쿨로바이러스 발현 벡터를 사용함), 이스트 및 다른 진균 세포(문헌 [Romanos, M. A. et al. (1992), Yeast 8: 423-488], 문헌 [van den Hondel, C. A. MJ.J. et al.(1991) in: More Gene Manipulations in Fungi, J. W. Bennet & L. L. Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego; and van den Hondel, C. A. M. J.J. & Punt, P. J.(1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F. et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge] 참조), 조류 및 다세포 식물 세포(문헌 [Schmidt, R. and Willmitzer, L. (1988) Plant Cell Rep.: 583-586] 참조)에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 문헌 [Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에서 더 논의된다. 별법으로, 재조합 발현 벡터는 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 사용하여 시험관내에서 전사 및 번역될 수 있다.

원핵세포 내 단백질의 발현은 융합 또는 비융합 단백질의 발현을 유도하는 구성적 또는 유발가능 프로모터를 함유하는 벡터와 함께 행해지는 것이 제일 흔하다.

융합 벡터는 그 안에서 코딩된 단백질, 대개 재조합 단백질의 아미노 말단부뿐만 아니라 C-말단부에 대해 다수의 아미노산을 첨가하거나, 단백질 내 적합한 영역에서 융합된다. 이러한 융합 벡터는 통상 3가지 목적, 즉 1) 재조합 단백질의 발현을 증가시키고, 2) 재조합 단백질의 용해성을 증가시키고, 3) 친화성 정제에서 리간드로서 작용함으로써 재조합 단백질의 정제에 도움을 준다는 목적을 만족시킨다. 종종, 융합 발현 벡터에서, 단백질분해 분할 부위는 융합 잔기와 재조합 단백질의 이음부에 도입되어 융합 잔기로부터 융합 단백질의 정제가 후속되는 재조합 단백질을 분리시킬 수 있다. 이러한 효소 및 그의 동족 인식 서열은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제를 포함한다.

통상적인 융합 발현 벡터로는 각각 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 E 결합 단백질 또는 단백질 A를 융합하는 pQE(키아젠(Qiagen)), pGEX(파마시아 바이오테크 인크(Pharmacia Biotech Inc); 문헌 [Smith, D. B. and Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31-40]), pMAL(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs; 미국 매사추세츠주 비벌리 소재)) 및 pRIT5(파마시아(Pharmacia; 미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재))를 들 수 있다.

씨. 글루타미쿰 벡터에 대한 예는 문헌 [Handbook of Corynebacterium 2005Eggeling, L. Bott, M., eds., CRC press USA]에서 찾아 볼 수 있다.

적합한 유발가능 비융합 이. 콜라이 발현 벡터의 예로는 pTrc(문헌 [Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315]), pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, egtll, pBdC1 및 pETlld(문헌 [Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89] 및 문헌 [Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018])를 들 수 있다. pTrc 벡터로부터 타겟 유전자의 발현은 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터의 숙주 RNA 중합효소 전사에 좌우된다. pETlld 벡터로부터의 타겟 유전자의 발현은 동시발현된 바이러스 RNA 중합효소(T7gnl)에 의해 매개된 T7gnlO-lac 융합 프로모터로부터의 전사에 좌우된다. 이 바이러스 중합효소는 lacUV 5 프로모터의 전사 제어 하에 T7gnl 유전자를 갖는 레지던트X 프로파지로부터 숙주 균주 BL21(DE3) 또는 HMS(DE3)에 의해 제공된다. 다른 각종 박테리아의 형질전환의 경우, 적당한 벡터가 선택된다. 예를 들어, 플라스미드 pIJ101, pIJ364, pIJ702 및 pIJ361은 스트렙토마이세스를 형질전환하는데 유용하지만, 플라스미드 pUB110, pC194 또는 pBD214는 바실루스종의 형질전환에 적합하다고 알려져 있다. 코리네박테리움 내로 유전학 정보를 전사하는데 사용하는 몇몇 플라스미드로는 pHM1519, pBL1, pSA77 또는 pAJ667(문헌 [Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018])을 들 수 있다.

재조합 단백질의 발현을 최대화하기 위한 한 전략은 재조합 단백질을 단백질분해적으로 분할하는 능력을 줄이면서 숙주 박테리아에서 단백질을 발현시키는 것이다 (문헌 [Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128]). 다른 전략은 발현 벡터 내로 삽입되는 핵산의 핵산 서열을 변경하여 각 아미노산에 대한 개별 코돈이 박ㄹ현을 위해 선택되는 박테리움, 예컨대 씨. 글루타미쿰에 우선적으로 이용되도록 하는 것이다 (문헌 [Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118]). 본 발명의 핵산 서열의 이러한 변경은 표준 DNA 합성 기술에 의해 행할 수 있다.

또 다른 실시 형태에서, 단백질 발현 벡터는 이스트 발현 벡터이다. 이스트 내 발현을 위한 벡터의 예인 S. 세레비시에로는 pYepSecl(문헌 [Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234]), 2i, pAG-1, Yep6, Yepl3, pEMBLYe23, pMFa(문헌 [Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943]), pJRY88(문헌 [Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123]) 및 pYES2(인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation; 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재))를 들 수 있다. 사상 진균과 같은 다른 진균에 사용하기 적절한 벡터 및 벡터의 구성 방법은 문헌 [van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge] 및 문헌 [Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York (IBSN 0 444 904018)]에 자세히 기재되어 있는 것을 들 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 작용적 연결은 프로모터, 코딩 서열, 종결자, 및 임의로 추가의 조절 요소의 순차적 배열로서, 각 조절 요소가 코딩 서열의 발현시 그의 측정에 따라 그 기능을 수행할 수 있는 방식으로 배열된 것으로 이해된다.

또 다른 실시 형태에서, 표 1의 단백질은 단세포 식물 세포(조류 등) 또는 보다 고차원 식물(예를 들어, 작물과 같은 종자 식물)로부터의 식물 세포에서 발현될 수 있다. 식물 발현 벡터의 예로는 문헌 [Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197] 및 문헌 [Bevan, M. W. (1984) Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721]에 자세히 기재되어 있는 것을 들 수 있고, pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 및 pDH51(문헌 [Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018])을 들 수 있다.

원핵세포 및 진핵세포 모두에 적합한 다른 발현 시스템에 대해서는 문헌 [chapters 16 and 17 of Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003]을 참조한다.

본 발명의 목적을 위하여, 작용적 연결은 프로모터, 코딩 서열, 종결자, 및 임의로 추가의 조절 요소의 순차 배열로서, 각 조절 요소가 코딩 서열의 발현시 그의 측정에 따라 그 기능을 수행할 수 있도록 배열되는 것으로 이해된다.

또 다른 실시 형태에서, 재조합 포유동물의 발현 벡터는 특정 세포형, 예를 들어 식물 세포에 우선적으로 핵산의 발현을 유도할 수 있다 (예를 들어, 조직-특이적 조절 요소를 사용하여 핵산을 발현시킨다). 조직-특이적 조절 요소는 당업계에 알려져 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입되는 유기체 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본원에서 호환적으로 사용된다. 이러한 용어들은 특정한 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손도 가리킨다. 어떤 변형은 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후대에서 일어날 수도 있기 때문에, 이러한 자손은 부모 세포와 사실상 동일하지 않을 수 있지만, 본원에 사용되는 용어의 범위 내에 포함된다.

숙주 세포는 임의의 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 예를 들어, 표 1의 효소는 씨. 글루타미쿰 또는 이. 콜라이와 같은 박테리아 세포, 곤충 세포, 이스트 또는 식물에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 알려져 있다.

