CN114026245A - 二醇的生物技术生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于立体选择性地生产反式二醇或顺式二醇或羟基酮的方法，包括以下步骤，通过一种酶催化，(i)将反式二醇或顺式二醇转化为羟基酮和/或(ii)将羟基酮转化为顺式二醇或反式二醇，该酶由SEQ ID NO：1的核酸序列编码，或其中该酶包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。本发明还涉及一种酶用于将反式二醇转化为顺式二醇或者将反式二醇或顺式二醇转化为羟基酮和/或将羟基酮转化为反式二醇或顺式二醇的用途，该酶由SEQ ID No：1的核酸序列编码或其中该酶包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

Description

二醇的生物技术生产
技术领域
本发明涉及一种用于立体选择性地生产反式二醇或顺式二醇或羟基酮的方法，包括以下步骤：(i)将反式二醇或顺式二醇转化为羟基酮；和/或(ii)将羟基酮，可选地为步骤(i)中获得的羟基酮，转化为顺式二醇或反式二醇，其中所述转化由一种酶催化，所述酶由SEQ ID NO：1的核酸序列编码，或者其中所述酶包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。特别地，本发明提供了一种用于将反式二醇转化为顺式二醇，优选地将反式雪松烯二醇转化为顺式雪松烯二醇的方法。本发明还涉及一种酶用于将反式二醇转化为顺式二醇或者将反式二醇或顺式二醇转化为羟基酮和/或将羟基酮转化为反式二醇或顺式二醇，优选地用于将反式雪松烯二醇转化为顺式雪松烯二醇的用途，所述酶由SEQ ID NO：1的核酸序列编码或其中所述酶包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
背景技术
雪松烯二醇是合成高品质香料的重要起始原料。例如，EP0857723A1描述了对映体纯木质龙涎香(Ambrocenide)的合成。
Figure BDA0003409525900000011
方案1：根据EP0857723合成雪松烯二醇
由于其作为丙酮化合物独特的香味特性，顺式-(8R，9S)-雪松烯二醇特别受关注。从α雪松烯开始，通过化学环氧化反应生产雪松烯环氧化物。随后，该环氧化物在酸催化下水解打开成反式和顺式雪松烯二醇的混合物。在该过程中，所期望的(8R，9S)-顺式雪松烯二醇仅少量获得并且必须费力地纯化。因此，所提出的化学合成非常困难，并且其仅在大量物理纯化后以低产率提供期望的产物。因此，有必要开发新的策略来合成所期望的(8S，9R)-顺式雪松烯二醇，其允许获得高纯度和高收率的产品。
作为用于生物技术合成所期望的(8R，9S)-顺式雪松烯二醇的底物，只有8R-雪松醇、α-雪松烯和(-)-α-雪松烯环氧化物是可在市场上购买到的。从α-雪松烯开始，到目前为止，仅已知化学顺式二羟基化，其需要使用剧毒物质，诸如四氧化锇。迄今为止，仅描述了用于芳香族体系的双加氧酶的酶促二羟基化(Faber，K.(1995)：Biotransformations inorganic chemistry(有机化学中的生物转化).Springer Verlag Berlin Heidelberg NewYork；Nolan，L.C.；O′Connor，K.E.(2008)：Dioxygenase-and monooxygenase-catalysedsynthesis of cis-dihydrodiols，catechols，epoxides and other oxygenatedproducts.Biotechnol.Lett.，30，1879-1891)。对于将环氧化物打开为顺式二醇，现有技术中没有描述合适的环氧化物水解酶。(8R)-雪松醇的9-羟基化总是会产生与所期望的(8R，9S)-顺式雪松烯二醇不同的差向异构体(8S，9R)。(8S)-雪松醇不能在市场上购买到。在现有技术中，描述了(8R)-雪松醇和α-雪松烯的不同微生物生物转化。Abraham等人描述了真菌对(8R)-雪松醇的9-羟基化，其产生了(8S，9S)-反式雪松烯二醇(Abraham，W.A.；Washausen，P.；Kieslich，K.(1987)：Microbial hydroxylation of cedro]andcedrene.Z.Naturforsch.，42c，414-419)。Collins等人描述了通过弯孢霉属的真菌合成不同的顺式雪松烯二醇。然而，该产品据称是(7，8)-顺式雪松烯二醇(Collins，D.O.；Reese，P.B.(2001)：Biotransformation of cedrol by curvularia lunata ATCC12017，Phytochemistry，56，417-421)。因此，现有技术没有提供用于生产期望的(8R，9S)-顺式雪松烯二醇的生物技术方法。
如果要使用雪松烯环氧化物作为合成底物，则在第一个反应中，必须通过环氧化物水解酶产生反式雪松烯二醇。
Figure BDA0003409525900000031
方案2：通过柠檬烯-1，2-环氧化物水解酶打开雪松烯环氧化物得到(8R，9R)-反式雪松烯二醇。
在本发明上下文的初步工作期间，可以鉴定来自红串红球菌DCL14的合适的环氧化物水解酶用于该环氧化物的水解开环。柠檬烯-1，2-环氧化物水解酶通过van der Werf纯化和表征，并对基因进行测序(Van der Werf，M.J.；Overkamp，K.M.；de Bont，J.A.M.(1998)：Limonen-1，1-epoxide from Rhodococcus erythropolis DCL14 belongs to anovel class of epoxide hydrolases.J.of Bac.，180(19)，5052-5057；Van der Werf，M.J.；Orru，R.V.A.；Overkamp，K.M.；Swarts，H.J.；Osprian，I.；Steinreiber，A.；de Bont，J.A.M.；Faber，K.(1999)：Substrate specifity and stereospecifity of limonene-1，2-epoxide hydrolase from Rhodococcus erythropolis DCL14；an enzyme showingsequential and enantioconvergent substrate conversion.Appl.Microbiol.Biotech.，52，380-385)。环氧化物水解酶专门将雪松烯环氧化物打开为所期望的(8R，9R)-反式雪松烯二醇。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于将反式二醇立体选择性转化为顺式二醇的方法，特别地用于将现有的(8R，9R)-反式雪松烯二醇转化为所期望的顺式-(8R，9S)雪松烯二醇。
