ES2264936T3 - Procedimiento para la preparacion del 1,3-propanodiol por un microorganismo recombinante en ausencia de coenzima b12 o de uno de sus precursores. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de preparación del 1, 3-propanodiol a partir de una sustancia carbonada, comprendiendo dicho procedimiento por lo menos una etapa de cultivo de un microorganismo recombinante en el cual ha sido introducido por lo menos un ácido nucleico que codifica para las dos subunidades de una glicerol deshidratasa cuya actividad catalítica es independiente de la presencia de coenzima B12 o de uno de sus precursores, estando esta proteína dimérica compuesta por un primer polipéptido que tiene por lo menos 50% de identidad en aminoácidos con el polipéptido de secuencia SEC ID nº 6 y por un segundo polipéptido que tiene por lo menos 50% de identidad en amino ácidos con el polipéptido de secuencia SEC ID nº 7.
Description
Procedimiento para la preparación del
1,3-propanodiol por un microorganismo recombinante
en ausencia de coenzima B12 o de uno de sus precursores.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la preparación del
1,3-propanodiol a partir de una sustancia
carbonada, comprendiendo dicho procedimiento una etapa de cultivo
de un microorganismo recombinante no productor de coenzima B12 en
ausencia de adición de coenzima B12 o de uno de sus precursores.
La invención se refiere también a un ácido
nucleico que codifica para una glicerol deshidratasa cuya actividad
catalítica es independiente de la presencia de coenzima B12 o de uno
de sus precursores así como un ácido nucleico que codifica para una
1,3-propanol deshidrogenasa que interviene en la
síntesis del 1,3-propanodiol.
La invención se refiere también a unos vectores
y células huésped recombinantes que comprenden dichos ácidos
nucleicos así como a los polipéptidos codificados por estos
últimos.
El 1,3-propanodiol es un
compuesto de un gran interés industrial, principalmente utilizado
en la industria de los detergentes y en la de los polímeros.
Así, el 1,3-propanodiol es
utilizado en las lejías líquidas como agente estabilizante de las
lipasas, amilasas y proteasas así como "suavizante protector"
en los detergentes líquidos para lavado a mano de la vajilla.
Por otra parte, el
1,3-propanodiol es utilizado de forma creciente en
la industria de los polímeros, más particularmente como monómero de
síntesis de poliésteres, poliéteres, o poliuretanos.
Actualmente, la producción de
1,3-propanodiol se realiza principalmente por
síntesis química por hidratación (en medio ácido) de acroleína a
3-hidroxipropionaldehído, el cual es a continuación
reducido por hidrogenación catalítica a
1,3-propanodiol.
Un procedimiento de este tipo es costoso y
utiliza un producto tóxico, la acroleína. Además, esta síntesis es
poco selectiva y genera un gran número de compuestos secundarios no
utilizables.
Otra vía de síntesis consiste en la
hidrocarbonilación de óxido de etileno por el monóxido de carbono y
el hidrógeno bajo alta presión en presencia de catalizadores y
solventes.
Una reacción de este tipo produce un dioxano que
es a continuación hidrogenado a 1,3-propanodiol.
Este segundo procedimiento de síntesis química es también muy
costoso.
Desde hace algunos años, una alternativa a la
producción de 1,3-propanodiol por síntesis química
ha constituido el objeto de diferentes trabajos: se trata de la
bioconversión del glicerol en 1,3-propanodiol por
algunas cepas bacterianas tales como Citrobacter, Clostridium,
Enterobacter, Klebsiella, Lactobacillus y
Pelobacter.
En particular, ha sido estudiada la conversión
del glicerol en 1,3-propanodiol en las bacterias
anaerobias facultativas tales como las bacterias del género
Klebsiella, del género Citrobacter o también
Enterobacter agglomerans.
Así, unos ensayos de clonado de genes que
codifican para las enzimas responsables de la conversión del
glicerol en 1,3-propanodiol han sido intentados a
partir de la bacteria Klebsiella pneumoniae.
Más particularmente, el clonado de los genes que
codifican para dos enzimas ha sido buscado, respectivamente una
glicerol deshidratasa que cataliza la conversión del glicerol en
3-hidroxipropionaldehído, y una
1,3-propanodiol deshidrogenasa que cataliza la
conversión del glicerol en 3-hidroxipropionaldehído
y en 1,3-propanodiol.
