JP2013516167A - コハク酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させることによるメチオニンの増産 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、コハク酸デヒドロゲナーゼ合成に関与する遺伝子の発現を増強するために改変された微生物を培養することによりメチオニン生産を向上させる方法に関する。この微生物はメチオニン/炭素源収率が高まるように改変されたものである。また、本発明は、その発酵培地からのメチオニンの単離にも関する。
コハク酸デヒドロゲナーゼ(コハク酸オキシドレダクターゼ、SQR)は、クレブス回路と好気的呼吸鎖の双方の機能的メンバーである。SQRは、細菌の膜におけるユビキノンの還元と並行して、細胞質でのコハク酸からフマル酸への酸化を触媒する。大腸菌およびその他の細菌では、この酵素は4つのサブユニットからなる。2つの疎水性サブユニットSdhCおよびSdhDは、親水性の触媒サブユニットSdhAおよびSdhBを内膜の表面に係留する。コハク酸からフマル酸への酸化には、5つのユニークな補因子が関与する。SdhAでは、共有結合されているフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)分子がヒドリド伝達機構によってコハク酸酸化を触媒するために供される。次に、サブユニット(SdhB)を介して電子が個々に伝達される。SdhC、SdhDおよびSdhB由来の残基によりキノン結合部位が形成され、ユビキノンからユビキノールへの還元を可能とする。この酵素は、SdhCとSdhDの間に挟まれた、酵素機能には必須でないヘムb分子も含む(Yankovskaya et al. 2003, Science 299, 700; Cheng et al. 2008 Biochemistry 47, 6107)。
本発明は、改変微生物を培養することによる発酵工程においてメチオニンを生産する方法に関する。本発明によれば、「培養」、「発酵」、または「発酵工程」は、単純炭素源を含有する適当な増殖培地での細菌の増殖を表して互換的に用いられる。この単純炭素源はメチオニン生産用の微生物によって代謝される。
・WO2009/043803に記載されているような、硫酸塩ABC輸送体の成分をコードするcysU
・WO2009/043803に記載されているような、膜結合硫酸塩輸送タンパク質をコードするcysW
・WO2009/043803に記載されているような、硫酸透過酵素をコードするcysA
・WO2009/043803に記載されているような、O−アセチルセリンスルフヒドララーゼをコードするcysM
・WO2009/043803に記載されているような、亜硫酸レダクターゼのそれぞれαサブユニットおよびβサブユニットをコードするcysIおよびcysJ(好ましくは、cysIとcysJは一緒に過剰発現されるのが好ましい)
・WO2009/043803に記載されているような、亜硫酸レダクターゼαサブユニットをコードするcysI
・WO2009/043803に記載されているような、アデニリル硫酸レダクターゼをコードするcysH
・WO2007/077041に記載されているような、セリンアシルトランスフェラーゼをコードするcysE
・WO2009/043803に記載されているような、テトラヒドロ葉酸依存性アミノメチルトランスフェラーゼをコードするgcvT
・WO2009/043803に記載されているような、アミノエチル基の担体をコードすることによりグリシン切断に関与するgcvH
・WO2009/043803に記載されているような、グリシンデヒドロゲナーゼをコードするgcvP
・WO2009/043803に記載されているような、リポアミドデヒドロゲナーゼをコードするlpd
・特許出願WO2009/043803に記載されているような、ホスホグリセル酸デヒドロゲナーゼをコードするserA
・特許出願WO2009/043803に記載されているような、ホスホセリンホスファターゼをコードするserB
・特許出願WO2009/043803に記載されているような、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードするserC
・WO2009/043803に記載されているような、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードするglyA
・WO2007/077041に記載されているような、5,10−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードするmetF
・WO2005/111202に記載されているような、S−アデノシルメチオニンおよび/またはメチオニン(mathyonine)に対するフィードバック感受性が低減されたホモセリンスクシニルトランスフェラーゼをコードするmetA対立遺伝子
・WO2009/043803に記載されているような、トレオニンに対するフィードバック阻害が低減されたアスパルトキナーゼ/ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするthrAまたはthrA対立遺伝子
・WO2007/077041に記載されているような、B12依存性ホモシステイン−N5−メチルテトラヒドロ葉酸トランスメチラーゼをコードするmetH