本发明的另一个目的是鉴定能够有效催化如上所述的反式二醇向顺式二醇的转化并提供高纯度和高产率的期望产物的酶。
在本发明的上下文中，发现通过脱氢酶将二醇氧化成羟基酮和通过脱氢酶对所述羟基酮的立体选择性还原，平衡可转移以产生良好产率的期望产物。有利地，相同的脱氢酶可用于氧化和还原步骤两者。
因此，上述目的通过用于生产反式二醇或顺式二醇或羟基酮的方法来实现，所述方法包括以下步骤：
(i)通过一种酶催化将反式二醇或顺式二醇转化为羟基酮，所述酶由SEQ ID NO：1的核酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列编码，或者其中所述酶包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和/或
(ii)通过步骤(i)中所定义的酶催化将羟基酮，可选地为步骤(i)中获得的羟基酮，转化为顺式二醇或反式二醇。
在本发明的上下文中，反式二醇和顺式二醇是邻二醇，即二醇，其中两个羟基与两个相邻的碳原子相连。
本发明上下文中的序列同一性是相对于由SEQ ID NO.指定的序列的全长确定的。每当本公开涉及核酸或氨基酸序列彼此的同一性的百分比时，这些值定义通过使用用于氨基酸序列的EMBOSS水成对序列比对(核苷酸)程序(www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nuCleotide.html)核酸或EMBOSS水成对序列比对(蛋白质)程序(www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/)获得的那些值。本文所用的比对或序列比较是指在两个序列的整个长度上相互比较的比对。由欧洲分子生物学实验室(EMBL)欧洲生物信息学研究所(EBI)提供的用于局部序列比对的工具使用改进的史密斯-沃特曼算法(参见www.ebi.ac.uk/Tools/psa/and Smith，T.F.&Waterman，M.S.″Identification of commonmolecular subsequences″Journal of Molecular Biology，1981147(1)：195-197)。进行比对时，使用EMBL-EBI定义的默认参数。这些参数是(i)对于氨基酸序列：基质＝BLOSUM62，空位开放罚分＝10，空位扩展罚分＝0.5，或者(ii)对于核酸序列：基质＝DNA全，空位开放罚分＝10，空位扩展罚分＝0.5。技术人员非常清楚这样的事实，例如，如果与分子源自的原始生物体相比，相应的序列要用于另一生物体中，则编码蛋白质的序列可以是“密码子优化的”。
在一个优选的实施方案中，上述方法用于生产顺式二醇，包括以下步骤：
(i)通过一种酶催化将反式二醇转化为羟基酮，所述酶由SEQ ID NO：1的核酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列编码，或者其中所述酶包含SEQ ID No：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；以及
(ii)通过步骤(i)中所定义的酶催化将羟基酮，可选地为步骤(i)中获得的羟基酮，转化为顺式二醇。
步骤(i)和/或步骤(ii)中使用的酶是来自睾丸酮丛毛单胞菌的3-α-羟基类固醇脱氢酶或还原酶，其显示出令人惊讶的良好结果。3-α-羟基类固醇脱氢酶由根据SEQ IDNO.1的核酸序列编码。该酶的翻译的氨基酸序列由SEQ ID NO：2的序列表示。
优选地，在上述方法中，反式二醇和/或顺式二醇的两个羟基附接到包含2至4个桥环或非桥环的脂肪族环体系。在该上下文中，“附接到脂肪族环体系”是指羟基占据环体系中的环的两个相邻(邻位)位置。特别地，反式二醇和/或顺式二醇的两个羟基附接到类固醇化合物。
在一个优选的实施方案中，步骤(i)的反式二醇或顺式二醇通过环氧化物的开环反应获得。
在上述方法的一个优选实施方案中，反式二醇是(8R，9R)-反式雪松烯二醇，顺式二醇是(8R，9S)-顺式雪松烯二醇，并且羟基酮是雪松烯羟基酮。
在一个实施方案中，步骤(i)的(8R，9S)-顺式雪松烯二醇或(8R，9R)-反式雪松烯二醇通过雪松烯环氧化物的开环反应获得，优选地，所述开环反应由一种酶催化，所述酶由SEQ ID NO：3的核酸序列或与SEQ ID NO：3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列编码，或者其中所述酶包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
由SEQ ID NO：3的核酸序列编码或包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的酶对应于来自红串红球菌菌株DCL14的柠檬烯-1，2-环氧化物水解酶，其被发现是用于开环反应的合适的酶。
特别优选的是如上所述的用于生产(8R，9S)-顺式雪松烯二醇的方法，其中在步骤(i)中，(8R，9R)-反式雪松烯二醇转化为雪松烯羟基酮，并且在步骤(ii)中，雪松烯羟基酮转化为(8R，9S)-顺式雪松烯二醇。
Figure BDA0003409525900000061
方案3：(8R，9S)-顺式雪松烯二醇通过两个脱氢酶反应的转化
为了将平衡反应转移到产物侧以获得有效的转化，需要过量的底物或辅因子。脱氢酶通常需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)作为氧化还原反应的辅因子，其可以还原形式(NADH)或氧化形式(NAD)存在。另一个变体是磷酸化形式的NAD/NADH，即NADP/NADPH。辅因子如NAD和NADH价格昂贵，因此相对于底物不以化学计量的量使用。为了为所述酶提供足够的辅因子，从而将平衡转移到产物侧，通常使用再生系统(酶偶联辅因子再生)。NADH/NADPH最常见的再生系统之一是使用葡萄糖脱氢酶，如方案4所示。