Las patentes US 5.633.362 y 5.821.092 describen
el clonado de un fragmento genómico de aproximadamente 35 kb de la
bacteria Klebsiella pneumoniae, conteniendo dicho fragmento
de ADN una secuencia que codifica para una diol deshidratasa
activa. Dicho fragmento genómico ha sido obtenido por cribado de
varios bancos de cósmidos de las especies bacterianas Klebsiella
pneumoniae y Klebsiella aerogenes.
Se describe en estas patentes que unas cepas de
E. Coli DH5\alpha han sido transformadas con estos cósmidos
y las bacterias transformantes cribadas por su capacidad para
convertir el glicerol en 1,3-propanodiol. Se ha
observado una baja producción de 1,3-propanodiol en
algunos clones de bacterias transformantes. Se ha deducido que la
diol deshidratasa codificada por los cósmidos seleccionados podría
ser responsable de la conversión del glicerol en
1,3-propanodiol observada.
Sin embargo, la producción de
1,3-propanodiol por las cepas de E. Coli
DH5\alpha transformadas por los cósmidos seleccionados necesitaba
obligatoriamente la presencia de vitamina B12 o de uno de sus
precursores en el medio de cultivo bacteriano.
\newpage
Además, la duración de fermentación necesaria
para la detección de una producción de
1,3-propanodiol era muy larga (de 78 a 132 horas) y
el nivel de producción del 1,3-propanodiol muy
baja.
La patente US nº 5.686.276 a nombre DU PONT DE
NEMOURS & COMPANY describe un procedimiento que permite la
bioconversión de la D-glucosa en
1,3-propanodiol por una cepa de E. Coli
transformada por el ADN de cósmido originario de Klebsiella
pneumoniae. De nuevo, la producción de
1,3-propanodiol necesita la utilización de medios
de cultivo adaptados a las células de E. Coli transformada
por un cósmido de Klebsiella pneumoniae que contiene vitamina
B12, por ejemplo a la concentración de 800 \mug/ml.
Los niveles de producción de
1,3-propanodiol observados eran muy bajos, del orden
de 0,5 g/l a 10 g/l.
La presencia de vitamina B12 en el medio de
cultivo de las células transformadas con el ADN de Klebsiella
pneumoniae de las patentes US citadas anteriormente es
obligatoria debido a que el coenzima B12 es un cofactor necesario
para la actividad catalítica de la glicerol deshidratasa de
Klebsiella pneumoniae.
La coenzima B12, o cualquiera de sus
precursores, tal como la vitamina B12, es un compuesto excesivamente
costoso y poco estable, lo que hace difícil, incluso imposible, la
transposición a escala industrial de los procedimientos de
conversión de la glucosa o del glicerol en
1,3-propanodiol por fermentación bacteriana con la
ayuda de dichas cepas.
Además, la coenzima B12 y sus precursores
atraviesan difícilmente las paredes membranarias de algunos
microorganismos, tales como las levaduras, lo que necesita la
presencia de concentraciones muy altas de estos compuestos en el
medio de cultivo a fin de que sean accesibles para las enzimas
intracelulares de las que la coenzima B12 es el cofactor.
Por otra parte, una alternativa que consistiría
en introducir el ADN codificante para las glicerol deshidratasas
conocidas que intervienen en la conversión del glicerol en
1,3-propanodiol, en las bacterias que sintetizan la
vitamina B12 toparía con obstáculos técnicos considerables.
En efecto, solamente algunas especies
bacterianas sintetizan naturalmente la vitamina B12, tales como las
bacterias Pseudomonas o también las propionibacterias, cuya
genética es muy poco conocida y que son por tanto poco aptas para
sufrir modificaciones genéticas.
Otras bacterias que sintetizan naturalmente la
vitamina B12, cuya genética es más conocida, tal como Klebsiella
pneumoniae, presentan importantes problemas de toxicidad, lo que
las hace poco aptas para una utilización en la industria.
Además de esta primera desventaja, sólo una
pequeña producción de 1,3-propanodiol ha podido ser
obtenida después de transformación de Klebsiella pneumoniae.
Así, la solicitud PCT Nº WO 98/21 339 describe unas Klebsiella
pneumoniae recombinantes que expresan a la vez los genes de
metabolización de la glucosa en glicerol y los genes de
metabolización del glicerol en 1,3-propanodiol. La
producción de 1,3-propanodiol observada a partir de
glucosa era baja, del orden de 10 g por litro.
