KR101770123B1 - 숙시네이트 데히드로게나제의 과다발현에 의한 메티오닌 생산의 증가 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 숙시네이트 데히드로게나제 합성에 관여하는 유전자의 발현을 증대시키기 위해 변형된 미생물의 배양에 의해 메티오닌의 제조를 개선하는 절차에 관한 것이다. 미생물은 메티오닌/탄소 공급원 수율이 증가하는 방식으로 변형되었다. 발효 배지로부터의 메티오닌의 단리가 또한 청구된다.

Description

숙시네이트 데히드로게나제의 과다발현에 의한 메티오닌 생산의 증가 {INCREASING METHIONINE PRODUCTION BY OVEREXPRESSING SUCCINATE DEHYDROGENASE}
본 발명의 분야
본 발명은 숙시네이트 데히드로게나제 합성에 관여하는 유전자의 발현을 증대시키기 위해 변형된 미생물의 배양에 의해 메티오닌의 제조를 개선하는 절차에 관한 것이다. 미생물은 메티오닌/탄소 공급원 수율이 증가하는 방식으로 변형되었다. 발효 배지로부터의 메티오닌의 단리가 또한 청구된다.
선행 기술
숙시네이트 데히드로게나제 (숙시네이트 산화환원효소(oxidoreductase), SQR)는 크레브스 회로 및 호기성 호흡쇄 둘다의 기능적 구성원이다. SQR은 세균 세포질에서의 숙시네이트에서 푸마레이트로의 산화를 촉매화하고, 막에서의 유비퀴논의 환원이 수반된다. 이. 콜라이(E. coli) 및 다른 세균에서 효소는 4개 서브유닛으로 구성된다. 2개의 소수성 서브유닛, SdhC 및 SdhD는 2개 친수성 및 촉매성 서브유닛 SdhA 및 SdhB를 내막의 표면에 앵커링한다. 5개의 독특한 보조인자가 숙시네이트에서 푸마레이트로의 산화에 관여한다. SdhA에서 공유결합으로 부착된 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FAD) 분자가 히드라이드 전달 기전에 의해 숙시네이트 산화를 촉매화하기 위해 존재한다. 전자는 이어서 [2Fe-2S], [4Fe-4S] 및 [3Fe-4S] 군집을 함유하는 전자 전달 서브유닛 (SdhB)을 통해 개별적으로 전달된다. 퀴논 결합 부위는 SdhC, SdhD 및 SdhB로부터의 잔기에 의해 형성되며, 유비퀴논의 유비퀴놀로의 환원을 허락한다. 효소는 또한 SdhC 및 SdhD 사이에 껴있는 효소 기능에 필수적이 아닌 헴 b 분자를 함유한다 (문헌 [Yankovskaya et al. 2003, Science 299, 700; Cheng et al. 2008 Biochemistry 47, 6107]).
아미노산 L-메티오닌은 대량 (600000 t/an)으로 생산되는 중요한 사료-첨가제이다. 생산은 화학적 생합성에만 의존하며, 원유 유도된 전구체를 요구한다. 이들 비-재생가능한 자원의 가격에 대한 증가하는 압박과 더불어, 지속가능한 절차에 대한 관심은 증가한다. 메티오닌의 발효 제조는 따라서 화학적 절차에 대한 경제적으로 실행가능한 대안이 되었다.
발효에 의한 메티오닌 생산은 여러 전구체-제공 경로의 변형을 요구한다. 3개 주요 경로는 메티오닌 생합성에 기여한다. 아스파르테이트는 탄소 골격의 전구체로서, 시스테인은 황 공여자로서, 그리고 메틸렌-THF는 말단 메틸기의 공여자로서의 역할을 한다. 추가로, 숙시닐-CoA에 의한 아스파르테이트-유도된 호모세린의 활성은 메티오닌 생합성에서의 제1 단계를 위해 요구된다. 숙시닐-CoA는 크레브스 회로에서 생산되며, 따라서 크레브스 회로 효소의 증가된 발현은 메티오닌 생산을 증가시킬 수 있다. 그럼에도 불구하고 높은 크레브스 회로 활성은 아미노산 생산에 대해 단점인 것으로 나타났고, 크레브스 회로 효소, 예를 들면 이소시트레이트 데히드로게나제의 활성의 감소는 아미노산 생산에 이로울 수 있다 (WO2007017710 Metabolic Explorer, WO2009133063 Evonik Industries).
WO 2009078973 (Glycos Biotechnology) 및 EP1106684 (Evonik Industries)는 sdh 유전자의 결실은 산업적 관심의 아미노산 및 다른 대사물의 생산을 증가시키는 것을 개시한다. sdh 유전자의 발현의 감소는 크레브스 회로 활성을 낮출 것이고, 따라서 CO2 생산을 낮출 것이라는 것은 이 기술로부터 이해되며, 이는 따라서 생성물 수율에 대해 긍정적인 영향을 가질 것이다.