Figure BDA0003409525900000062
方案4：用葡萄糖脱氢酶通过NADH再生立体选择性还原雪松烯羟基酮
这种酶不可逆地将葡萄糖氧化为葡萄糖酸酯，消耗NAD并形成NADH。后者随后被脱氢酶2使用(方案4)。由于所述辅助因子过量，再生系统的使用导致平衡向产物侧转移。
不幸的是，该再生系统相当昂贵且所述酶活性相当低，因此该反应缓慢且酶的稳定性可能不足以长期使用。此外，该再生系统的高成本和所需的共底物是一个缺点。
然而，在本发明的上下文中，该选项是不可能的，因为需要辅因子NAD和辅因子NADH两者。过量的NADH会完全抑制雪松烯羟基酮的形成。
Figure BDA0003409525900000071
方案5：NADH过量情况下的可能反应
出乎意料的是，可以使用相同的酶进行两个步骤，而不会在顺式和反式二醇之间获得不利的平衡。因此，两个步骤可以在仅使用一种酶的一锅反应中进行。
因此，在上述方法的优选实施方案中，相同的酶催化步骤(i)和步骤(ii)中的转化。
Figure BDA0003409525900000072
方案6：使用辅因子再生通过脱氢酶将反式雪松烯二醇转化为顺式雪松烯二醇
在这种所谓的底物偶联辅因子再生中，不需要第二种酶，因为催化期望反应的酶也进行再生反应。根据现有技术，大多数更便宜的共底物用于再生反应，其可以容易地从系统中去除。一个突出的例子是布氏嘉厌氧杆菌的醇脱氢酶，其能够通过将廉价底物2-丙醇氧化成丙酮来提供NADH和NADPH两者，从而为期望的反应供应相同酶(Bogin，0.；Peretz，M.；Burstein，Y.(1997)：Thermoanaerobacter brockii alcohol dehydrogenase：characterization of the active site metal and its ligand amino acids.ProteinScience，6，450-458)。在这里也可以通过过量的第二底物来实现平衡反应的期望调节。通常，酶和底物偶联的再生类似地进行。目标反应被第二个反应推向期望的方向。
反式二醇向顺式二醇的直接转化不需要额外的(再生)酶来再生NAD/NADH和相应的共底物。在直接转化中，得到反式二醇、羟基酮和顺式二醇的混合物，因为每个氧化的反式二醇只能还原一个羟基酮，即还原为反式或顺式二醇。然而，顺式二醇几乎不会再氧化，因此随着时间的推移顺式二醇会积累。虽然这种自动催化过程导致产物的混合，但它不需要昂贵的再生酶或共底物。
在上述方法的一个实施方案中，辅因子用于所述酶的反应，并且其中所述辅因子选自由NAD、NADP、FAD和PQQ组成的组。
优选地，所述辅因子通过酶促再生系统再生或者酶在步骤(i)和步骤(ii)中相同且所述辅因子通过所述酶再生。
令人惊讶地是，在本发明的上下文中发现，来自睾丸酮丛毛单胞菌的3-α-羟基类固醇脱氢酶能够将反式雪松烯二醇和顺式雪松烯二醇两者氧化成雪松烯羟基酮。
Figure BDA0003409525900000081
方案7：羟基类固醇脱氢酶与雪松烯羟基酮的反应
根据反应条件，可以获得高收率和高纯度的雪松烯羟基酮。因此，耗尽NADH可将顺式和反式雪松烯二醇完全氧化成期望的雪松烯羟基酮。再生系统可用于NAD，以便将反应推向期望的方向。然而，也可以使用NADH的氧化，这在粗提取物中自然发生。在相对于作为底物的反式二醇的量，粗提取物中脱氢酶活性低的情况下，有利于从反式二醇形成顺式二醇。当NAD的再生只能通过将羟基酮还原成二醇来进行时，顺式二醇积累。粗提取物中自然发生的氧化是由存在于该粗提取物中的未鉴定酶的活性催化的。如果粗提取物中天然发生的氧化程度高，则形成较少的反式和顺式二醇。所述活性可以通过制备粗提物在一定限度内进行调整。例如，高温会降低活性，大概是通过变性。
Figure BDA0003409525900000091
方案8：使用羟基类固醇脱氢酶氧化(8R，9S)-顺式雪松烯二醇
如果将雪松烯羟基酮用作用于合成雪松烯二醇的底物，则可以通过过量的NADH将其还原。在这种情况下，产物形成的几种选择是可能的。如果该反应不是立体选择性的，则获得50％顺式和50％反式雪松烯二醇的异构体混合物。
然而，如果该反应是立体选择性的，则取决于立体选择性有多高，或者得到顺式和反式二醇的混合物，或者理想地只得到两种异构体中的一种。这通常是合乎需要的，因为通常只有两种异构体中的一种具有期望的特性。确切地，来自睾丸酮丛毛单胞菌的3-α-羟基类固醇脱氢酶和雪松烯羟基酮表现出这一令人惊讶的特征。在还原中，实际上仅形成(8R，9S)-顺式雪松烯二醇(方案9)。
Figure BDA0003409525900000092
方案9：使用羟基类固醇脱氢酶立体选择性还原雪松烯羟基酮为(8R，9S)-顺式雪松烯二醇。
来自睾丸酮丛毛单胞菌的3-α-羟基类固醇脱氢酶已被分离和表征(Oppermann，U.C.T；Maser，E.(1996)：Characterization of a 3α-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase from the gram-negative bacterium Comamonastestosteroni.Eur.J.Biochem.，241，744-749；Maser，E.；Moebus，E.；Xiong，G.(2000)：Functional expression，purification，and characterization of 3α-hydroxysteroiddehydrogenase/carbonyl reductase from Comamonas testosteroni，Biochem.Biophys.Research Comm.，272，622-628)。另外，已经公布基因序列(Moebus，E；Maser，E.(1998)：Molecular cloning，overexpression，and characterization ofsteroid-inducible 3α-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase fromComamonas testosteroni，J.Biol.Chem.，273(47)，30888-30896)。