本発明の別の実施形態では、微生物は下記遺伝子の少なくとも一つの発現の阻害を示し得る。
・WO2009/043803に記載されているような、ピルビン酸キナーゼをコードするpykA
・WO2009/043803に記載されているような、ピルビン酸キナーゼをコードするpykF
・WO2009/043803に記載されているような、ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼをコードするpurU
・JP2000/157267に記載されているような、メチオニンレプレッサーをコードするmetJ
・WO2005108561に記載されているような、トレオニンに対するフィードバック感受性が低減されたthrA突然変異体
本発明の方法において、改変微生物は炭素源と硫黄源を含んでなる適当な培養培地で培養される。「適当な培養培地」とは、微生物の培養および増殖に適当な培地である。このような培地は、培養する微生物にもよるが微生物発酵の分野の熟練者にはよく知られている。
窒素源はアンモニウム塩またはアンモニアガスである。
本発明では、メチオニン/炭素源収率は、コハク酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現を増強することによって増大される。「メチオニン/炭素源収率」との用語は、発酵中に得られたメチオニンの量を消費された炭素源の量で割ったものと定義する。これはメチオニン(g)/炭素源(g)またはメチオニン(mol)/炭素源(mol)のパーセントで表すことができる。明細書において「増強された」との用語は、その特定の改変のない微生物および/またはその改変のない培養培地に比べての、測定可能な増加を表す。好ましい実施形態において、増強は少なくとも1%g/g、好ましくは少なくとも2%g/g、より好ましくは4%である。
発酵後のL−メチオニン、その前駆体またはそれに由来する化合物(例えばN−アセチル−メチオニン)は回収されて、最終的に精製される。生産された化合物を回収および精製する方法は当業者によく知られている(WO2005/007862、WO2005/059155)。
メチオニン生産株は、特許出願WO2009043803、WO2007/077041およびPCT/FR2009/052520に記載され、これらの文献は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
コハク酸デヒドロゲナーゼのレベルを高めるために、メチオニン生産株SdhCDABにおいて、コピーコントロールベクターpCC1BAC−serB−glyA−serA−serC(従前に特許出願WO2009043803に記載されているEpicentre製のpCC1BACベクターを使用)におけるそれらの固有のプロモーターとともにクローニングされた4つの遺伝子dhCDAB。
sdhCDAB−F
・余分な塩基を含む領域(小文字)
・SphIおよびSfoI部位を担持する領域(下線の大文字)
・sdhCDAB領域(753931〜753958)と相同な領域(太字の大文字)
sdhCDAB−TT02−R
・余分な塩基を含む領域(小文字)
・SphI部位を担持する領域(下線の大文字)
・大腸菌rrnB遺伝子のT1転写ターミネーター配列に相当するTT02配列の領域(斜体の大文字)
・sdhCDAB領域(757603〜757629)と相同な領域(太字の大文字)
ベクターpCC1BACに遺伝子sdhCDAB−TT02を導入するために、ベクターpSCB−sdhCDAB−TT02を制限酵素SphIで処理し、sdhCDAB−TT02領域を、同じ制限酵素で処理したベクターpCC1BAC−serB−glyA−serA−serCにクローニングした。得られたベクターをpCC1BAC−sdhCDAB−TT02−serB−glyA−serA−serCと名付けた。
次に、プラスミドpME101−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11(従前に特許出願WO2007/077041およびPCT/FR2009/052520に記載されている)およびpCC1BAC−sdhCOAB−TT02−serB−glyA−serA−serCを、エレクトロポレーションによりMG1655 met A*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP Ptrc36−ARNmst17−metF ΔmetJ ΔpykF DpykA ΔpurU株に導入し、MG1655 metA*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP Ptrc36−ARmst17−metF ΔmetJ ΔpykF DpykA ApurU(pME101−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11)(pCC1BAC−sdhCDAB−TT02−serB−glyA−serA−serC)株を得た。