재생가능한 탄소 공급원으로부터 생산되는 메티오닌의 수율을 증가시킬 필요성이 있다. 숙시네이트 데히드로게나제의 감소된 활성이 생성물 수율을 증가시킨다는 선행 기술의 교시와 달리, 숙시네이트 데히드로게나제 효소의 증가된 발현은 메티오닌/글루코스 수율을 증가시킨다는 것이 밝혀졌다.
본 발명의 간단한 설명
본 발명은 탄소의 공급원 및 황의 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 개선된 메티오닌 제조를 위해 변형된 미생물을 배양하는 단계, 및 배양 배지로부터 메티오닌을 회수하는 단계를 포함하는, 발효 공정에서 메티오닌의 제조를 증가시키기 위한 방법에 관한 것이며, 여기서 미생물은 숙시네이트 데히드로게나제 (sdh) 효소를 코딩하는 유전자(들)의 발현을 증대시킴으로써 추가로 변형된다.
이 (이들) 유전자(들)의 발현은 미생물에 숙시네이트 데히드로게나제를 코딩하는 상기 유전자(들) 중 하나 이상의 보조 복사본을 삽입함으로써 증대된다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 메티오닌은 배양 배지로부터 추가로 단리된다.
본 발명은 또한 숙시네이트 데히드로게나제를 과다발현시킴으로써 메티오닌 제조를 위해 최적화된 미생물, 바람직하게는 장내세균(Enterobacteriaceae), 코리네폼 세균(Corynebacteriaceae), 효모, 또는 곰팡이에 관련된다. 본 발명의 절차에서 사용된 이 미생물은 증가된 메티오닌/탄소 공급원 수율을 가능하게 한다.
본 발명의 상세한 설명
메티오닌 생산 미생물
본 발명은 변형된 미생물을 배양함으로써 발효 공정에서의 메티오닌의 제조를 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 용어 "배양', '발효' 또는 '발효 공정"는 단순 탄소 공급원을 함유하는 적절한 성장 배지 상에서의 세균의 성장을 나타내기 위해 대체가능하게 사용되었다. 이 단순 탄소 공급원은 메티오닌을 생산하기 위한 미생물에 의해 대사된다.
본 발명의 또다른 목표는 발효 공정에서의 메티오닌의 상기 제조 방법에서 사용하기 위한 변형된 미생물이다. 본 발명에 따라, 용어 "미생물"은 세균, 효모 또는 곰팡이를 나타낸다. 바람직하게는, 세균은 장내세균, 코리네폼 세균으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 미생물은 에셰리키아(Escherichia), 클렙시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea), 살모넬라(Salmonella) 또는 코리네폼 세균의 종이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 세균은 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 미생물은 바람직하게는 sdh 효소를 코딩하는 내인성 유전자(들)을 포함한다.
용어 "메티오닌 제조를 위해 개선된 미생물"은 비-변형된 미생물에 비교하여 단순 탄소 공급원을 대사함으로써 메티오닌 제조를 개선시키기 위해 유전적으로 변형된 미생물을 나타낸다. 상기 변형은 메티오닌 생합성 경로에 관여하는 유전자의 증대되거나, 조정되거나 또는 감소된 발현에 상응할 수 있다. 당업자는 특정 유전자의 발현을 어떻게 조정하는지 알고 있다. 일반적인 변형은 이종 또는 내인성 유전자의 발현을 위해 미생물을 유전자 대체, 프로모터의 변형, 및 벡터의 도입을 포함하는 유전적 요소로 형질전환시키는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 변형된 미생물은 숙시네이트 데히드로게나제 효소의 서브유닛 중 하나를 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현을 증대시킴으로써 변형된다. 바람직하게는 숙시네이트 데히드로게나제 효소의 상이한 서브유닛을 코딩하는 모든 유전자는 과다발현된다. 숙시네이트 데히드로게나제는 일반적으로 3개 이상의 서브유닛을 함유하는 효소 복합체이다. 각각 서브유닛은 1개 유전자에 의해 코딩된다. 예를 들면, 코리네폼 세균 종은 숙시네이트 데히드로게나제를 코딩하는 3개 유전자 sdhA, sdhB 및 sdhC를 함유하고 (문헌 [Bussmann et al., 2009, J. Biotechnol, 143(3), 173]), 다른 미생물, 예를 들면 이. 콜라이 또는 에스. 세레비시에(S. cerevisiae)는 4개 숙시네이트 데히드로게나제 서브유닛에 대한 4개 유전자를 갖는다. 이들 sdh 유전자는 오페론으로 구조화된다. 용어 오페론은 전사의 단위를 기재하며, 여기서 여러 유전자는 다시스트론 전령 RNA로 전사된다. (sdhA: P0AC41, sdhB: P07014, sdhC : P69054, sdhD P0AC44에 대한 이. 콜라이 접속 번호).