벡터 DNA는 종래의 형질전환 또는 형질감염 기술에 의해 원핵세포 또는 진핵세포 내로 도입될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "형질전환" 및 "형질감염", "접합" 및 "형질도입"은 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공침, DEAE-덱스트란-매개된 형질감염, 리포펙션(lipofection), 천연 적격성, 화학물질-매개된 전이 또는 전기 천공을 비롯한, 외래 핵산(예를 들어, 선형 DNA 또는 RNA, 예를 들어 선형화된 벡터 또는 벡터가 없는 유전자 구조물 단독) 또는 벡터 형태의 핵산(예를 들어, 플라스미드, 파지, 파스미드, 파지미드, 트랜스포존 또는 다른 DNA)을 숙주 세포에 도입하기 위한 당업계에 인식된 각종 기술을 가리키는 것으로 의도된다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염하는데 적합한 방법은 문헌 [Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003)]에서 찾을 수 있다. 씨. 글루타미쿰 벡터의 예는 문헌 [Handbook of Corynebacterium(Eggeling, L. Bott, M., eds., CRC press USA 2005)] 및 다른 실험실 편람에서 찾을 수 있다.

본원에서 사용되는 "캠벨 인(Campbell in)"은 전체 환상 이중 가닥 DNA 분자(예를 들어, 플라스미드)가 단일 상동성 재조합 사건(크로스 인(cross in) 사건)에 의해 염색체 내로 통합되고, 상기 환상 DNA 분자의 선형화된 버전을 상기 환상 DNA 분자의 제1 DNA 서열에 상동성인 염색체의 제1 DNA 서열 내로 효과적으로 삽입시키는 원래의 숙주 세포의 형질전환체를 의미한다. 이 명칭은 상기 종류의 재조합을 처음 제안한 알랜 캠벨(Alan Campbell) 교수의 이름에서 유래한 것이다. "캠벨드 인(Campbelled in)"은 "캠벨 인" 형질전환체의 염색체 내로 통합된 선형화된 DNA 서열을 의미한다. "캠벨 인"은 제1 상동성 DNA 서열의 복제물을 함유하고, 그의 각각의 카피는 상동성 재조합 교차 지점의 카피를 포함하고, 상기 카피를 둘러싼다.

본원에서 사용되는 "캠벨 아웃(Campbell out)"은 "캠벨 인" 형질전환체의 자손 세포로서, 여기서 제2 상동성 재조합 사건 (크로스 아웃(cross out) 사건)이 "캠벨드 인" DNA의 선형화된 삽입된 DNA 상에 함유된 제2 DNA 서열과, 상기 선형화된 삽입체의 제2 DNA 서열에 상동성인 염색체 기원의 제2 DNA 서열 사이에 발생하고, 제2 재조합 사건은 통합된 DNA 서열의 일부를 결실(제거)시키지만, 중요하게는, 원래의 숙주 세포에 비해, "캠벨 아웃" 세포가 염색체에 하나 이상의 의도적인 변화(예를 들어, 이종 유전자 또는 DNA 서열의 단일 염기 치환, 다중 염기 치환, 삽입, 상동성 유전자 또는 변경된 상동성 유전자의 추가의 카피 또는 카피들의 삽입, 또는 상기 나열한 예를 둘 이상을 포함하는 DNA 서열의 삽입)를 함유하도록, 통합된 "캠벨드 인" DNA의 일부(이것은 단일 염기만큼 작을 수 있다)를 염색체에 잔류시킨다.

"캠벨 아웃" 세포 또는 균주는 꼭 그렇지는 않지만, 대체로 "캠벨드 인" DNA 서열의 일부(제거가 요구되는 부분)에 함유된 유전자, 예를 들어 약 5％ 내지 10％ 수크로스의 존재하에 성장한 세포에서 발현될 때 치사되는 바실러스 섭틸리스 sacB 유전자에 대한 카운터-선별에 의해 얻는다. 카운터-선별과 함께 또는 카운터-선별을 수행하지 않으면서, 요구되는 "캠벨 아웃" 세포는 콜로니 형태, 콜로니 색상, 항생제 내성의 존재 또는 부재, 중합효소 연쇄 반응에 의한 제시된 DNA 서열의 존재 또는 부재, 영양요구성의 존재 또는 부재, 효소의 존재 또는 부재, 콜로니 핵산 혼성화, 항체 스크리닝 등과 같은 임의의 스크리닝가능한 표현형(이로 제한되지 않음)을 사용하여 목적하는 세포에 대해 스크리닝함으로써 얻거나 확인될 수 있다.

또한, 용어 "캠벨 인" 및 "캠벨 아웃"은 상술한 방법 또는 공정을 언급하기 위해 다양한 시제에서 동사로서 사용될 수도 있다.

"캠벨 인" 또는 "캠벨 아웃"을 야기하는 상동성 재조합 사건이 상동성의 DNA 서열 내의 일정 범위의 DNA 염기에 걸쳐 발생할 수 있음이 이해되고, 상동성 서열은 상기 범위의 적어도 일부에 대해 서로 동일하기 때문에, 교차 사건이 발생한 정확한 위치를 특정하는 것이 대체로 불가능하다. 즉, 본래 어느 서열이 삽입된 DNA로부터 유도된 것인지 및 본래 어느 서열이 염색체 DNA로부터 유도된 것인지를 정확하게 특정하는 것은 불가능하다. 또한, 제1 상동성 DNA 서열 및 제2 상동성 DNA 서열은 대체로 부분적인 비-상동성 영역에 의해 분리되고, "캠벨 아웃" 세포의 염색체에 침적된 상태로 유지되는 것은 상기 비-상동성 영역이다.

실용성을 위해, 씨. 글루타미쿰에서, 통상적인 제1 및 제2 상동성 DNA 서열은 약 200개 이상의 염기쌍의 길이일 수 있고, 수천개 염기쌍 이하의 길이일 수 있다. 그러나, 상기 과정은 보다 짧거나 더 긴 서열을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 상동성 서열의 길이는 약 500 내지 2000개의 염기일 수 있고, "캠벨 인"으로부터 "캠벨 아웃"을 얻는 것은 제1 및 제2 상동성 서열을 대략 동일한 길이로. 바람직하게는 200개 미만의 염기쌍의 차이로, 가장 바람직하게는 두 서열 중 짧은 서열의 길이가 더 긴 서열의 염기쌍의 70％ 이상의 길이가 되도록 정렬시켜 용이하게 수행된다.

이들 구성 요소를 확인하고 선택하기 위해, (예를 들어, 항생제에 대한 내성이 있는) 선택가능한 마커를 코딩하는 유전자는 일반적으로 관심있는 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입된다. 바람직한 선택가능한 마커로는 약물, 예컨대 카나마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 것을 들 수 있다. 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산은 표 1의 효소를 코딩하는 것과 동일한 벡터 상에서 숙주 세포 내로 도입될 수 있거나, 또는 별개의 벡터 상에 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정적으로 형질감염된 세포는 약물 선택에 의해 확인할 수 있다 (예를 들어 선택가능한 마커 유전자가 혼입된 세포는 살아남지만 다른 세포는 죽는다).

또 다른 실시 형태에서, 선택되고/되거나 도입된 유전자의 발현을 향상시키는 계를 함유하는 재조합 미생물을 제조할 수 있다. 씨. 글루타미쿰과 같은 고GC 유기체에서 유전자의 발현을 변경 및 향상시키는 것에 대한 예는 WO 2005/059144호, WO 2005/059143호 및 WO 2005/059093호에 기재되어 있다.

또 다른 실시 형태에서, 도입된 유전자의 발현을 조절하는 선택된 계를 함유하는 재조합 미생물을 제조할 수 있다. 예를 들어, lac 오페론의 제어하에 벡터상에 표 1의 유전자를 포함시키는 것은 오직 IPTG의 존재하에 유전자의 발현을 허용한다. 이러한 조절 시스템 역시 당업계에 널리 알려져 있다.

한 실시 형태에서, 방법은 메티오닌 제조에 적합한 배지에서 본 발명의 유기체(예를 들어 표 1의 효소를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 도입되거나, 게놈이 야생형 또는 변경된 효소를 코딩하는 유전자에 도입됨)를 배양하는 것을 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 방법은 배지 또는 숙주 세포로부터 메티오닌을 단리하는 것을 더 포함한다.