Los obstáculos técnicos para la puesta a punto
de un procedimiento de bioconversión de una sustancia carbonada en
1,3-propanodiol mencionados anteriormente, han sido
superados por la invención.
El solicitante ha en efecto aislado y
caracterizado un ácido nucleico que codifica para una glicerol
deshidratasa cuya actividad catalítica es independiente de la
presencia de coenzima B12 o de cualquiera de sus precursores.
Los genes que codifican para la glicerol
deshidratasa independiente de la coenzima B12 han sido aislados por
el solicitante a partir del genoma de la bacteria Clostridium
butyricum VPI 1718. Codifican para un proteína dimérica
constituida por dos subunidades proteínicas, respectivamente los
polipéptidos ORF11 y ORF12.
Se ha demostrado según la invención que las
secuencias que codifican para los polipéptidos ORF11 y ORF12 están
localizadas sobre un operón único en el genoma de Clostridium
butyricum, comprendiendo dicho operón también, corriente abajo
de la secuencia nucleica que codifica para la subunidad ORF 12, una
región que codifica para una 1,3-propanodiol
deshidrogenasa.
El operón según la invención comprende, del
extremo 5' hacia el extremo 3, un promotor de la transcripción,
codificando la secuencia orf11 para ORF11, la primera
subunidad de la glicerol deshidratasa independiente de la coenzima
B12, codificando la secuencia orf12, para ORF12, la segunda
subunidad de la glicerol deshidratasa y una secuencia dhaT
que codifica para una nueva 1,3-propanodiol
deshidrogenasa (DHAT).
Así, las secuencias nucleicas que codifican para
las dos subunidades proteínicas de la glicerol deshidratasa y para
la 1,3-propanodiol deshidrogenasa forman parte de un
operón único, siendo las tres secuencias codificantes correguladas
por una secuencia promotora única situada del lado 5' de la
secuencia que codifica para la subunidad ORF11.
Se ha demostrado además según la invención que
la transformación de un huésped celular bacteriano con una
secuencia que comprende las regiones que codifican respectivamente
para ORF11, ORF12 y DHAT era de naturaleza que confería al huésped
celular transformado la capacidad de producir
1,3-propanodiol a partir de la glucosa o del
glicerol en ausencia de la coenzima B12 o de cualquiera de sus
precursores, cuando estas secuencias se ponen bajo el control de un
promotor apropiado, funcional en el huésped celular en el cual se
busca la expresión de estas secuencias.
El solicitante ha demostrado también que la
transformación de un huésped celular bacteriano que produce
naturalmente el 1,3-propanodiol por las secuencias
que codifican para las dos subunidades de la glicerol deshidratasa
según la invención, era de naturaleza que inducía un aumento
significativo de la producción de propanodiol en los huéspedes
bacterianos recombinantes obtenidos.
La invención tiene por tanto por objeto un
procedimiento para la preparación del
1,3-propanodiol a partir de una sustancia
carbonada, comprendiendo dicho procedimiento por lo menos una etapa
de cultivo de un microorganismo recombinante en el cual ha sido
integrado por lo menos un ácido nucleico que codifica para las dos
subunidades de una glicerol deshidratasa cuya actividad catalítica
es independiente de la presencia de la coenzima B12 o uno de sus
precursores.
Ventajosamente, la glicerol deshidratasa cuya
actividad catalítica es independiente de la presencia de la coenzima
B12 proviene de la bacteria Clostridium butyricum.
La glicerol deshidratasa independiente de la
coenzima B12 es una proteína dimérica compuesta por un primer
polipéptido que tiene por lo menos 50% de identidad en aminoácidos
con el polipéptido de secuencia SEC ID nº 6 y por un segundo
polipéptido que tiene por lo menos 50% de identidad en aminoácidos
con el polipéptido de secuencia SEC ID nº 7. De forma totalmente
ventajosa, la glicerol deshidratasa independiente de la coenzima
B12 está compuesta por un primer y segundo polipéptidos que tienen
por lo menos 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o incluso 99% de
identidad en aminoácidos con respectivamente el polipéptido de
secuencia SEC ID nº 6 y el polipéptido de secuencia SEC ID nº 7.
El "porcentaje de identidad" de nucleótidos
o de ácidos aminados entre dos secuencias, en el sentido de la
presente invención, puede ser determinado comparando dos secuencias
alineadas de forma óptima, a través de una ventana de
comparación.