용어 "증대시키는' 또는 '증대된' 또는 '과다발현된' 또는 '증가된 발현' '증대된 발현' 또는 '과다발현"은 본문에서 대체가능하게 사용되고, 유사한 의미를 갖는다. 이 맥락에서의 이들 용어는, 예를 들면, 유전자의 복사본의 수를 증가시키거나, 강한 프로모터를 사용하거나 또는 증가된 활성을 갖는 대립유전자를 사용함으로써, 그리고 가능하면 이들 수단을 합함으로써 상응하는 DNA에 의해 코딩되는 효소적 활성의 세포내 활성의 증가를 기재한다. 이들 프로모터는 유도가능할 수 있고; 이들은 동종이거나 또는 이종일 수 있다. 당업자는 어떤 프로모터가 가장 편리한지 알고있으며, 예를 들면 프로모터 Ptrc, Ptac, Plac (문헌 [Dickson et al., 1975, Science 187(4171), 27]; [de Boer et al., 1983, Proc Natl Acad Sci U S A, 80(1), 21]; [Brosius et al., 1985, J Biol Chem, 260(6), 3539]) 또는 람다 프로모터 cI (문헌 [Ptashne M, 1986, Blackwell Scientific, Cambridge, MA]; [Ptashne M, 2004, Cold Spring Harbor Lab Press]; [Little J, 2004, Richard Calendar.ed. Oxford University Press])가 널리 사용된다.
유전자가 오페론으로 구조화된 경우, 단일 프로모터의 조절하에 이들 유전자의 하나의 보조 복사본을 첨가함으로써 이들의 발현을 증대시키는 것이 가능하다. 발현은 또한 염색체 야생형 프로모터를 야생형 프로모터보다 강한 인공 프로모터로 대체함으로써 증대될 수 있다. 당업자는 프로모터 강도를 어떻게 결정하는지 알고 있다.
유전자의 발현을 증가시키기 위해, 이는 염색체로 또는 염색체외로 코딩될 수 있다. 유전자의 복사본은 염색체로 또는 염색체외로 첨가될 수 있다. 염색체로 게놈 상에 당업자에게 공지된 재조합의 방법에 의해 도입될 수 있는 하나 또는 여러 추가의 복사본이 있을 수 있다. 염색체외로 유전자는 플라스미드 또는 세균 인조 염색체(Bacterial Artificial Chromosome)의 그들의 복제 개시점에 대해, 그리고 따라서 그들의 세포에서의 복사본 수에 대해 상이한 여러 유형에 의해 운반될 수 있다. 이들은 엄격한 복제를 갖는 낮은 복사본 수 플라스미드 (예를 들면, pSC101, RK2), 낮은 복사본 수 플라스미드 (예를 들면, pACYC, pRSF1010) 또는 높은 복사본 수 플라스미드 (예를 들면, pSK bluescript II)에 상응하는 1-5개 복사본, 약 20개 또는 500개 이하의 복사본으로 존재할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, sdh 유전자는 추가염색체 발현을 사용하여 과다발현될 수 있다. 본 발명의 이 실시양태에서, sdh 유전자는 세균 인조 염색체에 의해 운반된다.
효소의 발현은 상응하는 전령 RNA (문헌 [Carrier and Keasling, 1998, Biotechnol. Prog. 15, 58]) 또는 단백질 (예를 들면, GST tags, Amersham Biosciences)을 안정화시키거나 또는 불안정화시키는 요소에 의해 증가되거나 또는 감소될 수 있다.
본 발명에 따른 미생물은 본 발명에 따라 증대되는 유전자의 하나 또는 여러 대립유전자를 함유한다. 바람직하게는 본 발명에 따른 미생물은 숙시네이트 데히드로게나제 효소를 코딩하는 유전자의 하나의 보조 복사본을 운반한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 이들 유전자는 세균 인조 염색체 pCC1BAC에서 클로닝된다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 미생물은 이. 콜라이의 4개 유전자 sdhA, sdhB, sdhC 및 sdhD의 하나의 보조 복사본을 함유한다. 상기 보조 복사본에서의 유전자는 오페론으로 구조화될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 미생물은 이. 콜라이의 숙시네이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 추가의 복사본을 포함한다.
본 발명의 설명에서, 유전자 및 단백질은 이. 콜라이에서의 상응하는 유전자의 명칭(denomination)을 사용하여 확인된다. 그러나, 그리고 달리 명시되지 않는 한, 이들 명칭의 사용은 본 발명에 따른 더 일반적인 의미를 가지며, 다른 유기체, 더욱 특히 미생물에서의 모든 상응하는 유전자 및 단백질을 포함한다.