메티오닌 합성에 더 효과적인 유기체를 제조하기 위해 유기체의 대사 흐름을 변형하기 위해, 효소의 양 및/또는 활성을 바꾸는 것은 표 1에 열거된 효소로만 제한되는 것은 아니다. 표 1의 효소와 상동성이며 다른 유기체에서 동일한 작용을 하는 임의의 효소는 과다발현에 의해 대사 흐름에 영향을 주기 위해 양 및/또는 활성을 조정하는 데 아주 적절할 수 있다. 상동성 및 동일성의 정의는 위에 기재되었다.

당업자는 씨. 글루타미쿰 및 이. 콜라이와 같이 통상적인 미생물의 배양에 익숙하다. 따라서, 씨. 글루타미쿰의 배양에 관해 일반적인 교시가 후술될 것이다. 상응하는 정보는 이. 콜라이의 배양에 대한 표준 교재로부터 찾을 수 있다.

이. 콜라이 균주는 보통 각각 MB 및 LB 브로쓰에서 성장시킨다 (문헌 [Follettie, M. T., Peoples, O., Agoropoulou, C., and Sinskey, A. J. (1993) J. Bacteriol. 175, 4096-4103]). 이. 콜라이용 최소 배지는 각각 M9 및 변형된 MCGC이다 (문헌 [Yoshihama, M., Higashiro, K., Rao, E. A., Akedo, M., Shanabruch, W G., Follettie, M. T., Walker, G. C., and Sinskey, A. J. (1985) J. Bacteriol. 162, 591-507]). 글루코스는 최종 농도 1％로 첨가될 수 있다. 항생제는 다음의 양(밀리리터당 마이크로그램): 암피실린 50; 카나마이신 25; 낼리딕산 25로 첨가될 수 있다. 아미노산, 비타민 및 다른 영양보충제는 다음의 양: 메티오닌 9.3 mM; 아르기닌 9.3 mM; 히스티딘 9.3 mM; 티아민 0.05 mM로 첨가될 수 있다. 이. 콜라이 세포는 통상 각각 37 ℃에서 성장한다.

유전학적으로 변형된 코리네박테리아는 통상 합성 또는 자연 성장 배지에서 배양된다. 코리네박테리아를 위한 다수의 상이한 성장 배지는 잘 알려져 있고 쉽게 구입할 수 있다 (문헌 [Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol., 32: 205-210]. 문헌 [von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters, 11: 11-16], 특허 DE 4,120,867호, 문헌 [Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium, in: The Procaryotes, Volume II, Balows, A. et al., eds. Springer-Verlag]). 씨. 글루타미쿰 벡터의 예는 문헌 [Handbook of Corynebacterium (Eggeling, L. Bott, M., eds., CRC press USA 2005)]에서 찾을 수 있다.

이들 배지는 1종 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기 염, 비타민 및 미량 요소로 이루어진다. 바람직한 탄소 공급원은 단당류, 다당류 또는 다당류와 같은 당류이다. 예를 들어, 글루코스, 프룩토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 락토스, 말토스, 수크로스, 라피노스, 전분 또는 셀룰로스가 매우 양호한 탄소 공급원으로 기능할 수 있다.

당밀, 또는 당 정제물로부터의 다른 부산물과 같은 복합 화합물에 의해 당을 배지에 공급할 수도 있다. 또한, 다양한 탄소 공급원의 혼합물을 공급하는 것이 유리할 수 있다. 다른 가능한 탄소 공급원은 알코올 및 유기산, 예컨대 메탄올, 에탄올, 아세트산 또는 락트산이다. 질소 공급원은 대개 유기 또는 무기 질소 화합물, 또는 이들 화합물을 함유하는 물질이다. 질소 공급원의 예로는 암모니아 가스 또는 암모니아 염, 예컨대 NH₄Cl 또는 (NH₄)₂SO₄, NH₄OH, 니트레이트, 우레아, 아미노산 또는 옥수수 침지액(corn steep liquor), 대두 가루, 대두 단백질, 이스트 추출물, 고기 추출물 등과 같은 복합 질소 공급원을 들 수 있다.

메티오닌의 과잉 제조는 다양한 황 공급원을 사용하여 수행할 수 있다. 술페이트, 티오술페이트, 술파이트, 및 H₂S 및 술피드와 같이 더 환원된 황 공급원 및 유도체를 사용할 수 있다. 또한 메틸 메르캅탄, 티오글리콜레이트, 티오시아네이트, 티오우레아와 같은 유기 황 공급원, 시스테인과 같은 황 함유 아미노산 및 다른 황 함유 화합물을 사용하여 메티오닌의 효과적 제조를 달성할 수 있다. 포름에이트 및/또는 메탄티올은 포름알데히드, 메탄올 및 디메틸-디술피드와 같은 다른 C1 공급원으로서의 보충제로도 가능하다.

배지에 포함될 수 있는 무기 염 화합물로는 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 클로라이드, 아인산 또는 술페이트 염을 들 수 있다. 킬레이팅 화합물을 배지에 첨가하여 용액 중 금속 이온을 유지시킬 수 있다. 특히 유용한 킬레이팅 화합물로는 카데콜 또는 프로토카테큐에이트와 같은 디히드록시페놀, 또는 시트르산과 같은 유기산을 들 수 있다. 배지에는 또한 다른 성장 인자, 예컨대 비타민 또는 성장 프로모터를 함유하는 것이 통상적이며, 다른 성장 인자의 예로는 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신을 들 수 있다. 성장 인자 및 염은 이스트 추출물, 당밀, 옥수수 침지액 등과 같은 복합 배지 성분으로부터 유래되는 경우가 많다. 배지 화합물의 정확한 조성은 당면 실험에 크게 좌우되며, 각 특이적 경우에 따라 개별적으로 결정된다. 배지 최적화에 대한 정보는 교재 "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach (eds. P. M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)]에서 얻을 수 있다. 스탠다드 1(머크사(Merck)) 또는 BHI(과립 심장 침출물, DIFCO) 등과 같은 상업적 공급업체로부터의 성장 배지를 선택할 수도 있다.

모든 배지 성분은 열(1.5 bar 및 121 ℃에서 20분) 또는 무균 여과에 의해 살균되어야 한다. 성분은 같이 살균하거나, 필요한 경우 따로 살균할 수 있다.

모든 배지 성분은 성장 초기에 존재할 수 있고, 또는 임의로 연속적으로 또는 배치식으로 첨가할 수 있다. 배양 조건은 각 실험에 따라 개별적으로 한정된다.

온도는 15 ℃ 내지 45 ℃의 범위여야 한다. 온도는 일정하게 유지하거나, 또는 실험 도중 변경할 수 있다. 배지의 pH는 5 내지 8.5의 범위, 바람직하게는 약 7.0일 수 있고, 배지에 완충액을 첨가함으로써 유지시킬 수 있다. 이 목적을 위한 완충액의 예로는 칼륨 포스페이트 완충액이 있다. 합성 완충액, 예컨대 MOPS, HEPES, ACES 등은 별개로 또는 동시에 사용할 수 있다. 성장하는 동안 NaOH 또는 NH₄OH를 첨가하여 일정한 배양 pH를 유지시킬 수도 있다. 이스트 추출물과 같은 복합 배지 성분을 이용하는 경우, 다수의 복합 화합물이 높은 완충 용량을 가진다는 사실로 인해, 추가의 완충액에 대한 필요성이 감소할 수 있다. 미생물을 배양하는 데 발효기(fermentor)를 이용하는 경우, pH는 가스 암모니아를 사용하여 제어할 수도 있다.