La parte de la secuencia nucleotídica o
peptídica en la ventana de comparación puede así comprender unas
adiciones o unas deleciones (por ejemplo "gaps") con respecto
a la secuencia de referencia (que no comprende estas adiciones o
estas deleciones) de manera que se obtenga una alineación óptima de
las dos secuencias.
El porcentaje de identidad es calculado
determinando el número de posiciones a las cuales una base nucleica
o un ácido aminado idéntico es observado para las dos secuencias
comparadas, y después dividiendo el número de posiciones en las
cuales hay identidad entre las dos bases o los dos ácidos aminados,
por el número total de posiciones en la ventana de comparación, y
después multiplicando el resultado por cien a fin de obtener el
porcentaje de identidad de secuencias.
La alineación óptima de secuencias para la
comparación puede ser realizada de manera informática con la ayuda
de algoritmos conocidos (por ejemplo la lógica FASTA de la Sociedad
WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG),
575 Science Doctor, Madison, WISCONSIN).
A título de ilustración, el porcentaje de
identidad de secuencia podrá ser calculado con la ayuda de la lógica
citada FASTA, utilizando exclusivamente los parámetros por
defecto.
De manera totalmente preferida, el porcentaje de
identidad en ácidos nucleicos o en ácidos aminados entre dos
secuencias nucleicas o de ácidos aminados se calcula con la ayuda de
la lógica BLAST (versión 2.06 de septiembre 1998) utilizando
exclusivamente los parámetros por defecto.
Las diferencias en ácidos aminados que puede
comprender un polipéptido según la invención con respecto a la
secuencia de ácidos aminados de referencia, tal como la definida en
el listado de secuencias presentado al final de la presente
descripción, puede resultar en unas sustituciones, deleciones o
adiciones de uno o varios ácidos aminados consecutivos o no.
Según otro aspecto del procedimiento según la
invención, el microorganismo recombinante comprende además un ácido
nucleico que codifica una 1,3-propanodiol
deshidrogenasa, preferentemente una 1,3-propanodiol
deshidrogenasa de Clostridium butyricum.
De manera preferida, la
1,3-propanodiol deshidrogenasa es un polipéptido que
tiene por lo menos 90% de identidad en aminoácidos con el
polipéptido de secuencia SEC ID nº 8.
De forma totalmente ventajosa, la invención se
refiere también a un polipéptido que tiene por lo menos 95%, 97%,
98% o 99% de identidad en aminoácidos con el polipéptido de
secuencia SEC ID nº 8.
Una característica esencial del procedimiento
según la invención es que la etapa de cultivo del microorganismo
recombinante se efectúa en ausencia de la coenzima B12 o de uno de
sus precursores.
Según aún otro aspecto, el procedimiento está
además caracterizado porque la fuente carbonada se elige de entre
los ósidos y los polioles.
El ósido puede ser por ejemplo la glucosa.
El poliol puede ser por ejemplo el glicerol.
Preferentemente, el procedimiento según la
invención se realiza con un microorganismo elegido de entre los
microorganismos que no producen naturalmente la coenzima B12 o uno
de sus precursores.
Un microorganismo de este tipo puede ser una
bacteria que pertenece al género Clostridium o
Escherichia.
Puede tratarse también de una levadura de la
especie Saccharomyces cerevisiae.
Según un modo de realización particular, el
procedimiento está además caracterizado porque el microorganismo
recombinante comprende también unos ácidos nucleicos que codifican
respectivamente una
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa y
una glicerol-3-fosfatasa, en cuyo
caso el microorganismo recombinante es capaz de convertir con alto
rendimiento una fuente carbonada tal como la glucosa en
1,3-propanodiol.
La invención tiene además por objeto un ácido
nucleico que comprende por lo menos 30 nucleótidos consecutivos de
un polinucleótido que codifica para por lo menos una subunidad de
una glicerol deshidratasa cuya actividad catalítica es
independiente de la presencia de la coenzima B12 o de uno de sus
precursores, comprendiendo dicho ácido nucleico la totalidad o
parte de un polinucleótido que tiene por lo menos 50% de identidad
en nucleótidos con el polinucleótido de secuencia SEC ID nº 1 o SEC
ID nº 2.
Preferentemente, un ácido nucleico según la
invención se presenta en forma purificada o aislada.