使用不同的类固醇作为底物，证明该酶对其底物具有高立体选择性(Oppermann，U.C.T；Maser，E.(1996)：Characterization of a 3α-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase from the gram-negative bacterium Comamonastestosteroni.Eur.J.Biochem.，241，744-749)。其他作者报告了该酶转化异生物质的能力。
令人惊讶的是，在本发明的上下文中发现，该酶可以立体选择性地氧化雪松烯二醇并还原雪松烯羟基酮。特别令人惊讶的是，观察到雪松烯羟基酮以高立体选择性还原为期望的(8R，9S)-顺式雪松烯二醇。
本发明还涉及一种酶用于将反式二醇转化为顺式二醇或者将反式二醇或顺式二醇转化为羟基酮和/或将羟基酮转化为反式二醇或顺式二醇的用途，所述酶由SEQ ID NO：1的核酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列编码，或者其中所述酶包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
优选地，在上述用途中，反式二醇和/或顺式二醇的两个羟基附接到包含2至4个桥环或非桥环的脂肪族环体系。在该上下文中，“附接到脂肪族环体系”是指羟基占据环体系中的环的两个相邻(邻位)位置。优选地，反式二醇和/或顺式二醇的两个羟基附接到类固醇化合物。
优选地，在上述转化中使用的酶中，其中所述反式二醇是(8R，9R)-反式雪松烯二醇，且顺式二醇是(8R，9S)-顺式雪松烯二醇。
特别优选地，所述酶用于如上所述的方法中。
具体实施方式
实施例1：柠檬烯-1，2-环氧化物水解酶基因构建体的产生
可以通过标准方法进行从红串红球菌中克隆柠檬烯-1，2-环氧化物水解酶。使用条目号Q9ZAG3(Uniport)的limA基因(GenBank登录代码：CAA77012.1)。编码序列由SEQ IDNO：3表示且翻译的蛋白质的氨基酸序列由SFQ ID NO：4表示。可以使用市售的表达载体。例如，Novagen的pET3a质粒是合适的。其包含N端T7标签和BamH I限制性位点。Lac操纵子用作启动子。该质粒包含氨苄青霉素抗性基因作为选择标记。用于表达的宿主生物体可以选自任何现有的技术体系。例如，可以使用BL21大肠杆菌菌株。
作为用于克隆的构建体，可以使用根据SEQ ID NO：5的序列，其包含添加的BamHI位点GGATCC，用于克隆到pet3a载体中。此外，该构建体包含用于克隆到pet3a载体中的NdeI位点CATATG。使用TAA作为终止密码子。
实施例2：大肠杆菌BL21的转化
根据标准方法进行转化，例如Sambrook和Russel(Sambrook，J.；Russell，R.W.(2001)：Molecular cloning：a laboratory manual，3rd ed.Cold spring harbor1aboratory press，cold spring harbor，N.Y.)描述的热转化。
实施例3：包含诱导型柠檬烯-1，2-环氧化物水解酶的生物质的生产
使用自诱导培养基(例如，Studier，Protein Expression and Purification，41(2005)，207-234)。100mL的基础培养基的组成：将1.0g的胰蛋白胨、0.67g的Na2HPO4x 7H2O(25mM)、0.34g的KH2PO4(25mM)、0.27g的NH4Cl(50mM)、0.07g的Na2SO4(5mM)、0.5g的酵母提取物溶解在去离子水中。将pH调节至8.8。随后，将培养基在121℃和1.013bar超压下灭菌20分钟。
碳水化合物补充剂组成：100mL的碳水化合物补充剂(20倍)包括：将10.0g的乳糖(0.2％)、2.75g的葡萄糖x H2O(0.05％)、25.0g的甘油(0.5％)溶解在去离子水中。在121℃和1，013bar超压下高压灭菌20分钟。2mL的碳水化合物补充剂用于100mL的自诱导培养基。
硫酸镁溶液1M：将24.65g的硫酸镁溶解在100mL的去离子水中。在121℃和1，013bar超压下高压灭菌20分钟。0.2mL(2mM)的硫酸镁溶液用于100mL的自诱导培养基。
微量矿物质溶液：100mL的微量矿物质溶液(1.000倍)包括：50mM FeCl3、20mMCaCl2、10mM MnCl2、10mM ZnSO4、2mM CoCl2、2mM CuCl2、2mM NiCl2、2mM Na2MoO4、2mMNa2SeO3、2mM H3BO3。根据以下列表将所述金属，除氯化铁外，分别溶解在约60mM的HCl中。将0.1M的氯化铁溶解在50mL的100倍稀释的浓盐酸中。
Figure BDA0003409525900000111
Figure BDA0003409525900000121
使用0.45μm的膜过滤器的无菌滤液。0.02mL的微量矿物质溶液用于100mL的自诱导培养基。
氨苄青霉素溶液：将500mg的氨苄青霉素钠溶解在10mL的去离子水中。使用0.45μm的膜过滤器的无菌滤液。0.2mL的氨苄青霉素溶液用于100mL的自诱导培养基(100μg/mL)。
使用大肠杆菌BL21菌株，其在pet3a-质粒上携带IPTG或环氧化物水解酶的乳糖诱导型基因。使用生长良好的dYT琼脂平板(30℃下24小时)的大肠杆菌BL21接种环在500mL的带挡板的锥形烧瓶中接种含有100μg的氨苄青霉素的100mL自诱导培养基。培养在30℃和120U/min下进行18小时。通常，此时的光密度为6-9(600nm)。dYT培养基的组成：5g/L NaCl；16.0g/L胰蛋白胨；10.0g酵母提取物。将pH调节至7。在121℃和1，013bar超压下高压灭菌20分钟。
实施例4：使用含有柠檬烯-1，2-环氧化物水解酶的生物质进行生物转化
使用实施例3的培养液。将100mg的(-)-α-雪松烯环氧化物添加到100mL的培养液中。生物转化在30℃和120U/min下进行。可选地，可以添加细胞膜破坏剂，诸如Triton X-100、EDTA或有机溶剂，其加速所述环氧化物的吸收。通过气相色谱监测转化。96小时后，转化为33.9％的反式雪松烯二醇。
实施例5：含有柠檬烯-1，2-环氧化物水解酶的粗提取物的生产