인큐베이션 시간은 대개 수 시간에서 수일이다. 이 시간은 최대량이 생성물이 브로쓰에 축적되도록 선택된다. 개시된 성장 실험은 각종 용기, 예컨대 다양한 크기의 미량역가 판, 유리 관, 유리 플라스크, 또는 유리 또는 금속 발효기에서 행해질 수 있다. 다수의 클론을 스크리닝하기 위해, 미생물은 배플이 있거나 없는 미량역가 판, 유리 관 또는 진탕 플라스크에서 배양되어야 한다. 바람직하게는 요구되는 성장 배지의 10％(부피％)가 충전된 100 mL의 진탕 플라스크를 사용한다. 플라스크는 100 내지 300 rpm의 속도 범위를 사용하는 회전 진탕기(진폭 25 mm) 상에서 진탕되어야 한다. 증발 손실은 습한 분위기를 유지함으로써 줄일 수 있으며, 별법으로 증발 손실에 대한 수학적 교정이 행해져야 한다.

유전학적으로 변형된 클론을 시험하는 경우, 변형되지 않은 대조 클론, 또는 어떠한 삽입도 없는 염기성 플라스미드를 함유하는 대조 클론도 시험해야 한다. 배지는 30 ℃에서 인큐베이팅된 한천평판, 예컨대 CM 판(10 g/L 글루코스, 2.5 g/L NaCl, 2 g/L 우레아, 10 g/L 폴리펩톤, 5 g/L 이스트 추출물, 5 g/L 고기 추출물, 22 g/L NaCl, 2 g/L 우레아, 10 g/L 폴리펩톤, 5 g/L 이스트 추출물, 5 g/L 고기 추출물, 22 g/L 한천, pH 6.8의 2 M NaOH)에서 성장한 세포를 사용하여 0.5 내지 1.5의 OD600에 접종된다.

배지의 접종은 CM 판으로부터 씨. 글루타미쿰 세포의 식염 현탁액을 도입하거나, 또는 상기 박테리움의 예비배양액을 첨가함으로써 달성된다.

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰, 및 L-메티오닌의 제조와 관련하여 기재되었지만, 본 발명은 또한 다른 미생물, 및 다른 아미노산의 제조에 대해서도 적용할 수 있다고 지적하고자 한다.

또한, "포함한다"는 임의의 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않는 것이며, "하나"는 복수를 배제하지 않는 것으로 지적하고자 한다. 또한, 상기 실시 형태 중 하나와 관련하여 기재된 특성 또는 단계는 상술한 다른 실시 형태의 다른 특성 또는 단계와 조합하여 사용할 수도 있음을 지적하고자 한다.

본 발명은 하기 실시예로 더 예시되며, 이는 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 언급된 모든 참조 문헌, 특허 출원, 특허, 특허 출원 공개, 표, 부록 및 서열의 내용은 본원에 참조로서 포함된다.

박테리아 균주

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032(야생형)는 미국 미생물 보존 센터(미 국 버지니아주 마나사스 소재)로부터 얻었다. 녹아웃 돌연변이체는 다음과 같이 구성되었다.

씨. 글루타미쿰 M1840은 야생형 ATCC 13032(문헌 [Rey et al., 2003, 상기 참조])로부터 유도된 ΔMcbR 균주였다. ATCC 13032는 플라스미드 pH430(SEQ ID No. 1)으로 형질전환되었고, "캠벨드 인"하여 "캠벨 인" 균주를 수득하였다. 그 후 "캠벨 인" 균주는 "캠벨드 아웃"하여 McbR 유전자의 결실을 함유하는 "캠벨 아웃" 균주 M1840을 수득하였다,

씨. 글루타미쿰 M1840은 플라스미드 pH238(SEQ ID No. 2)로 형질전환되었고, "캠벨드 인"하여 "캠벨 인" 균주를 수득하였다. 그 후 "캠벨 인" 균주는 "캠벨드 아웃"하여 호모세린 데히드로게나제 및 호모세린 키나제 유전자의 결실을 함유하는 "캠벨 아웃" 균주 M1840 Δhom, Δhsk를 수득하였다.

씨. 글루타미쿰 M1840은 플라스미드 p(SEQ ID No. 3)로 형질전환되었고, "캠벨드 인"하여 "캠벨 인" 균주를 수득하였다. 그 후 "캠벨 인" 균주는 "캠벨드 아웃"하여 MetB 유전자의 결실을 함유하는 "캠벨 아웃" 균주 M1840 ΔmetB를 수득하였다. 이 균주에서는 측정가능한 시스타티오닌 γ-신타제가 관찰되지 않았다.

화학물질

카사미노산, 쇠고기 추출물, 폴리펩톤 및 이스트 추출물을 디프코사(Difco; 미국 디트로이트 소재)에서 공급받았다. 다른 모든 화학물질은 분석 등급이었고, 그뤼스싱사(Gruessing; 독일 필숨 소재), 아크로스 오가닉스사(Acros Oragnics; 벨기에 길 소재), 메르크사(Merck; 독일 다름슈타트 소재), 알드리히사(Aldrich; 독 일 슈타인하임 소재) 및 플루카사(Fluka; 스위스 부흐 소재)로부터 구입하였다. 추적자 기질, 99％ [¹³C₆] 글루코스 및 98％ [¹³C₄] 트레오닌은 캠브리지 이소토프스 인크.(Cambrige Isotopes Inc.; 미국 매사추세츠주 안도바 소재)로부터 공급받았다. 99％ [¹⁵N] 암모늄 술페이트는 캄프로 사이언티픽사(Campro Scientific; 네덜란드 비넨달 소재)로부터 구입하였다. [³⁴S] 술페이트는 바스프 아게(BASF AG; 독일 루드빅샤펜 소재)에서 흔쾌히 제공받았다.

배지 및 성장 조건

접종용 세포를 10.00 g/L 글루코스, 2.50 g/L NaCl, 2.00 g/L 우레아, 5.00 g/L 이스트 추출물, 5.0 g/L 쇠고기 추출물, 5.0 g/L 폴리펩톤, 20.0 g/L 카사미노산 및 20.0 g/L 한천(판의 경우)을 함유하는 풍부 배지 상에서 성장시켰다. 세포는 판 위에서 30 ℃로 유지되었다. 예비배양체를 25 mL의 풍부 액체 배지를 갖는 배플이 달린 250 mL 진탕 플라스크에서 밤새 성장시켰다. 세포를 원심분리(2분, 10000 g, 4 ℃)에 의해 수거하고, 0.9％ NaCl로 2회 세척하고, 최소 배지 상에서 제2 예비배양체에서의 접종에 사용하였다. 제2 예비배양체를 상기와 같이 하여 수거하고, 주 배양의 스타터로서 사용하고, 최소 배지 상에서 수행하였다. 최소 배지는 40.00 g/L 글루코스, 1.00 g/L K₂HPO₄, 1.00 g/L KH₂PO₄, 42.00 g/L MOPS, 54.00 g/L ACES, 20.00 g/L (NH₄)₂SO₄, 0.30 g/L 3,4-디히드록시벤조산, 0.01 g/L CaCl₂, 0.25 g/L MgSO₄*7H₂O, 0.01 g/L FeSO₄*7H₂O, 0.01 g/L MnSO₄*H₂O, 0.002 g/L ZnSO₄*7H₂O, 0.2 mg/L CuSO₄*5H₂O, 0.02 mg/L NiCl₂*6H₂O, 0.02 mg/L Na₂MoO₄*2H₂O, 0.1 mg/L 시아노코발라민, 0.3 mg/L 티아민, 0.004 mg/L 피리독살 포스페이트, 0.1 mg/L 비오틴으로 구성되었다. 영양요구 돌연변이체 M1840 H238의 배양 및 메티오닌 생합성 경로의 규명을 위해, 배지에 각각 10 mM의 트레오닌, 호모세린, 메티오닌, 시스타티오닌 및 호모시스테인이 보충되었다. 추적자 실험은 30 ℃, 250 rpm의 회전 진탕기(진탕 반경 2.5 cm) 상에서 배플이 달린 50 mL 진탕 플라스크에서 5 mL 배양체에서 수행되었다. 세포는 후기 증식 단계에서 수거되었다. 다른 실험은 회전 진탕기(250 rpm, 30 ℃, 진탕 반경 2.5 cm) 상에서 50 mL 배지에서 배플이 달린 500 mL 진탕 플라스크에서 수행되었다.