Un polinucleótido de secuencia complementaria a
los polinucleótidos de secuencias SEC ID nº 1 o SEC ID nº 2
constituye también un objeto de la invención.
Forman también parte de la invención unos ácidos
nucleicos que comprenden la totalidad o parte de un polinucleótido
que posee por lo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%,
99,5% o incluso 99,8% de identidad en nucleótidos con la secuencia
nucleotídica de cualquiera de los ácidos nucleicos cuyas secuencias
están definidas en la presente descripción, o un ácido nucleico de
secuencia complementaria.
El término "aislado" en el sentido de la
presente invención designa un material biológico que ha sido
sustraído de su entorno original (el entorno en el cual está
localizado naturalmente).
Por ejemplo, un polinucleótido que se presenta
en estado natural en una planta o un animal no está aislado.
El mismo polinucleótido separado de los ácidos
nucleicos adyacentes en el seno de los cuales está naturalmente
insertado en el genoma de la planta o del animal está aislado.
Un polinucleótido de este tipo puede ser
incluido en un vector y/o dicho polinucleótido puede ser incluido en
una composición y permanecer sin embargo en estado aislado debido a
que el vector o la composición no constituye su entorno natural.
El término "purificado" no necesita que el
material esté presente en una forma de pureza absoluta, exclusiva de
la presencia de otros compuestos. Se trata más bien de una
definición relativa.
Un polinucleótido está en estado purificado
después de purificación del material de partida o del material
natural de por lo menos un orden de magnitud, preferentemente dos o
tres y preferentemente cuatro o cinco órdenes de magnitud.
A los fines de la presente descripción, la
expresión "secuencia nucleótica" puede emplearse para designar
indiferentemente un polinucleótido o un ácido nucleico. La expresión
"secuencia nucleotídica" engloba el material genético mismo y
no está por tanto restringida a la información referente a su
secuencia.
La invención es también relativa a un ácido
nucleico que codifica para las dos subunidades proteínicas de la
glicerol deshidratasa independiente de la coenzima B12 de
Clostridium butyricum.
Preferentemente, un ácido nucleico de este tipo
se caracteriza porque comprende un primer polinucleótido que tiene
por lo menos 50% de identidad en nucleótidos con el polinucleótido
de secuencia SEC ID nº 1 y un segundo po-
linucleótido que tiene por lo menos 50% de identidad en nucleótidos con el polinucleótido de secuencia SEC ID nº 2.
linucleótido que tiene por lo menos 50% de identidad en nucleótidos con el polinucleótido de secuencia SEC ID nº 2.
Según un modo de realización particular, dicho
ácido nucleico que codifica para las dos subunidades proteínicas
de la glicerol deshidratasa independiente de la coenzima B12
comprenderá además una secuencia con función de promotor, funcional
en la célula huésped en la cual se busca la expresión de los
polinucleótidos que codifican para las dos subunidades de esta
enzima.
Dicha secuencia nucleotídica promotora de la
transcripción puede ser la secuencia promotora SEC ID nº 3 o una
secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad en nucleótidos con
esta última.
La invención tiene también por objeto un ácido
nucleico con función de promotor bacteriano, en particular en
Clostridium butyricum, que comprende un polionucleótido que
tiene por lo menos 80% de identidad en nucleótidos con la secuencia
SEC ID nº 3, o un polinucleótido de secuencia complementaria.
Como ya se ha mencionado más arriba, una
organización en operón único permite, en la bacteria Clostridium
butyricum, la síntesis de un producto de transcripción (ARN
mensajero) que comprende a la vez las secuencias que codifican para
las dos subunidades proteínicas del glicerol deshidratasa
independiente de la coenzima B12, que cataliza la transformación de
la glicerol en 3-hidroxipropionaldehído
(3-HPA) y la 1,3-propanodiol
deshidrogenasa (DHAT) que cataliza la transformación del
3-HPA en 1,3-propanodiol.
La invención se refiere por tanto también a un
ácido nucleico que comprende la totalidad o parte de un
polinucleótido que codifica una 1,3-propanodiol
deshidrogenasa que tiene por lo menos 90% de identidad en
nucleótidos con el polinucleótido de secuencia SEC ID nº 4, o un
polinucleótido de secuencia complementaria.