PFAM (protein families database of alignments and hidden Markov models; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) 단백질 서열 정렬의 큰 수집을 나타낸다. 각각의 PFAM은 다중 정렬을 시각화하는 것을 가능하게 하며, 단백질 도메인, 유기체 사이에서의 분포 평가, 다른 데이터베이스에 대한 접근, 및 공지된 단백질 구조의 시각화를 참조한다.
COG (단백질의 이종상동성 군의 군집; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/는 30개 주요 계통발생학적 계통을 나타내는 66개 완전히 서열분석된 게놈으로부터의 단백질 서열을 비교함으로써 수득되었다. 각각 COG는 이전에 보존된 도메인의 식별을 가능하게 하는 3개 이상의 계통으로부터 정의된다.
동종 서열 및 그들의 백분율 동종성을 식별하는 수단은 당업자에게 공지되어 있고, 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/로부터 사용할 수 있는 특히 BLAST 프로그램을 포함하며, 그 웹사이트 상에 디폴트 파라미터가 나타난다. 수득된 서열은 이어서 예를 들면, 프로그램 CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) 또는 MULTALIN (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)을 사용하여 활용 (예를 들면, 정렬함)될 수 있고, 이들 웹사이트 상에 디폴트 파라미터가 나타난다.
공지된 유전자에 대한 젠뱅크(GenBank) 상에 제공된 참조를 사용하여, 당업자는 다른 유기체, 세균 균주, 효모, 곰팡이, 포유동물, 식물 등에서의 등가 유전자를 결정할 수 있다. 이 일상적인 일은 다른 미생물로부터 유도된 유전자로 서열 정렬을 수행하고, 또다른 유기체에서 상응하는 유전자를 클로닝하기 위해 유추 프로브를 설계함으로써 결정될 수 있는 공통 서열을 사용하여 유리하게 수행된다. 분자 생물학의 이들 일상적인 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌 [Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.)]에 개시되어 있다.
본 발명에 따른 변형된 미생물은 메티오닌 생산을 증대시키기 위해 다른 변형을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 sdh 효소를 코딩하는 유전자(들)의 증대된 발현에 추가로, 메티오닌 생산을 증대시키기 위한 추가의 변형을 포함한다. 메티오닌 생산을 증가시키기 위한 변형은 당업계에 공지되어 있다. 이들 변형은 예를 들면, WO2009/043803, WO2007/077041, WO2005/111202에 기재되어 있으며, 본원에 참조로 포함된다. 메티오닌 제조를 개선시키기 위해, 미생물은 하기의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 증가된 발현을 나타낼 수 있다:
● WO2009/043803에 기재된 바와 같은 원형질막주위 술페이트 결합 단백질을 코딩하는 cysP,
● WO2009/043803에 기재된 바와 같은 술페이트 ABC 수송체의 성분을 코딩하는 cysU,
● WO2009/043803에 기재된 바와 같은 막 결합 술페이트 수송 단백질을 코딩하는 cysW,
● WO2009/043803에 기재된 바와 같은 술페이트 퍼메아제(permease)를 코딩하는 cysA,
● WO2009/043803에 기재된 바와 같은 O-아세틸 세린 술프히드라라제를 코딩하는 cysM,
● cysI 및 cysJ는 각각 WO2009/043803에 기재된 바와 같은 술피트 리덕타제의 알파 및 베타 서브유닛을 코딩하였다. 바람직하게는 cysI 및 cysJ는 함께 과다발현됨,
● WO2009/043803에 기재된 바와 같은 술피트 리덕타제, 알파 서브유닛을 코딩하는 cysI,
● WO2009/043803에 기재된 바와 같은 아데닐릴술페이트 리덕타제를 코딩하는 cysH,
● WO2007/077041에 기재된 바와 같은 세린 아실트랜스퍼라제를 코딩하는 cysE,
● WO2009/043803에 기재된 바와 같은 테트라히드로폴레이트 의존성 아미노메틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 gcvT,
● WO2009/043803에 기재된 바와 같은 아미노에틸기의 담체를 코딩함으로써 글리신 절단에 관여하는 gcvH,
● WO2009/043803에 기재된 바와 같은 글리신 데히드로게나제를 코딩하는 gcvP,
● WO2009/043803에 기재된 바와 같은 리포아미드 데히드로게나제를 코딩하는 lpd,
● WO2009/043803에 기재된 바와 같은 포스포글리세레이트 데히드로게나제를 코딩하는 serA,
● WO2009/043803에 기재된 바와 같은 포스포세린 포스파타제를 코딩하는 serB,
● WO2009/043803에 기재된 바와 같은 포스포세린 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 serC,
● WO2009/043803에 기재된 바와 같은 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 glyA,