메타볼롬( Metabolome )

세포내 대사산물을 종래 기재된 바와 같이 추출하였다 (문헌 [Kromer et al., 2004]). 세척된 (H₂O) 바이오매스를 48시간 동안 가수분해하였다 (105 ℃, 6 N HCl). 가수분해물을 중화하였다 (6 N NaOH). GC/MS 분석을 위해, 샘플(400 μL 추출물 또는 50 μL 가수분해물)을 동결 건조시키고, 50 μL 용매(디메틸포름아미드 중 0.1％ 피리딘)에서 재현탁시키고, 80 ℃에서 50 μL N-메틸(tert-부틸디메틸실릴)트리플루오로아세트아미드(MBDSTFA)로 1시간 동안 최종적으로 유도체화시켰다. GC/MS를 사용한 라벨링 분석은 종래 기재된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [Wittmann, C. et al., Anal Biochem 2002, 3072, 379-82]). 프롤린를 제외하고, 호모시스테인, 호모세린, O-아세틸호모세린 및 시스타티오닌을 비롯한 모든 단백질 원성 아미노산 및 메티오닌 대사의 중간체를 다른 곳에서 기재된 바와 같이 HPLC 상에서 정량화하였다 (문헌 [Kroemer et al., Anal Biochem. 2005;340:171-3]). 호모란티오닌의 정량화는 시스타티오닌 교정 계수를 갖는 HPLC를 사용하여 행하였다.

효소의 과다발현 및 정제

씨. 글루타미쿰의 MetB 및 MetC를 벡터 pQE30(키아젠)에 클로닝하였다. 이 벡터를 사용한 발현은 발현된 단백질의 N-말단부에 His-Tag의 첨가를 포함한다. 에스케르키아 콜라이는 플라스미드로 형질전환되었고, 암피실린 내성(100 μg/mL)에 의해 선택되었다. 형질전환된 이. 콜라이는 TB 배지 상에서 배양되고 (100 μg/mL 암피실린, 37 ℃, 230 rpm) (문헌 [Losen et al., Biotechnol Prog 2004, 204, 1062-8]), 1 mM 이소프로필 티오갈락토시드(최종 농도)를 첨가하여 광학 밀도 1(600 nm)에서 유도하였다. 16시간의 유도 성장 후에 세포를 원심분리(4225 g, 15분, 2 ℃)에 의해 수거하고, 세척하고, 포스페이트 완충액(100 mM, 100 μM 피리독살 포스페이트, 1 mg/mL DNAse I, 4 ℃에서 pH 7.4)에서 재현탁하고, 초음파 처리(5x15초, 20 마이크로미터)로 추출하였다. 조 추출물은 원심분리(30분, 2 ℃, 20000 g)에 의해 세포 파편으로부터 분리되었다. 재조합 MetB 및 MetC는 0.5 M NaCl을 함유하는 0.02 M 나트륨 포스페이트 완충액(pH 7.4)으로 평형화된 HiTrap 킬레이팅 니켈-세파로즈(Nickel-Sepharose) 컬럼(5 mL, 아머샴(Amersham))이 장착된 AEKTA 정제기 900(아머샴 바이오사이언스즈사(Amersham Biosciences; 영국 리틀 찰폰트 소재))상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 최종적으로 정제되었다. 단백 질을 컬럼에 도포한 후, 10 vol.의 0.02 M 나트륨 포스페이트 완충액으로 세척하였다. 용출은 0.5 M NaCl 및 0.5 M 이미다졸을 함유하는 0.02 M 나트륨 포스페이트 완충액(pH 7.4)으로 선형 구배로 행하였다. 단백질을 함유하는 분획을 SDS-PAGE로 그 순도를 조사한 후, 함께 모았다. 이미다졸은 한외여과에 의해 단백질로부터 분리되었다.

MetB 및 MetC 의 시험관내 검정법

MetB 및 MetC의 활성은 측광적으로 수행되었다 (헬리오스 α(Helios α), 써모 일렉트릭사(Thermo Electronic; 독일 드레이아이히 소재)). 효소 활성은 엘만(Ellman) 시약(412 nm에서 흡광)을 사용한 유리 SH-기의 증가 또는 감소에 의해 측정되었다 (Ellman and Lysko, 1979). 검정 혼합물은 MetB-검정법의 경우 1.25 mM 시스테인 또는 호모시스테인 및 3 mM O-아세틸 호모세린을 함유하였고, MetC-검정법의 경우 1.25 mM 시스타티오닌 또는 약 1.25 mM 호모란티오닌을 함유하였다. 호모란티오닌은 시판되지 않았다. 따라서, MetC-검정법은 MetB-검정법의 생성물을 사용하여 수행하였다. MetB는 한외여과로 제거되었다. 따라서, 호모란티오닌 농도는 검정법에서 조절할 수 없었다. 또한, 검정 용액은 포스페이트 완충액(100 mM, pH 7.5) 및 10 μM 피리독실-5-포스페이트, MetB 및 MetC의 보조인자로 이루어졌다. 65 μL 샘플을 검정 혼합물로부터 취하고, 무시로 935 μL의 정지액(stopping solution) 내로 주입하였다. 정지액은 포스페이트 완충액(100 mM, pH 7.5)과 38％ 에탄올 및 1 mM 디티오니트로벤조산(DTNB)으로 이루어졌다. 에탄올은 효소 활성을 정지시켰고 DTNB는 호모시스테인 또는 시스테인과 황색 복합물을 형성 하였다. 검정은 유리 SH-기의 1.5 mM 까지 선형 결과를 나타냈다. K_m값은 이중 역수 라인위버-버크(Lineweaver-Burk) 플롯으로부터 결정하였다.

표 2는 호모세린/메티오닌 및 트레오닌 영양요구성 씨. 글루타미쿰 ΔMcbR, Δhom, Δhsk에서 이소류신, 트레오닌 및 알라닌 라벨링을 나타낸다. 배양은 자연적으로 라벨링된 호모세린 및 [U¹³C]-글루코스(99％) 및 [U¹³C]-트레오닌(98％) 상에서 일어났다. 단백질 가수분해물에서 다양한 질량 동위 원소 이성질체의 상대 존재비를 나타낸다.

표 3은 다른 유기체와 비교하여 씨. 글루타미쿰의 MetC 및 MetB에 대한 K_m값을 나타낸다.

결과:

McbR 녹아웃에 대한 생리적 응답

코리네박테리움 글루타미쿰 내 전사 조절인자 McbR의 녹아웃은 세포 대사에 심각한 결과를 가져온다. McbR이 녹아웃된 것만 야생형과 다른 균주 씨. 글루타미쿰 M1840은 0.18 [h^-1]의 감소된 성장률을 나타냈다. 대조적으로, 야생형의 성장률은 0.41 [h^-1]이었다. 또한, M1840의 바이오매스 수율은 상당히 감소하였다. 야생형은 0.55 g_{바이오매스} g_글루코스 ^{- 1}를 생성하지만, M1840은 불과 0.36 g_{바이오매스} g_글루코스 ^{- 1}를 생성하였다. 이들 결과는 세포 대사가 McbR 녹아웃에 매우 민감함을 나타낸다. 지수적 성장 도중, 씨. 글루타미쿰 M1840은 세포내 호모시스테인 및 시스테인 역가가 상승하였다. 야생형과 비교하여, 세포내 호모시스테인 농도는 0.1 μmol g_CDW ^-1에서 2.9 μmol g_CDW ^-1로 증가하였고, 시스테인은 0.3 μmol g_CDW ^-1에서 2.8 μmol g_CDW ^-1로 증가하였다. 이는 각각 29 및 9.3배 증가한 것과 같다. McbR의 녹아웃이 중요한 메티오닌 전구체를 축적시킨다는 것이 명백해진다. 그러나, HPLC 및 GC/MS 스펙트럼은 또한 호모란티오닌(도 1b)으로 확인될 수 있는 추가의 강한 시그널을 나타냈다.