En un modo de realización particular de un ácido
nucleico purificado o aislado según la invención, puede ser
ventajoso poder incluir en una misma secuencia los ácidos nucleicos
que codifican respectivamente para las dos subunidades proteínicas
de la glicerol deshidrogenasa y para la
1,3-propanodiol deshidrogenasa, codificando una
ácido nucleico de ese tipo entonces para las dos enzimas
susceptibles de catalizar la totalidad de las etapas de
bioconversión del glicerol en 1,3-propanodiol.
En consecuencia, la invención se refiere
también a un ácido nucleico que comprende, desde el extremo 5'
hacia el extremo 3':
a) un primer ácido nucleico caracterizado porque
comprende un primer polinucleótido que tiene por lo menos 50% de
identidad en nucleótidos con el polinucleótido de secuencia SEC ID
nº 1 y un segundo polinucleótido que tiene por lo menos 50% de
identidad en nucleótidos con el polinucleótido de secuencia SEC ID
nº 2.
b) Un segundo ácido nucleico que comprende un
polinucleótido que codifica una 1,3-propanodiol
deshidrogenasa que tiene por lo menos 90% de identidad en
nucleótidos con el polinucleótido de secuencia SEC ID nº 4.
Las secuencias nucleotídicas que codifican
respectivamente para la glicerol deshidratasa y la
1,3-propanodiol deshidrogenasa del ácido nucleico
anteriormente descrito, podrán además ser ventajosamente puestas
bajo control de una secuencia promotora apropiada, tal como la
secuencia SEC ID nº 3 o de cualquier otra secuencia promotora
funcional en la célula huésped en la cual se busca su expresión.
Un ácido nucleico que responda a la definición
anterior es por ejemplo el polinucleótido de secuencia SEC ID nº 5 o
también un polinucleótido que tiene por lo menos 50% de identidad
en nucleótidos con el polinucleótido de secuencia SEC ID nº 5.
El ácido nucleico de secuencia SEC ID nº 5
comprende los elementos funcionales característicos siguientes:
a) Un terminador de transcripción de una región
codificante localizada corriente arriba del operón
1,3-propanodiol en el genoma de Clostridium
butyricum.
Este motivo terminador de transcripción posee
una estructura en horquilla centrada sobre el nucleótido en
posición 27 de la secuencia SEC ID nº 5 (\DeltaG = -25,2 kcal/mol)
que comprende un vástago 19 pb, estando las dos ramas del vástago
constituidas respectivamente por unos nucleótidos en posición 5 a 23
y unos nucleótidos en posiciones 30 a 48 de la secuencia SEC ID nº
5, estando el bucle de la estructura en horquilla constituido por
los nucleótidos en posiciones 24 a 29 de la secuencia SEC ID nº
5.
Este motivo terminador de transcripción está
seguido de la secuencia ATTTT.
b) Promotor del operón
1,3-propanodiol.
El promotor del operón
1,3-propanodiol está localizado del nucleótido en
posición 100 al nucleótido en posición 200 de la secuencia SEC ID nº
5.
Este promotor comprende una caja (-35) de
secuencia TAGATA localizada del nucleótido en posición 142 al
nucleótido en posición 147 de la secuencia SEC ID nº 5. Este
promotor comprende también una caja (-10) de secuencia TATTAT
localizada del núcleo en posición 164 al núcleo en posición 169 de
la secuencia SEC ID nº 5, siendo la distancia entre las cajas -35 y
las cajas -10 de 16 pb.
c) orf11 (secuencia que codifica para la
primera subunidad de la glicerol deshidrogenasa).
\newpage
Se trata de una fase de lectura abierta única de
2.361 pb que codifica para el polipéptido ORF11 de 787 ácidos
aminados de secuencia SEC ID nº 6.
El codón de iniciación ATG está localizado del
nucleótido en posición 313 al nucleótido en posición 315 de la
secuencia SEC ID nº 5. El marco abierto de lectura termina por un
codón stop de secuencia TAA localizada del nucleótido en posición
2674 al nucleótido en posición 2676 de la secuencia SEC ID nº 5.
Además, un lugar de fijación al ribosoma de
secuencia GAGGAG precede al codón de iniciación y está localizado
del nucleótido en posición 302 al nucleótido en posición 307 de la
secuencia SEC ID nº 5.
d) orf12 (secuencia que codifica para la
segunda subunidad de la glicerol deshidrogenasa). Se trata de un
marco de lectura abierto único de 912 pb que codifica para un
polipéptido de 304 ácidos aminados de secuencia SEC ID nº 7. El
codón de iniciación de secuencia ATG está localizado del nucleótido
en posición 2704 al nucleótido en posición 2706 de la secuencia SEC
ID nº 5. El marco de lectura abierto se acaba por un codón stop de
secuencia TAA localizada entre los nucleótidos en posición 3616 y
el nucleótido en posición 3618 de la secuencia SEC ID nº 5.