使用实施例3的培养液。将培养液在猎鹰管中以4.000g离心5分钟。弃去上清液，将生物质重悬在10mL的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7)中。随后，通过在冰浴中在猎鹰管中用Bandelin Sonoplus UW2200超声波仪进行1x5分钟，40％性能，循环1的超声处理进行细胞破碎。粗提取物在5℃下以12.500g离心10分钟。去除含有环氧化物水解酶的上清液并储存在冰浴中。丢弃残留物。
实施例6：使用含有柠檬烯-1，2-环氧化物水解酶的粗提取物进行生物转化
使用实施例3的培养液。将100μL的(-)-α-雪松烯环氧化物添加到培养液中。生物转化在500mL的带挡板的锥形烧瓶中在30℃和120U/min下进行。通过气相色谱监测转化。96小时后，转化为62.9％的反式-(8R，9R)-雪松烯二醇。其他产物不存在。
实施例7：静息细胞的生物转化，其表达柠檬烯-1，2-环氧化物水解酶
将实施例3的培养液在猎鹰管中以4.000g离心5分钟。弃去上清液，将生物质重悬在100mL的50mM磷酸盐缓冲液(pH7)中。培养在30℃和120U/min下进行。8小时后，将100μL的(-)-α-雪松烯环氧化物和10mg的Triton X-100添加到静息细胞中。可选地，可以添加膜破坏剂，诸如EDTA或有机溶剂。生物转化在30℃和120U/min下进行。通过气相色谱监测转化。72小时后，转化为27.5％的反式-(8R，9R)-雪松烯二醇。其他产物不存在。
实施例8：羟基类固醇脱氢酶基因构建体的产生
可以通过标准方法进行从睾丸酮丛毛单胞菌中克隆羟基类固醇脱氢酶。使用条目号为P80702(Uniport)的hsdA基因。编码序列由SEQ ID NO：1表示且翻译的蛋白质的氨基酸序列由SEQ ID NO：2表示。可以使用市售的表达载体。例如，Novagen的pet3a质粒是合适的。其包含N端T7标签和BamH I限制性位点。Lac操纵子用作启动子。该质粒包含氨苄青霉素抗性基因作为选择标记。用于表达的宿主生物体可以选自任何现有的技术体系。例如，可以使用BL21大肠杆菌菌株。
作为用于克隆的构建体，可以使用根据SEQ ID NO：6的序列，其额外包含BamHI位点GGATCC用于克隆到pet3a载体中。此外，所述构建体包含用于克隆到pet3a载体中的NdeI位点CATATG。使用TGA作为终止密码子。
实施例9：大肠杆菌BL21的转化
根据标准方法进行转化，例如Sambrook和Russel(Sambrook，J.；Russell，R.W.(2001)：Molecular cloning：a laboratory manual.3rd ed.Cold spring harborlaboratory press，cold spring harbor，N.Y.)描述的热转化。
实施例10：使用诱导型羟基类固醇脱氢酶的生物质的生产
使用自诱导培养基(例如，Studier，Protein Expression and Purification，41(2005)，207234)。100mL的基础培养基的组成：将1.0g的胰蛋白胨、0.67g的Na2HPO4x 7H20(25mM)、0.34g的KH2PO4(25mM)、0.27g的NH4Cl(50mM)、0.07g的Na2SO4(5mM)、0.5g的酵母提取物溶解在去离子水中。将pH调节至8.8。随后，将培养基在121℃和1.013bar超压下灭菌20分钟。
碳水化合物补充剂的组成：100mL的碳水化合物补充剂(20倍)包括：将10.0g的乳糖(0.2％)、2.75g的葡萄糖x H2O(0.05％)、25.0g的甘油(0.5％)溶解在去离子水中。在121℃和1，013bar超压下高压灭菌20分钟。2mL的碳水化合物补充剂用于100mL的自诱导培养基。
硫酸镁溶液1M：将24.65g的硫酸镁溶解在100mL的去离子水中。在121℃和1，013bar超压下高压灭菌20分钟。0.2mL(2mM)的硫酸镁溶液用于100mL的自诱导培养基。
微量矿物质溶液：100mL的微量矿物质溶液(1.000倍)包括：50mM FeCl3、20mMCaCl2、10mM MnCl2、10mM ZnSO4、2mM CoCl2、2mM CuCl2、2mM NiCl2、2mM Na2MoO4、2mMNa2SeO3、2mM H3BO3。根据以下列表将所述金属，除氯化铁外，分别溶解在约60mM的HCl中。将0.1M的氯化铁溶解在50mL的100倍稀释的浓盐酸中。
Figure BDA0003409525900000141
使用0.45μm的膜过滤器的无菌滤液。0.02mL的微量矿物质溶液用于100mL的自诱导培养基。
氨苄青霉素溶液：将500mg的氨苄青霉素钠溶解在10mL的去离子水中。使用0.45μm的膜过滤器的无菌滤液。0.2mL的氨苄青霉素溶液用于100mL的自诱导培养基(100μg/mL)。
使用大肠杆菌BL21菌株，其在pet3a-质粒上携带IPTG或3-α-羟基类固醇脱氢酶的乳糖诱导型基因。使用生长良好的dYT琼脂平板(30℃下24小时)的大肠杆菌BL21接种环在500mL的带挡板的锥形烧瓶中接种含有100μg的氨苄青霉素的100mL自诱导培养基。培养在30℃和120U/min下进行18小时。通常，此时的光密度为6-9(600nm)。dYT培养基的组成：5g/LNaCl；16.0g/L胰蛋白胨；10.0g酵母提取物。将pH调节至7。在121℃和1，013bar超压下高压灭菌20分钟。
实施例11：用含有羟基类固醇脱氢酶的生物质进行生物转化
使用实施例10的培养液。将50mg的反式雪松烯二醇添加到100mL的培养液中。生物转化在30℃和120U/min下进行。可选地，可以添加细胞壁或膜破坏剂，诸如Triton X-100、EDTA、溶菌酶或有机溶剂，其加速底物吸收。通过气相色谱监测转化。24小时后，转化为45％的雪松烯羟基酮。
实施例12：含有羟基类固醇脱氢酶的粗提取物的生产
使用实施例10的培养液。将培养液在猎鹰管中以4.000g离心5分钟。弃去上清液，将生物质重悬浮10mL的200mM磷酸盐缓冲液(pH 8)中。随后，通过在冰浴中在猎鹰管中用Bandelin Sonoplus UW2200超声波仪进行1x5分钟，40％性能，循环1的超声处理进行细胞破碎。粗提取物在5℃下以12.500g离心10分钟。去除含有脱氢酶的上清液并储存在冰浴中。丢弃残留物。