● WO2007/077041에 기재된 바와 같은 5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제를 코딩하는 metF,
● WO2005/111202에 기재된 바와 같은, S-아데노실메티오닌 및/또는 메티오닌에 대해 감소된 피드백(feed-back) 민감도를 갖는 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제를 코딩하는 metA 대립유전자,
● WO2009/043803에 기재된 바와 같은, 트레오닌에 대해 감소된 피드백 억제를 갖는 아스파르토키나제/호모세린 데히드로게나제를 코딩하는 thrA 또는 thrA 대립유전자
● WO2007/077041에 기재된 바와 같은, B12-의존성 호모시스테인-N5-메틸테트라히드로폴레이트 트랜스메틸라제를 코딩하는 metH.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 미생물은 다음 유전자 중 하나 이상의 발현의 억제를 나타낼 수 있다:
● WO2009/043803에 기재된 바와 같은 피루베이트 키나제를 코딩하는 pykA,
● WO2009/043803에 기재된 바와 같은 피루베이트 키나제를 코딩하는 pykF,
● WO2009/043803에 기재된 바와 같은 포르밀테트라히드로폴레이트 데포르밀라제를 코딩하는 purU,
● JP 2000/157267에 기재된 바와 같은 메티오닌 억제자를 코딩하는 metJ.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 변형된 피드백 억제 특성을 갖는 효소를 코딩하는 다음 변형된 유전자가 사용될 수 있다:
● WO2005108561에 기재된 바와 같은 메티오닌 및 S-아데노실메티오닌에 대해 감소된 피드백 민감도를 갖는 효소를 코딩하는 metA 돌연변이체
● WO2005108561에 기재된 바와 같은 트레오닌에 대해 감소된 피드백 민감도를 갖는 thrA 돌연변이체.
본 발명에 따른 미생물은 메티오닌 제조를 증가시키기 위해 본원에 참조로 포함된 WO2004/076659에 기재된 바와 같은 O-숙시닐-호모세린으로부터의 호모시스테인의 생산을 위해 바람직하게는 또는 배타적으로 H2S를 사용하는 변경된 metB 대립유전자를 사용함으로써 추가로 변형될 수 있다.
메티오닌 생산에 관련된 상기 개시된 모든 특허 및 특허 출원은 본원에 참조로 포함된다.
용어 감쇠된 발현, 억제된 발현 또는 감쇠, 억제는 본문에 대체가능하게 사용되었으며, 유사한 의미를 갖는다. 이 맥락에서, 용어는 유전자의 발현의 부분적인 억제 또는 완전한 억제를 나타내며, 이를 이어서 "감쇠된"이라고 한다. 이 발현의 억제는 유전자의 발현의 억제, 유전자 발현을 위해 필요한 프로모터 영역의 모두 또는 부분의 결실, 유전자의 코딩 영역의 결실, 또는 더 약한 천연 또는 합성 프로모터에 의한 야생형 프로모터의 교환 중 하나일 수 있다. 바람직하게는, 유전자의 감쇠는 균주의 식별, 단리 및 정제를 촉진하는 선택 마커 유전자에 의해 대체될 수 있는 그 유전자의 본질적으로 완전한 결실이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 변형된 미생물은 cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysI, cysH, cysE, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, glyA, metF, metA (감소된 피드백 민감도를 가짐), thrA 및 metH로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 과다발현한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 변형된 미생물은 pykA, pykF, metJ 및 purU로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 감쇠된 발현을 갖는다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 변형된 미생물은 cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysI, cysH, cysE, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, glyA, metF, metA (감소된 피드백 민감도를 가짐), thrA (바람직하게는 감소된 피드백 민감도를 가짐) 및 metH로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 과다발현하고, pykA, pykF, metJ 및 purU로 이루어진 군으루부터 선택된 하나 이상의 유전자를 억제한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 미생물은 유전자 cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysI, cysH, cysE gcvT, gcvH, gcvP, metF, metA (감소된 피드백 민감도를 가짐), thrA (바람직하게는 감소된 피드백 민감도를 가짐) 및 metH., serA, serB, serC, glyA를 과다발현하고, 유전자 pykA, pykF, metJ 및 purU를 억제한다.
당업자는 다른 유전자는 메티오닌 생산을 최적화하기 위해 변형을 요구할 것이라는 것을 알게 될 것이다. 이들 유전자는 특히 WO2007/077041 및 WO2007/020295에서 확인되었고, 이들은 본원에 참조로 포함된다.