Además, un lugar de fijación del ribosoma de
secuencia AAGGGGA precede al codón de iniciación y está localizado
del nucléotido en posición 2689 al nucleótido en posición 2695 de la
secuencia de SEC ID nº 5.
e) dhat (secuencia que codifica para la
1,3-propanodiol deshidrogenasa).
Se trata de una fase de lectura abierta única de
1155 pb que codifica para un polipéptido de 385 ácidos aminados de
secuencia SEC ID nº 8.
El codón de iniciación de secuencia ATG está
localizado del núcleo en posición 3678 al núcleo en posición 3680 de
la secuencia SEC ID Nº 5.
La fase de lectura abierta termina por un codón
stop de secuencia TAA localizado del nucleótido en posición 4833 al
nucleótido en posición 4835 de la secuencia SEC ID nº 5.
Además, un lugar de fijación del ribosoma de
secuencia AGGAGA precede al codón de iniciación y está localizado
del nucleótido en posición 3663 al nucleótido en posición 3668 de la
secuencia SEC ID nº 5.
f) Terminador de transcripción del operón
1,3-propanodiol.
El terminador de transcripción del operón
1,3-propanodiol posee una estructura en horquilla
centrada sobre el nucleótido en posición 4933 de la secuencia SEC
ID nº 5 (\DeltaG = -27,4 kcal/mol) y comprende un vástago de 22
pb constituido respectivamente por unos nucleótidos localizados en
posiciones 4909 a 4930 de la secuencia SEC ID Nª5 y unos nucleótidos
localizados en posición 4936 a 4957 de la secuencia SEC ID nº 5.
El bucle de la horquilla está constituido por la
secuencia que va del nucleótido en posición 4931 al nucleótido en
posición 4935 de la secuencia SEC ID nº 5.
La estructura en horquilla está seguida por la
secuencia TATTTTAATT.
Cada una de las secuencias funcionales
comprendida en el operón 1,3-propanodiol de
secuencia SEC ID nº 5, tal como se ha descrito anteriormente, puede
ser utilizado individualmente, por ejemplo por inserción en un
vector de clonado y/o de expresión, ya se trate de una de las
regiones que codifican para un polipéptido de la invención o
también de una región reguladora (promotor o terminador de
transcripción).
Dichas secuencias nucleotídicas de interés
pueden ser obtenidas según unas técnicas bien conocidas por el
experto en la materia tales como la utilización de enzimas de
restricción, cuya utilización se describe en detalle en la obra de
SAMBROOK et al. (1989) o también por amplificación selectiva
de la secuencia diana de interés, por ejemplo por PCR.
Forman también parte de la invención los ácidos
nucleicos que hibridan, en unas condiciones de hibridación de alta
astringencia, con un ácido nucleico elegido entre las secuencias
nucleotídicas SEC ID nº 1 a SEC ID nº 5.
Por "condiciones de hibridación de alta
astringencia" en el sentido de la presente invención, se
entienden las condiciones de hibridación siguientes:
- -
- prehibridación de los filtros durante 8 horas a 65ºC en un tampón compuesto por 6 x SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7,5); 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% FICOLL, 0,02% SAB y 500 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado;
- -
- hibridación de los filtros durante 48 horas a 65ºC en presencia de tampón 1 x SSC correspondiente a 0,15 M de NaCl y 0,05 de citrato de sodio;
- -
- tres lavados de los filtros en una solución que contiene un tampón 2 x SSC y 0,1% SDS a 68ºC durante 15'.
Las condiciones de alta astringencia definidas
anteriormente están adaptadas para la hibridación de una molécula de
ácido nucleico de una longitud de 20 nucleótidos.
No es necesario decir que estas condiciones de
hibridación deben ser adaptadas en función de la longitud del ácido
nucleico cuya hibridación se busca, según unas técnicas bien
conocidas por el experto en la materia.
Las condiciones convenientes de hibridación
pueden por ejemplo ser adaptadas según las enseñanzas contenidas en
la obra de HAMES & HIGGINS (1985) o también en la obra de
SAMBROOK et al; (1989).