培养液可以通过技术人员已知的方法浓缩，诸如例如膜过滤、用盐沉淀(例如，硫酸铵)或结晶。也可以使用色谱法来浓缩3-α-羟基类固醇脱氢酶。良好的纯化方法是亲和层析。在该方法中，使用改性的3-α-羟基类固醇脱氢酶，其在N端带有6-组氨酸残基。这通过3-α-羟基类固醇脱氢酶基因的相应延伸在基因水平上实现。
实施例13：用含有羟基类固醇脱氢酶的粗提取物从(8R，9R)-反式雪松烯二醇合成 雪松烯羟基酮
使用来自实施例10的培养液。在带有磁力搅拌棒的50mL猎鹰管中将20mg的反式雪松烯二醇、2g/L的吐温80和25μL的氨苄青霉素溶液(50mg/mL)添加到10mL的培养液(蛋白质含量为18g/L)中。生物转化在30℃下进行，但该温度可以更高或更低。通过气相色谱监测转化。21小时后，转化为76.1％的雪松烯羟基酮。不存在其他产物。
实施例14：雪松烯羟基酮立体选择性还原为(8R，9S)-顺式雪松烯二醇
使用来自实施例10的培养液。生物转化在30℃下进行，但该温度可以更高或更低。在250mL的带磁力搅拌棒的肖特烧瓶中，将200mg的雪松烯羟基酮、2g/L的吐温80、10mg的蛋白酶抑制剂8830(Sigma Aldrich)和100μL的氨苄青霉素溶液(50mg/mL)添加到120mL的培养液(蛋白质含量为15.9g/L)中。将20mg的NAD和3.3g的葡萄糖一水合物添加到该溶液中。随后，加入4.4mg的商品葡萄糖脱氢酶(活性>25U/mg)的1mL的缓冲液。转化在恒定的pH 7下进行，自动添加1M碱液。在27.5和47.5小时后，加入另外20mg的NAD。30.5小时后，加入额外1.5g的葡萄糖一水合物。通过气相色谱监测转化。71.5小时后，转化为84.9％的顺式雪松烯二醇。不存在其他产物。
实施例15：使用含有羟基类固醇脱氢酶的粗提取物将(8R，9R)-反式雪松烯二醇直 接立体选择性转化为(8R，9S)-顺式雪松烯二醇
使用来自实施例10的培养液。生物转化在40℃下进行，但该温度可以更高或更低。在250mL的带磁力搅拌棒的肖特烧瓶中，将500mg的反式雪松烯二醇和500mg的雪松烯羟基酮、2g/L的吐温80、10mg的蛋白酶抑制剂8830(Sigma Aldrich)和100μL的氨苄青霉素溶液(50mg/mL)添加到50mL的培养液(蛋白质含量为25g/L)中。将120mg的NAD添加到该溶液中。16小时后，加入另外500mg的反式雪松烯二醇。66小时后，加入额外60mg的NAD。通过气相色谱监测转化。95.5小时后，反式雪松烯二醇完全转化。产物混合物包括29.9％的顺式雪松烯二醇和70.1％的雪松烯羟基酮。
序列：
SEQ ID NO：1：睾丸酮丛毛单胞菌的hsdA基因的编码区
SEQ ID NO：2：睾丸酮丛毛单胞菌的hsdA基因的翻译序列
SEQ ID NO：3：红串红球菌的limA基因的编码区
SEQ ID NO：4：红串红球菌的limA基因的翻译序列
SEQ ID NO：5：用于克隆到实施例1中使用的pet3a载体中的limA的构建体
SEQ ID NO：6：用于克隆到实施例8中使用的pet3a载体中的hsdA的构建体
序列表
<110> Symrise AG
<120> 二醇的生物技术生产
<130> SM 6128-02WO
<160> 6
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 771
<212> DNA
<213> 睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）
<400> 1
atgtccatca tcgtgataag cggctgcgcc accggcattg gtgcggctac gcgcaaggtc 60
ctggaggcgg ccggtcacca gatcgtaggc atcgatatac gcgatgcgga agtgattgcc 120
gatctctcga cggccgaagg tcgaaagcag gcgattgccg atgtactggc gaagtgcagc 180
aagggcatgg acggcctggt gctgtgcgcc ggcctgggac cgcagaccaa ggtgcttggc 240
aatgtggttt cggtcaatta ttttggcgcg accgagctga tggatgcctt tttgccagcg 300
ctgaaaaaag gccatcagcc cgcagccgtc gtcatctcgt ccgtggcttc cgcgcatctg 360
gcttttgaca agaacccact ggcgctggca ctggaagccg gcgaggaagc caaggcccgc 420
gccattgtcg aacatgcggg agagcagggc ggaaatctgg cctatgcggg cagcaagaat 480
gctttgacgg tggctgtgcg caaacgcgcc gccgcctggg gcgaggctgg cgtgcgcctg 540
aacaccatcg cccccggtgc aaccgagact cccttgctgc aggcgggcct gcaggacccg 600
cgctatggcg aatccattgc caagttcgtt cctcccatgg gccgccgtgc cgagccgtcc 660
gagatggcgt cggtcatcgc ctttttgatg agcccggccg caagctatgt gcatggcgcg 720
cagatcgtca ttgatggcgg cattgatgcg gtgatgcgcc cgacacagtt c 771
<210> 2
<211> 257
<212> PRT
<213> 睾丸酮丛毛单胞菌
<400> 2
Met Ser Ile Ile Val Ile Ser Gly Cys Ala Thr Gly Ile Gly Ala Ala
1 5 10 15
Thr Arg Lys Val Leu Glu Ala Ala Gly His Gln Ile Val Gly Ile Asp
20 25 30
Ile Arg Asp Ala Glu Val Ile Ala Asp Leu Ser Thr Ala Glu Gly Arg
35 40 45
Lys Gln Ala Ile Ala Asp Val Leu Ala Lys Cys Ser Lys Gly Met Asp
50 55 60