호모란티오닌의 확인

호모란티오닌 구조는 추가의 메틸렌기의 함량이 시스타티오닌과 상이하다 (도 1b). 양 α-탄소 원자는 천연 호모란티오닌에서 S-배열을 갖는다. 호모란티오닌은 시스타티오닌에 대해 얻어진 HPLC 교정 계수로 정량화되었다. 동종 야생형 균주 ATCC 13032가 1,3 μmol g_CDW ^-1인 것과 비교하여 지수적으로 성장하는 씨. 글루타미쿰 M1840(=ATCC 13032 ΔMcbR)에서 250 μmol g_CDW ^-1의 축적은 이 아미노산을 글루타메이트(325 μmol g_CDW ^-1)에 이어서 제2의 중요한 세포내 아미노산으로 만든다. 호모란티오닌은 라벨링 실험 및 GC/MS 단편 패턴에 의해 확되었다. [U¹³C]-글루코스, [¹⁵N]-암모늄 술페이트, [³⁴S]-술페이트를 사용한 씨. 글루타미쿰의 분리배양 및 후속하는 세포 추출 및 GC/MS를 사용한 라벨링 분석은 관찰되는 대사산물의 탄소, 질소 및 황 함량이 호모란티오닌(C₈N₂S₁)과 매치됨을 확인해 주었다. GC/MS에서 호모란티오닌의 관찰된 질량 단편 m(m/z = 692), m-15(m/z = 677), m-57(m/z = 635)은 시스타티오닌에서의 그들의 대응물보다 14 질량 더 무거우며 (도 3), 이는 추가의 메틸렌기가 존재함을 나타낸다. 추가로, 호모시스테인 잔기의 특징적인 단편 m/z = 170, m/z = 244 및 m/z = 272는 시스타티오닌, 호모시스테인 및 메티오닌에서도 관찰 가능했다. metB를 게놈에서 결실시키는 경우, 얻어지는 균주 M1840 ΔMetB(ATCC 13032 ΔMcbR ΔMetB에 상응함)는 분석시 검출 한계에 가까운 단지 0.33 μmol g_CDW ^-1 호모란티오닌 축적을 나타냈다. 이 관찰은 metB 결실이 물질 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적을 예방하고, 이에 따라 metB와 같은 시스타티오닌 γ-신타제 활성을 갖는 효소가 메티오닌 제조를 저해할 수 있는 호모란티오닌 축적을 지원할 것이라는 점이 입증되었다는 점을 명확히 나타낸다.

세포 대사에서 호모란티오닌의 기원

[U¹³C]-글루코스 및 [U¹³C]-트레오닌 및 자연적으로 라벨링된 호모세린을 갖는 씨. 글루타미쿰 ΔMcbR, Δhom, Δhsk 돌연변이체의 배양은 호모란티오닌이 호모세린으로부터 유도된 것이라는 점을 극명히 보여주었다. 호모세린처럼, 호모란티오닌의 라벨링은 자연 라벨링 패턴을 드러내며, 이는 글루코스도 트레오닌도 호모란티오닌 합성을 위해 필요한 전구체를 제공하지 않는다는 점을 나타낸다. 추가 실험에서, 균주는 호모세린 대신 메티오닌, 시스타티오닌 또는 호모시스테인을 공급했다는 점 이외에는, 동일한 조건 하에서 배양되었다. 이들 실험은 균주를 이들 기질로 성장시킬 수 있다는 점을 보여주었는데, 본 출원인은 문헌 [Ruckert et al., 2003, 상기 참조]의 발견을 확증하는 시스타티오닌의 성장 감소를 관찰하였다. 이들 세 기질의 영양 공급은 호모란티오닌의 상당한 축적을 유도하지 않았다. 이것은 메티오닌 경로에서 이 대사산물의 축적이 호모시스테인 형성 전에 위치해야 함을 나타낸다. 역 방향으로 작용하는 MetB, MetZ 또는 MetC는 호모란티오닌 형성 효소에 대한 후보자로 간주할 수도 있었다.

MetB 및 MetC 의 단리 및 특성화

메티오닌 경로에서 호모란티오닌 축적에 관한 의문점을 더 다루기 위해, MetB 및 MetC를 이. 콜라이에서 과다발현시키고 단리하였다. 단리된 단백질은 효소 검정법으로 규명되었다. 이들의 자연 기질 시스테인 및 시스타티오닌 각각의 K_m값은 다른 유기체의 상응하는 효소에서 찾을 수 있는 것과 동일한 범위이다 (표 3). 시스테인의 경우 MetB의 K_m값은 258 μM인 반면, 호모시스테인의 경우 K_m값은 541 μM로 2배보다 컸다. 씨. 글루타미쿰 ΔMcbR에서 호모시스테인 및 시스테인의 세포내 농도는 동일하므로, 관찰된 K_m값은 양 기질이 생체내에서 MetB에 의해 사용됨을 나타낼 수 있다. 시스타티오닌의 경우 MetC의 K_m값은 이. 콜라이와 살모넬라 시스타티오니나제 사이의 값인 107 μM이었다 (표 3). 순수한 호모란티오닌이 부족하기 때문에, 이 기질의 K_m값은 결정할 수 없었다. 그러나 4.5 mM인 이. 콜라이 시스타티오니아제의 상응하는 값(표 2)은 호모란티오닌의 분열이 매우 불량함을 나타냈다. MetB는 o-아세틸-호모세린 및 시스테인 또는 호모시스테인 각각으로 인큐베이션되는 것으로 더 규명되었다. 시스테인(도 2A) 및 호모시스테인(도 2B)의 소모는 측광적으로 수행되었다. 또한, 0분, 80분 및 205분에 효소 검정물로부터 샘플을 취하고, HPLC로 분석하였다. MetB는 시스테인 및 O-아세틸-호모세린을 시스타티오닌으로 효과적으로 전환시켰다. 이는 O-아세틸-호모세린 및 호모시스테인으로 인큐베이팅하는 경우 호모란티오닌을 형성하였다. 80분 후 MetB가 한외여과에 의해 검정물로부터 제거되었고, MetC를 첨가하였다. MetC의 첨가는 시스타티오닌을 완전 분열시켜 호모시스테인을 축적시켰고, 또한 측광 검정법에서 흡광 증가를 유발하였다 (도 2A). 호모란티오닌은 MetC에 의해 단지 약간만 분열되어 호모시스테인을 약간 증가시키고 호모란티오닌 농도를 약간 감소시켰다. 분열은 광도계에서 수행되기에는 약했다. 이는 호모란티오닌에 대한 MetC의 K_m값이 이. 콜라이만큼 높을 수 있음을 나타냈다. 사실상, 이. 콜라이의 MetC의 K_m값은 시스타티오닌의 경우 40 μM이고 호모란티오닌의 경우 4.5 mM이었고(문헌 [Dwivedi, C. M. et al., Biochemistry 1982, 2113, 3064-9]), 이는 호모란티오닌의 분열이 MetC에 의해 늦춰진다는 것을 나타낸다. 유사한 결과가 유렌(Uren)에 의해 발견되었다 (문헌 [Uren, J. R., Methods Enzymol 1987, 143, 483-6]). 흥미롭게도, 시스타티오닌의 분열 및 호모시스테인의 축적은 소량의 호모란티오닌의 축적을 야기한다. 이는 MetC 역시 호모란티오닌을 형성할 수 있음을 나타낸다. 그러나, 애당초 MetB를 함유하지 않았던 O-아세틸-호모세린 및 호모시스테인을 사용한 대조군은 MetC를 첨가하는 경우 호모란티오닌을 생성하지 않았다. 이는 MetC가 이들 기질을 사용하여 호모란티오닌을 생성할 수 없음을 보여준다. 시스타티오닌의 분열 도중 축적되는 호모시스테인은 시스타티오닌-β-신타제(CysM) 반응을 위해 MetC에 의해 사용될 수 있다. 세린 대신, MetC는 검정물에서 O-아세틸-호모세린으로부터의 불순물로서 존재하는 호모세린을 사용하여 호모란티오닌을 형성할 수 있었다. O-아세틸-호모세린 또는 호모시스테인만을 사용한 대조 검정물 및 O-아세틸-호모세린 대신 호모세린을 사용한 대조군은 MetB 또는 MetC를 사용하여 어떠한 생성물도 생성하지 못했다. 또한, MetC에 의한 호모란티오닌의 가수분해적 분열은 호모시스테인의 형성을 유도할 뿐만 아니라, 시스타티오닌 분열과 유사하게 암모니아 및 2-옥소부타노에이트가 제조되어야 한다. 후자는 이소류신의 전구체이다. 이는 대사 경로를 메티오닌 생합성으로부터 이소류신 형성으로 유도할 것이고, 이소류신의 공지된 유일한 공급원인 트레오닌을 우회할 것이다.