배양 배지
본 발명의 방법에서 변형된 미생물은 탄소의 공급원 및 황의 공급원을 포함하는 적절한 배양 배지에서 배양된다. '적절한 배양 배지'는 미생물의 배양 및 성장을 위해 적절한 배지이다. 상기 배지는 배양되는 미생물에 따라, 미생물 발효의 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명에 따른 용어 '탄소 공급원'은 당업자에 의해 사용될 수 있는 마이크로-유기체의 정상적인 성장을 지지하기 위한 임의의 탄소의 공급원을 나타내고, 이는 헥소스 (예를 들면, 글루코스, 갈락토스 또는 락토스), 펜토스, 모노사카리드, 디사카리드, 올리고사카리드 (예를 들면, 수크로스, 셀로비오스 또는 말토스), 몰라세, 전분 또는 그의 유도체, 헤미셀룰로스, 글리세롤 및 이들의 조합일 수 있다. 특히 바람직한 단순 탄소 공급원은 글루코스이다. 또다른 바람직한 단순 탄소 공급원은 수크로스이다.
L-메티오닌의 발효 생산을 위해 사용된 황 공급원은 술페이트, 티오술페이트, 수소 술피드, 디티오네이트, 디티오나이트, 술피트, 메틸메르캅탄, 디메틸디술피드 또는 이들의 조합 중의 임의의 공급원일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 황 공급원은 술페이트 및/또는 티오술페이트이다.
질소 공급원은 암모늄 염 또는 암모니아 가스일 수 있다.
개선된 메티오닌의 제조
본 발명에서, 메티오닌/탄소 공급원 수율은 숙시네이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 발현을 증대시킴으로써 증가된다. 용어 "메티오닌/ 탄소 공급원 수율"은 발효 중 수득된 메티오닌의 양을 소비된 탄소 공급원의 양으로 나눈 것으로 정의된다. 이는 퍼센트 g 메티오닌/ g 탄소 공급원 또는 mol 메티오닌/ mol 탄소 공급원으로 표현될 수 있다. 이 맥락에서 용어 "증대된"은 명시된 변형을 갖지 않는 미생물 및/또는 변형을 갖지 않는 배양 배지에 비교하여 측정가능한 증가를 기재한다. 바람직한 실시양태에서, 증가는 적어도 1 % g/g, 바람직하게는 적어도 2 % g/g이다. 더 바람직하게는 4 %이다.
이 증가를 측정하기 위해 소비된 글루코스 및 생산된 메티오닌의 양이 결정되어야 한다. 소비된 탄소 공급원의 양은 굴절 HPLC에 의해 또는 유가-배치 용액에 대한 브릭스(Brix)의 방법에 따라 성장 배지의 글루코스 농도를 결정함으로써 계산된다. 배치 배양을 위해 소비된 글루코스는 실험 초기의 잔류 글루코스의 양에 상응하며, 이로부터 실험 마지막의 잔류 글루코스의 양을 뺀다. 유가 배치 발효를 위해 소비된 글루코스의 양은 배치 배양에서의 글루코스의 합, 접종물에서의 첨가된 글루코스 및 실험 마지막의 잔류 글루코스의 양을 뺀 유가 배치 기 중에 주사된 글루코스의 양에 상응한다.
용어 "수득된 메티오닌"은 L-메티오닌 및 쉽게 회수가능한 메티오닌 유도체 NAM을 포함한다. 배지에서 수득된 메티오닌의 양은 L-메티오닌 (Fluka, Ref 64319)을 기준으로 사용한 OPA/Fmoc 유도체화 후 HPLC에 의해 측정된다. NAM의 양은 NAM (Sigma, Ref 01310)을 기준으로 사용한 굴절 HPLC를 사용하여 측정된다.
메티오닌 회수
발효 후 L-메티오닌, 이로부터 유도된 그의 전구체 또는 화합물, 예를 들면 N-아세틸-메티오닌은 회수되고, 결국 정제된다. 생산된 화합물을 회수하고 정제하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. (WO 2005/007862, WO 2005/059155).
실시예
실시예 1:
Figure 112012060113356-pct00001
메티오닌 생산 균주는 WO2009043803, WO2007/077041 및 PCT/FR2009/052520에 기재되었으며, 이들은 참조로 포함된다.
1. 벡터 pCC1BAC-sdhCDAB-TT02-serB-glyA-serA-serC의 구축
메티오닌 생산 균주에서 숙시네이트 데히드로게나제, SdhCDAB의 수준을 증가시키기 위해, 4개 유전자 sdhCDAB를 그들의 자체 프로모터로 WO2009043803에 이전에 기재된 복사본 대조군 벡터 pCC1BAC-serB-glyA-serA-serC에서 클로닝하였다 (pCC1BAC 벡터는 에피센터(Epicentre)로부터의 벡터임).