Gly Leu Val Leu Cys Ala Gly Leu Gly Pro Gln Thr Lys Val Leu Gly
65 70 75 80
Asn Val Val Ser Val Asn Tyr Phe Gly Ala Thr Glu Leu Met Asp Ala
85 90 95
Phe Leu Pro Ala Leu Lys Lys Gly His Gln Pro Ala Ala Val Val Ile
100 105 110
Ser Ser Val Ala Ser Ala His Leu Ala Phe Asp Lys Asn Pro Leu Ala
115 120 125
Leu Ala Leu Glu Ala Gly Glu Glu Ala Lys Ala Arg Ala Ile Val Glu
130 135 140
His Ala Gly Glu Gln Gly Gly Asn Leu Ala Tyr Ala Gly Ser Lys Asn
145 150 155 160
Ala Leu Thr Val Ala Val Arg Lys Arg Ala Ala Ala Trp Gly Glu Ala
165 170 175
Gly Val Arg Leu Asn Thr Ile Ala Pro Gly Ala Thr Glu Thr Pro Leu
180 185 190
Leu Gln Ala Gly Leu Gln Asp Pro Arg Tyr Gly Glu Ser Ile Ala Lys
195 200 205
Phe Val Pro Pro Met Gly Arg Arg Ala Glu Pro Ser Glu Met Ala Ser
210 215 220
Val Ile Ala Phe Leu Met Ser Pro Ala Ala Ser Tyr Val His Gly Ala
225 230 235 240
Gln Ile Val Ile Asp Gly Gly Ile Asp Ala Val Met Arg Pro Thr Gln
245 250 255
Phe
<210> 3
<211> 447
<212> DNA
<213> 红串红球菌（Rhodococcus erythropolis）
<400> 3
atgacatcaa agatcgaaca acctcgctgg gcgtccaagg acagtgccgc cggcgctgcc 60
tcgactccgg acgaaaagat cgttctggag ttcatggacg cactgaccag taatgatgct 120
gcaaaactca ttgagtactt tgcagaagac acgatgtacc agaacatgcc actcccccct 180
gcatacggcc gcgacgccgt cgagcaaact ctggctggcc tgttcaccgt catgagcatc 240
gatgcggtgg agacgttcca tatcggctcg agtaacggac ttgtgtacac cgaacgtgtc 300
gatgtcctac gcgcactacc caccggcaag agctacaacc tgtcaatcct cggagtcttc 360
cagctcaccg agggcaagat tacgggttgg cgtgactact tcgatctgcg cgaattcgaa 420
gaagctgtcg accttcccct ccgcggc 447
<210> 4
<211> 149
<212> PRT
<213> 红串红球菌
<400> 4
Met Thr Ser Lys Ile Glu Gln Pro Arg Trp Ala Ser Lys Asp Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gly Ala Ala Ser Thr Pro Asp Glu Lys Ile Val Leu Glu Phe Met
20 25 30
Asp Ala Leu Thr Ser Asn Asp Ala Ala Lys Leu Ile Glu Tyr Phe Ala
35 40 45
Glu Asp Thr Met Tyr Gln Asn Met Pro Leu Pro Pro Ala Tyr Gly Arg
50 55 60
Asp Ala Val Glu Gln Thr Leu Ala Gly Leu Phe Thr Val Met Ser Ile
65 70 75 80
Asp Ala Val Glu Thr Phe His Ile Gly Ser Ser Asn Gly Leu Val Tyr
85 90 95
Thr Glu Arg Val Asp Val Leu Arg Ala Leu Pro Thr Gly Lys Ser Tyr
100 105 110
Asn Leu Ser Ile Leu Gly Val Phe Gln Leu Thr Glu Gly Lys Ile Thr
115 120 125
Gly Trp Arg Asp Tyr Phe Asp Leu Arg Glu Phe Glu Glu Ala Val Asp
130 135 140
Leu Pro Leu Arg Gly
145
<210> 5
<211> 459
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 5
catatgacat caaagatcga acaacctcgc tgggcgtcca aggacagtgc cgccggcgct 60
gcctcgactc cggacgaaaa gatcgttctg gagttcatgg acgcactgac cagtaatgat 120
gctgcaaaac tcattgagta ctttgcagaa gacacgatgt accagaacat gccactcccc 180
cctgcatacg gccgcgacgc cgtcgagcaa actctggctg gcctgttcac cgtcatgagc 240
atcgatgcgg tggagacgtt ccatatcggc tcgagtaacg gacttgtgta caccgaacgt 300
gtcgatgtcc tacgcgcact acccaccggc aagagctaca acctgtcaat cctcggagtc 360