이소류신 대사에 대한 영향

이소류신은 C₄-전구체(트레오닌) 및 C₃-전구체(피루베이트)로부터 형성된다. 최종 분자에서 이소류신의 두 탄소 원자는 피루베이트로부터 유도된다. C₄-전구체를 라벨링하지 않고 피루베이트를 라벨링한 경우, 2의 질량 변이가 관찰된다. GC/MS로 조사된 이소류신 단편은 탄소수 2 내지 6의 이소류신 골격을 함유하였다. 트레오닌 및 글루코스가 완전히 라벨링된 경우, m/z = 200에서의 질량 변이는 m+5여야 한다. 그러나, C₄ 유도된 호모세린을 사용하여 이소류신을 형성한 경우, 라벨링된 피루베이트로부터 유도되는 m+2의 변이가 관찰되어야 한다. 사실상, 트레오닌이 아니라 다른 전구체로부터 이소류신의 형성이 McbR-녹아웃 균주에서 관찰되었다. 씨. 글루타미쿰 ΔMcbR, Δhom, Δhsk에서 단백질원성 이소류신의 약 13％가 자연적으로 라벨링된 호모세린으로부터 유도된 전구체로부터 형성되었지만, 배양 배지에 제공된 라벨링된 트레오닌으로부터 형성되지는 않았다 (표 3). 이는 이소류신의 m+2 질량 동위 원소 이성질체(m/z=200)의 존재비가 13％로 관찰되는 것으로 알 수 있었다. 단백질원성 트레오닌은 세포외 글루코스 라벨링과 동일한 피루베이트 라벨링이 반영된 세포외 트레오닌 및 알라닌과 동일하게 라벨링되었다. 씨. 글루타미쿰이 트레오닌과 무관한 이소류신을 생성할 수 있음이 명백해졌다. 추가의 이소류신 전구체로는 메티오닌 대사로부터 유도된 2-옥소부타노에이트가 가장 흔하다. 보통, 이 유기 산은 트레오닌 암모니아-리아제를 통한 트레오닌의 탈아미노 작용에 의해 이소류신 대사에서 형성된다. 메티오닌 대사에서, 2-옥소부타노에이트를 형성할 수 있는 별도의 반응이 있다. 메티오닌 메탄티올-리아제(EC 4.4.1.11), 호모시스테인 수소-술피드-리아제(EC 4.4.1.2) 또는 시스타티오닌 시스테인-리아제(EC 4.4.1.1)는 2-옥소부타노에이트를 형성시킬 수 있다. 돌연변이체에 메티오닌, 호모시스테인 또는 시스타티오닌 및 동시에 완전 탄소 라벨링된 글루코스 및 트레오닌을 공급함으로써, 이들 가능성을 제외하였다 (표 2). 또한, 이들 연구에서 이소류신 라벨링의 변화는 호모란티오닌의 축적과 연결되며, 이는 호모란티오닌의 MetC-분할이 트레오닌과 무관한 이소류신 합성을 가장 잘 유도한다는 것을 나타낸다.

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ggcatgatct ccgtccgttt cgcaggcggc gaagaagcag ctaagaagtt ctgtacctcc 660 accaaactga tctgtctggc cgagtccctc ggtggcgtgg aatccctcct ggagcaccca 720 gcaaccatga cccaccagtc agctgccggc tctcagctcg aggttccccg cgacctcgtg 780 cgcatctcca ttggtattga agacattgaa gacctgctcg cagatgtcga gcaggccctc 840 aataaccttt agaaactatt tggcggcaag cagcttttca atataagcaa tgcgagcctc 900 caccatgtag ccgaagagtt cgtcagaagt tgagacggac tcttcgactg ctttacgggt 960 cagtggcgct tccacatctg ggttctcatc aagccatggc ttaggaaccg gagcaaacac 1020 atccggcttt tcgccctctg gacgattgtc aaaggtgtag tcggatcccc gggtaccgag 1080 ctcgaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca 1140 acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg 1200 caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgat aagctagctt 1260 cacgctgccg caagcactca gggcgcaagg gctgctaaag gaagcggaac acgtagaaag 1320 ccagtccgca gaaacggtgc tgaccccgga tgaatgtcag ctactgggct atctggacaa 1380 gggaaaacgc aagcgcaaag agaaagcagg tagcttgcag tgggcttaca tggcgatagc 1440 tagactgggc 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tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt 2340 acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct 2400 tctgagcggg actctggggt tcgctagagg atcgatcctt tttaacccat cacatatacc 2460 tgccgttcac tattatttag tgaaatgaga tattatgata ttttctgaat tgtgattaaa 2520 aaggcaactt tatgcccatg caacagaaac tataaaaaat acagagaatg aaaagaaaca 2580 gatagatttt ttagttcttt aggcccgtag tctgcaaatc cttttatgat tttctatcaa 2640 acaaaagagg aaaatagacc agttgcaatc caaacgagag tctaatagaa tgaggtcgaa 2700 aagtaaatcg cgcgggtttg ttactgataa agcaggcaag acctaaaatg tgtaaagggc 2760 aaagtgtata ctttggcgtc accccttaca tattttaggt ctttttttat tgtgcgtaac 2820 taacttgcca tcttcaaaca ggagggctgg aagaagcaga ccgctaacac agtacataaa 2880 aaaggagaca tgaacgatga acatcaaaaa gtttgcaaaa caagcaacag tattaacctt 2940 tactaccgca ctgctggcag gaggcgcaac tcaagcgttt gcgaaagaaa cgaaccaaaa 3000 gccatataag gaaacatacg gcatttccca tattacacgc catgatatgc tgcaaatccc 3060 tgaacagcaa aaaaatgaaa aatatcaagt ttctgaattt gattcgtcca caattaaaaa 3120 tatctcttct gcaaaaggcc tggacgtttg ggacagctgg ccattacaaa acgctgacgg 3180 cactgtcgca aactatcacg gctaccacat cgtctttgca ttagccggag atcctaaaaa 3240 tgcggatgac acatcgattt acatgttcta tcaaaaagtc ggcgaaactt ctattgacag 3300 ctggaaaaac gctggccgcg tctttaaaga cagcgacaaa ttcgatgcaa atgattctat 3360 cctaaaagac caaacacaag aatggtcagg ttcagccaca tttacatctg acggaaaaat 3420 ccgtttattc tacactgatt tctccggtaa acattacggc aaacaaacac tgacaactgc 3480 acaagttaac gtatcagcat cagacagctc tttgaacatc aacggtgtag aggattataa 3540 atcaatcttt gacggtgacg gaaaaacgta tcaaaatgta cagcagttca tcgatgaagg 3600 caactacagc tcaggcgaca accatacgct gagagatcct cactacgtag aagataaagg 3660 ccacaaatac ttagtatttg aagcaaacac tggaactgaa gatggctacc aaggcgaaga 3720 atctttattt aacaaagcat actatggcaa aagcacatca ttcttccgtc aagaaagtca 3780 aaaacttctg caaagcgata aaaaacgcac ggctgagtta gcaaacggcg ctctcggtat 3840 gattgagcta aacgatgatt acacactgaa aaaagtgatg aaaccgctga ttgcatctaa 3900 cacagtaaca gatgaaattg aacgcgcgaa cgtctttaaa atgaacggca aatggtacct 3960 gttcactgac 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cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 6540 ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 6600 aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg 6660 ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 6720 acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcttgc atgcctgcag gtcgactct 6779