이 목적을 위해, sdhCDAB-TT02 영역을 올리고뉴클레오티드 sdhCDAB-F 및 sdhCDAB-TT02-R (웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)을 사용하여 MG1655 이. 콜라이 게놈으로부터 증폭시켰고, 여기서 TT02는 이. 콜라이의 rrnB 유전자의 T1 전사 종결자이다 (문헌 [Orosz et al., 1991, Eur. J. Biochem. 201, 653]). 생성된 PCR 생성물을 pSCB 벡터 (Stratagene)에서 클로닝하고, 서열분석에 의해 확인하였고, 벡터를 pSCB-sdhCDAB-TT02로 명명하였다.
- 추가-염기를 갖는 영역 (소문자),
- SphI 및 SfoI 부위를 포함하는 영역 (밑줄친 대문자),
- sdhCDAB 영역 (753931 내지 753958)에 상동성인 영역 (굵은 대문자)
을 갖는
Figure 112012060113356-pct00002
- 추가-염기를 갖는 영역 (소문자),
- SphI 부위를 포함하는 영역 (밑줄친 대문자),
- 이. 콜라이의 rrnB 유전자의 T1 전사 종결자 서열에 상응하는 TT02 서열에 대한 영역 (이탤릭체 대문자),
- sdhCDAB 영역 (757603 내지 757629)에 상동성인 영역 (굵은 대문자)
을 갖는
Figure 112012060113356-pct00003
.
유전자 sdhCDAB-TT02를 벡터 pCC1BAC에 전달하기 위해, 벡터 pSCB-sdhCDAB-TT02를 효소 SphI로 제한하고, sdhCDAB-TT02 영역을 동일한 효소에 의해 제한된 벡터 pCC1BAC-serB-glyA-serA-serC에 클로닝하였다. 생성된 벡터를 pCC1BAC-sdhCDAB-TT02-serB-glyA-serA-serC로 명명하였다.
2. 균주
Figure 112012060113356-pct00004
의 구축
이어서, 플라스미드 pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 (WO2007/077041 및 PCT/FR2009/052520에 이전에 기재됨) 및 pCC1BAC-sdhCDAB-TT02-serB-glyA-serA-serC를 전기천공에 의해 균주
Figure 112012060113356-pct00005
에 도입하여 균주
Figure 112012060113356-pct00006
를 수득하였다.
3. 균주
Figure 112012060113356-pct00007
의 구축
플라스미드 pME101-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 (이전에 WO2007/077041 및 PCT/FR2009/052520에 기재됨) 및 pCC1BAC-serB-glyA-serA-serC (이전에 WO2009043803에 기재됨)를 전기천공에 의해 균주
Figure 112012060113356-pct00008
에 도입하여 균주
Figure 112012060113356-pct00009
를 수득하였다.
실시예 2. 균주의 평가
균주 1:
Figure 112012060113356-pct00010
균주 2:
Figure 112012060113356-pct00011
생산 균주를 작은 삼각 플라스크에서 평가하였다. 5.5 mL 예비배양물을 37℃에서 16시간 동안 혼합 배지 (2.5 g.L-1 글루코스 함유 10% LB 배지 (Sigma 25%) 및 90% 최소 배지 PC1)에서 성장시켰다. 이는 50 mL 배양물을 배지 PC1에 0.2의 OD600으로 접종시키기 위해 사용되었다. 필요한 경우 50 mg.L-1의 최종 농도로 스펙티노마이신 및 카나마이신을 첨가하고, 30 mg.L-1로 클로람페니콜을 첨가하였다. 배양물의 온도는 37℃이었다. 배양물이 5 내지 7의 OD600에 도달한 경우, 세포외 아미노산을 OPA/Fmoc 유도체화 후 HPLC에 의해 정량화하고, 다른 관련된 대사물을 실릴화 후 굴절 검출 (유기산 및 글루코스)을 갖는 HPLC 및 GC-MS를 사용하여 분석하였다. 각각 균주에 대해, 3회 반복하였다.
Figure 112012060113356-pct00012
표 1: 상이한 균주에 의해 배치 배양물에서 생산한 메티오닌 수율 (Ymet)의 % g 메티오닌 /g 데 글루코스. 메티오닌/글루코스 수율의 정확한 정의를 위해 하기를 참조한다. SD는 3회 반복을 기반으로 계산된 수율에 대한 표준 편차를 나타낸다.
Figure 112012060113356-pct00013
세포외 메티오닌 농도를 OPA/FMOC 유도체화 후 HPLC에 의해 정량화하였다. 잔류 글루코스 농도를 굴절 검출을 갖는 HPLC를 사용하여 분석하였다. 메티오닌 수율을 다음과 같이 나타냈다:
Figure 112012060113356-pct00014
표 1에 나타낸 바와 같이, 메티오닌/글루코스 수율 (Ymet)은 sdhCDAB의 과다발현 후 증가하였다.