ttccagctca ccgagggcaa gattacgggt tggcgtgact acttcgatct gcgcgaattc 420
gaagaagctg tcgaccttcc cctccgcggc taaggatcc 459
<210> 6
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 6
catatgtcca tcatcgtgat aagcggctgc gccaccggca ttggtgcggc tacgcgcaag 60
gtcctggagg cggccggtca ccagatcgta ggcatcgata tacgcgatgc ggaagtgatt 120
gccgatctct cgacggccga aggtcgaaag caggcgattg ccgatgtact ggcgaagtgc 180
agcaagggca tggacggcct ggtgctgtgc gccggcctgg gaccgcagac caaggtgctt 240
ggcaatgtgg tttcggtcaa ttattttggc gcgaccgagc tgatggatgc ctttttgcca 300
gcgctgaaaa aaggccatca gcccgcagcc gtcgtcatct cgtccgtggc ttccgcgcat 360
ctggcttttg acaagaaccc actggcgctg gcactggaag ccggcgagga agccaaggcc 420
cgcgccattg tcgaacatgc gggagagcag ggcggaaatc tggcctatgc gggcagcaag 480
aatgctttga cggtggctgt gcgcaaacgc gccgccgcct ggggcgaggc tggcgtgcgc 540
ctgaacacca tcgcccccgg tgcaaccgag actcccttgc tgcaggcggg cctgcaggac 600
ccgcgctatg gcgaatccat tgccaagttc gttcctccca tgggccgccg tgccgagccg 660
tccgagatgg cgtcggtcat cgcctttttg atgagcccgg ccgcaagcta tgtgcatggc 720
gcgcagatcg tcattgatgg cggcattgat gcggtgatgc gcccgacaca gttctgagga 780
tcc 783

Claims (12)

1.一种用于生产反式二醇或顺式二醇或羟基酮的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)通过一种酶催化将反式二醇或顺式二醇转化为羟基酮，所述酶由SEQ ID NO：1的核酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列编码，或者其中所述酶包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID N0：2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；和/或
(ii)通过步骤(i)中所定义的酶催化将羟基酮，可选地为步骤(i)中获得的羟基酮，转化为顺式二醇或反式二醇。
2.根据权利要求1所述的用于生产顺式二醇的方法，其包括以下步骤：
(i)通过一种酶催化将反式二醇转化为羟基酮，所述酶由SEQ ID NO：1的核酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列编码，或者其中所述酶包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列；以及
(ii)通过步骤(i)中所定义的酶催化将羟基酮，可选地为步骤(i)中获得的羟基酮，转化为顺式二醇。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述反式二醇和/或所述顺式二醇的两个羟基附接到包括2至4个桥环或非桥环的脂肪族环体系。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反式二醇是(8R，9R)-反式雪松烯二醇，所述顺式二醇是(8R，9S)-顺式雪松烯二醇，并且所述羟基酮是雪松烯羟基酮。
5.根据权利要求4所述的用于生产(8R，9S)-顺式雪松烯二醇的方法，其中在步骤(i)中，(8R，9R)-反式雪松烯二醇转化为雪松烯羟基酮，并且在步骤(ii)中，雪松烯羟基酮转化为(8R，9S)-顺式雪松烯二醇。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述相同的酶催化步骤(i)和步骤(ii)中的所述转化。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中辅因子用于所述酶的反应，并且其中所述辅因子选自由NAD、NADP、FAD和PQQ组成的组。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述辅因子通过酶促再生系统再生或者其中所述酶在步骤(i)和步骤(ii)中相同且所述辅因子通过所述酶再生。
9.一种酶用于将反式二醇转化为顺式二醇或者将反式二醇或顺式二醇转化为羟基酮和/或将羟基酮转化为反式二醇或顺式二醇的用途，所述酶由SEQ ID NO：1的核酸序列或与SEQ ID NO：1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列编码，或者其中所述酶包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述反式二醇和/或所述顺式二醇的两个羟基附接到包括2至4个桥环或非桥环的脂肪族环体系。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述反式二醇是(8R，9R)-反式雪松烯二醇，且所述顺式二醇是(8R，9S)-顺式雪松烯二醇。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的用途，其中所述酶用于根据权利要求1至8中任一项所述的方法中。
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