Claims (31)

1. 메티오닌 경로에서 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적을 감소시키고/시키거나 예방하는 L-메티오닌 과잉 제조 미생물.
2. 제1항에 있어서, 전사 조절인자 단백질 McbR의 함량 및/또는 생물학적 활성이 야생형 미생물에 비해 감소된 미생물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, McbR을 코딩하는 유전자가 분열되고, 바람직하게는 제거된 미생물.
4. 제3항에 있어서, 분열된 mcbR 유전자가 기능성 McbR 단백질의 발현을 예방하는 미생물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 시스타티오닌-γ-신타제(MetB)의 함량 및/또는 생물학적 활성을 야생형 미생물에 비해 감소시킴으로써 메티오닌 경로에서 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적을 감소시키고/시키거나 예방하는 미생물.
6. 제5항에 있어서, MetB를 코딩하는 유전자가 분열되고, 바람직하게는 제거된 미생물.
7. 제6항에 있어서, 분열된 metB 유전자가 기능성 MetB 단백질의 발현을 예방하는 미생물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 호모란티오닌을 호모시스테인으로 효과적으로 전환할 수 있는 시스타티오닌-β-리아제(MetC) 돌연변이체를 코딩하는 이종 유전자를 도입함으로써 메티오닌 경로에서 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적을 감소시키고/시키거나 예방하는 미생물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, O-아세틸-호모세린 및 시스테인을 시스타티온으로 효과적으로 전환할 수 있고, O-아세틸-호모세린 및 호모시스테인을 호모란티오닌으로 전환할 수는 없는 시스타티오닌-γ-신타제(MetB) 돌연변이체를 코딩하는 이종 유전자를 도입함으로써 메티오닌 경로에서 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적을 감소시키고/시키거나 예방하는 미생물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, O-아세틸호모세린 술프히드롤라제(MetZ), 코브(I)알라민 의존성 메티오닌 신타제 I(MetH) 및 코브(I)알라민 독립성 메티오닌 신타제 II(MetE)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 단백질의 함량 및/또는 생물학적 활성이 야생형 미생물에 비해 증가된 미생물.
11. 제10항에 있어서, O-아세틸호모세린 술프히드롤라제(MetZ), 코브(I)알라민 의존성 메티오닌 신타제 I(MetH) 및 코브(I)알라민 독립성 메티오닌 신타제 II(MetE)의 활성을 갖는 단백질로 이루어지는 군 중에서 선택되는 단백질을 코딩하는 1종 이상의 유전자가 야생형 미생물에 비해 향상되고/되거나 과다발현된 미생물.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 코리네형 박테리아, 미코박테리아, 스트렙토마이세타세에(streptomycetaceae), 살모넬라(salmonella), 에스케르키아 콜라이(Escherichia coli), 시겔라(Shigella), 바실루스(Bacillus), 세라티아(Serratia) 및 슈도모나스(Pseudomonas)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 미생물.
13. 제12항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 에스케르키아 콜라이 또는 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)인 미생물.
14. - L-메티오닌을 제조하고, 바람직하게는 과잉 제조하며, 메티오닌 경로에서 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적을 감소시키고/시키거나 예방하는 미생물을 배양 및/또는 발효시키는 단계, 및

    - L-메티오닌을 단리시키는 단계

    를 포함하는, L-메티오닌의 제조 방법.
15. 제14항에 있어서, 시스타티오닌-γ-신타제(MetB)의 함량 및/또는 생물학적 활성이 야생형 미생물에 비해 감소된 미생물이 배양되는, L-메티오닌의 제조 방법.
16. 제15항에 있어서, MetB를 코딩하는 유전자가 분열되고, 바람직하게는 제거된 미생물이 배양되는, L-메티오닌의 제조 방법.
17. 제16항에 있어서, 분열된 metB 유전자가 배양된 미생물에서 기능성 MetB 단백질의 발현을 예방하는, L-메티오닌의 제조 방법.
18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 조절인자 단백질 McbR의 함량 및/또는 생물학적 활성이 야생형 미생물에 비해 감소된 미생물이 배양되는, L-메티오닌의 제조 방법.
19. 제18항에 있어서, McbR을 코딩하는 유전자가 분열되고, 바람직하게는 제거된 미생물이 배양되는, L-메티오닌의 제조 방법.
20. 제19항에 있어서, 분열된 mcbR 유전자가 기능성 McbR 단백질의 발현을 예방하는, L-메티오닌의 제조 방법.
21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 호모란티오닌을 호모시스테인으로 효과적으로 전환할 수 있는 시스타티오닌-β-리아제(MetC) 돌연변이체를 코딩하는 이종 유전자가 도입된 미생물이 배양되는, L-메티오닌의 제조 방법.
22. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, O-아세틸-호모세린 및 시스테인을 시스타티온으로 효과적으로 전환할 수 있고, O-아세틸-호모세린 및 호모시스테인을 호모란티오닌으로 전환할 수는 없는 시스타티오닌-γ-신타제(MetB) 돌연변이체를 코딩하는 이종 유전자가 도입된 미생물이 배양되는, L-메티오닌의 제조 방법.
23. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, O-아세틸-호모세린 술프히드롤라제(MetZ), 코브(I)알라민 의존성 메티오닌 신타제 I(MetH) 및 코브(I)알라민 독립성 메티오닌 신타제 II(MetE)의 활성을 갖는 단백질로 이루어지는 군 중에서 선택되는 단백질의 함량 및/또는 생물학적 활성이 야생형 미생물에 비해 증가된 미생물이 배양되는, L-메티오닌의 제조 방법.
24. 제23항에 있어서, O-아세틸-호모세린 술프히드롤라제(MetZ), 코브(I)알라민 의존성 메티오닌 신타제 I(MetH) 및 코브(I)알라민 독립성 메티오닌 신타제 II(MetE)의 활성을 갖는 단백질로 이루어지는 군 중에서 선택되는 단백질을 코딩하 는 1종 이상의 유전자가 야생형 미생물에 비해 향상되고/되거나 과다발현된 미생물이 배양되는, L-메티오닌의 제조 방법.
25. 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 코리네형 박테리아, 미코박테리아, 스트렙토마이세타세에, 살모넬라, 에스케르키아 콜라이, 시겔라, 바실루스, 세라티아 및 슈도모나스로 이루어지는 군 중에서 선택되는, L-메티오닌의 제조 방법.
26. 제25항에 있어서, 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰, 에스케르키아 콜라이 또는 바실루스 섭틸리스인, L-메티오닌의 제조 방법.
27. 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, L-메티오닌이 배지 내 또는 미생물의 세포 내에서 농축되는, L-메티오닌의 제조 방법.
28. - 목적하는 L-아미노산을 제조하고, 바람직하게는 과잉 제조하며, 발효 배지에서 메티오닌 경로 중 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적을 감소시키고/시키거나 예방하는 미생물을 배양하고 발효시키는 단계,

    - L-메티오닌-함유 발효 브로쓰로부터 물을 제거하는 단계,

    - 발효 도중 형성된 바이오매스 0 내지 100 중량％를 제거하는 단계, 및

    - 발효 브로쓰를 건조시켜 분말 또는 과립 형태의 동물 사료 첨가제를 얻는 단계

    를 포함하는, 발효 브로쓰로부터 L-메티오닌-함유 동물 사료 첨가제의 제조 방법.
29. 제28항에 있어서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 미생물이 배양되는, L-메티오닌-함유 동물 사료 첨가제의 제조 방법.
30. 메티오닌 경로에서 호모란티오닌의 형성 및/또는 축적을 감소시키고/시키거나 예방하는 미생물의 L-메티오닌 제조를 위한 용도.
31. 제30항에 있어서, 미생물이 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 것인 용도.

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