참조 문헌:
Figure 112012060113356-pct00015
SEQUENCE LISTING <110> METABOLIC EXPLORER FIGGE, Rainer <120> INCREASING METHIONINE PRODUCTION BY OVEREXPRESSING SUCCINATE DEHYDROGENASE <130> D28308 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide sdhCDAB-F <400> 1 atgcgtgcat gcatctggcg ccgaattggt caatacttcc acactgttac 50 <210> 2 <211> 95 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide sdhCDAB-TT02-R <400> 2 aagcgctgca tgcaacagat aaaacgaaag gcccagtctt tcgactgagc ctttcgtttt 60 atttgatgtt tacgcattac gttgcaacaa catcg 95

Claims (19)

  1. - 탄소의 공급원 및 황의 공급원을 포함하는 배양 배지에서 메티오닌 생합성 경로에 관여하는 유전자의 발현이 증대된 장내세균(Enterobacteriaceae) 미생물을 배양하는 단계, 및
    - 배양 배지로부터 메티오닌을 회수하는 단계
    를 포함하고, 상기 미생물은 숙시네이트 데히드로게나제 효소를 코딩하는 유전자(들)의 발현을 증대시킴으로써 추가로 변형되고,
    상기 미생물에서 숙시네이트 데히드로게나제 효소의 상이한 서브유닛을 코딩하는 모든 유전자는 과다발현되는 것인, 발효 공정에서의 메티오닌의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 숙시네이트 데히드로게나제 효소가, 각 서브유닛이 1개 유전자에 의해 코딩되고 각각의 발현이 증대된 3개 이상의 서브유닛을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 숙시네이트 데히드로게나제 효소를 코딩하는 유전자(들)의 증대된 발현이 미생물에 상기 유전자(들) 중 하나 이상의 보조 복사본을 삽입함으로써 달성되는 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, sdh 유전자의 증대된 발현이 미생물에 이. 콜라이(E.coli)의 4개 유전자 sdhA, sdhB, sdhC 및 sdhD 중 하나 이상의 보조 복사본을 삽입함으로써 달성되는 것인 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 배양 배지의 황 공급원이 술페이트, 티오술페이트, 수소 술피드, 디티오네이트, 디티오나이트, 술피트 또는 이들 여러 공급원의 조합인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 탄소 공급원이 글루코스 또는 수크로스인 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 배양 배지로부터의 메티오닌의 단리 단계를 포함하는 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 미생물이 이. 콜라이(E. coli)인 방법.
  9. 배양 배지에서의 메티오닌 생합성 경로에 관여하는 유전자의 발현이 증대되고, 숙시네이트 데히드로게나제 효소를 코딩하는 유전자(들)의 발현을 증대시킴으로써 추가로 변형된 장내세균(Enterobacteriaceae) 미생물이며, 이때 상기 미생물에서 숙시네이트 데히드로게나제 효소의 상이한 서브유닛을 코딩하는 모든 유전자는 과다발현되는 것인 장내세균 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 숙시네이트 데히드로게나제가, 각 서브유닛이 1개 유전자에 의해 코딩되고 각각의 발현이 증대된 3개 이상의 서브유닛을 포함하는 것인 미생물.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 숙시네이트 데히드로게나제 효소를 코딩하는 유전자(들)의 증대된 발현이 미생물에 상기 유전자(들) 중 하나 이상의 보조 복사본을 삽입함으로써 달성되는 것인 미생물.
  12. 제11항에 있어서, sdh 유전자의 증대된 발현이 미생물에 이. 콜라이의 4개 유전자 sdhA, sdhB, sdhC 및 sdhD 중 하나 이상의 보조 복사본을 삽입함으로써 달성되는 것인 미생물.
  13. 제12항에 있어서, 이. 콜라이로부터의 sdh 오페론의 추가의 복사본을 포함하는 미생물.
  14. 제9항에 있어서, 이. 콜라이(E. coli)인 미생물.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 배양 배지의 황 공급원이 술페이트 및 티오술페이트이고, 탄소 공급원이 글루코스인 방법.
  16. 제4항에 있어서, 미생물이 SAM 및/또는 메티오닌에 대해 감소된 피드백(feed-back) 민감도를 갖는 호모세린 숙시닐트랜스퍼라제를 코딩하는 metA 대립유전자를 과다발현함으로써 추가로 변형되는 것인 방법.
  17. 제4항에 있어서, 미생물이 유전자 cysP, cysU, cysA, cysM, cysI, cysJ, cysH, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, glyA, metF, thrA 및 metH 중 하나 이상의 유전자를 과다발현함으로써 추가로 변형되는 것인 방법.
  18. 제4항에 있어서, 미생물이 유전자 pykA, pykF, purU, metJ 중 하나 이상의 유전자의 발현을 억제함으로써 추가로 변형되는 것인 방법.
  19. 삭제
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