プラスミドpME101−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11(従前に特許出願WO2007/077041およびPCT/FR2009/052520に記載されている)およびpCC1BAC−serB−glyA−serA−serC(従前に特許出願WO2009043803に記載されている)を、エレクトロポレーションによりMG1655 met A*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP Ptrc36−ARNmst17−metF ΔmetJ ΔpykF DpykA ΔpurUに導入し、MG1655 met A*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP Ptrc36−ARNmst17−metF ΔmetJ ΔpykF DpykA ΔpurU(pME101−tzrA*1−cysE−PgaA−metA*11)(pCC1BAC−serB−glyA−serA−serC)株を得た。
株1: MG1655 metA*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP Ptrc36−AR mst17−metF DmetJ DpykF DpykA DpurU(pME101−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11)(pCC1BAC−sdhCDAB−TT02−serB−TT07−glyA−serA−serC)
株2: MG1655 metA*11 Ptrc−metH PtrcF−cysPUWAM PtrcF−cysJIH Ptrc09−gcvTHP Ptrc36−AR mst17−metF DmetJ DpykF DpykA DpurU(pME101−thrA*1−cysE−PgapA−metA*11)(pCC1BAC−serB−glyA−serA−serC)
Claims (15)
- メチオニン生産の向上のために改変された微生物を、炭素源と硫黄源とを含んでなる適当な培養培地で培養する工程、および
該培養培地からメチオニンを回収する工程
を含んでなる発酵工程においてメチオニンを生産する方法であって、
該微生物がコハク酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子の発現を増強することによりさらに改変されたものである、方法。 - コハク酸デヒドロゲナーゼ酵素が少なくとも三つのサブユニットを含んでなり、各サブユニットが一遺伝子によりコードされ、各発現が増強される、請求項1に記載の方法。
- コハク酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子の増強された発現が、微生物に該遺伝子の少なくとも一つの補足的コピーを挿入することにより獲得された、請求項1または2に記載の方法。
- sdh遺伝子の増強された発現が、微生物に大腸菌の4つの遺伝子sdhA、sdhB、sdhC、およびsdhDの少なくとも一つの補足的コピーを挿入することにより獲得された、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 培養培地中の硫黄源が、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫化水素、ジチオン酸塩、亜ジチオン酸塩、亜硫酸塩、またはそれらの種々の供給源の組合せである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 炭素源がグルコースまたはスクロースである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 培養培地からメチオニンを単離する工程を含んでなる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 微生物が細菌、酵母、および真菌からなる群から選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 適当な培養培地でのメチオニン生産の向上のために改変された微生物であって、コハク酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子の発現を増強することによりさらに改変された微生物。
- コハク酸デヒドロゲナーゼが少なくとも三つのサブユニットを含んでなり、各サブユニットが一遺伝子によりコードされ、各発現が増強された、請求項9に記載の微生物。
- コハク酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子の増強された発現が、微生物に該遺伝子の少なくとも一つの補足的コピーを挿入することにより獲得された、請求項9または10に記載の微生物。
- sdh遺伝子の増強された発現が、微生物に大腸菌の4つの遺伝子sdhA、sdhB、sdhC、およびsdhDの少なくとも一つの補足的コピーを挿入することにより獲得された、請求項11に記載の微生物。
- 大腸菌由来sdhオペロンの付加的コピーを含んでなる、請求項12に記載の微生物。
- 腸内細菌科およびコリネフォーム細菌からなる群から選択される細菌である、請求項8〜13のいずれか一項に記載の微生物。
- 大腸菌およびC.glutamicumからなる群から選択される、請求項14に記載の微生物。
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