Forman también parte de la invención los ácidos
nucleicos que comprenden por lo menos 20 nucleótidos consecutivos de
un polinucleótido elegido entre las secuencias nucleotídicas SEC ID
nº 1 a SEC ID nº 5.
Dichos ácidos nucleicos comprenden
ventajosamente 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 150, 200 a 250, 300,
400, 500 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido elegido
entre las secuencias nucleotídicas SEC ID nº 1 a SEC ID nº 5.
Dichos ácidos nucleicos pueden comprender por
ejemplo 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 150, 200 a 250, 300, 400, 500
nucleótidos consecutivos de un polinucleótido elegido entre las
secuencias nucleotídicas SEC ID nº 1 a SEC ID nº 5.
Dichos ácidos nucleicos pueden ser en particular
útiles como sondas o iniciadores nucleotídicos a fin de detectar la
presencia de cualquiera de las secuencias nucleotídicas de SEC ID nº
1 a SEC ID nº 5 en una muestra.
Dichas sondas o iniciadores nucleotídicos pueden
ser en particular útiles a fin de medir la expresión de uno
cualquiera de los productos de transcripción de las regiones
codificantes orf11, orf12 o dhat según unas técnicas
bien conocidas por el experto en la materia.
A fin de mejorar aún la capacidad de los
huéspedes celulares transformados con un ácido nucleico según la
invención para producir 1,3-propanodiol a partir de
glucosa, dicho huésped celular recombinante podrá además ser
transformado con uno o varios genes que codifican para una o varias
enzimas aptas para catalizar la transformación de la glucosa en
glicerol.
Un par de enzimas capaces de efectuar la
transformación de la glucosa en glicerol es por ejemplo una
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa y
una glicerol-3-fosfatasa.
Así, un ácido nucleico según la invención podrá
comprender, además de las secuencias que codifican respectivamente
para la glicerol deshidratasa independiente de la coenzima B12 y la
1,3-propanodiol deshidrogenasa (dhaT), un tercer
ácido nucleico que codifica para una
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa y
un cuarto ácido nucleico que codifica para una
glicerol-3-fosfatasa.
Podrán emplearse en particular un ácido nucleico
que codifica para la gpd1
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa y
un cuarto ácido nucleico que codifica para la gpp2
glicerol-3-fosfatasa.
La gpd1 está por ejemplo descrita por LARSSON
et al. (1993). Mol. Microbiol., 10,
1101-1111.
La gpd2 está por ejemplo descrita por HIRAYAMA
et al. (1995). Mol. Gen. Genet., 249,
127-138.
Según aún otro aspecto, la invención se
refiere a un vector recombinante de clonado y/o de expresión que
comprende un ácido nucleico que codifica para una glicerol
deshidratasa independiente de la coenzima B12 o una
1,3-propanodiol deshidrogenasa según la
invención.
Un vector recombinante de este tipo comprenderá
ventajosamente una secuencia promotora, constitutiva o inducible,
capaz de dirigir la expresión de la glicerol deshidratasa
independiente de la coenzima B12 y/o de la
1,3-propanodiol deshidrogenasa y un terminador de
transcripción Rho-independiente.
Se puede tratar por ejemplo de un vector
lanzadera capaz de replicarse en diferentes huéspedes celulares.
Un primer vector recombinante preferido según la
invención es el plásmido pSPD 5 contenido en la cepa de
Escherichia coli depositada en la Colección Nacional de
Cultivos de Microorganismos (CNCM) el 24 junio 1999 con el nº de
acceso I-2243.
Otros vectores preferidos según la invención son
por ejemplo los siguientes:
- \bullet
- los vectores pTPG(-) y pOPG representados en las figuras 3 y 4,
- \bullet
- los vectores pSGD y pPPF2 representados en las figuras 5 y 6;
\newpage
- \bullet
- unos vectores que poseen el replicón del pCB101, tal como el vector pCTC511 (WILLILAMS et al., 1990) o también el vector pSYSL2 (LEE et al., 1992),
- \bullet
- un vector lanzadera que soporta el replicón pAM\beta1 de Enterococus faecalis DS-5, tal como el vector pCTC41 (WILLIAMS et al., 1990);
- \bullet
- los vectores lanzaderas E. coli B. Subtitlis/c. acetobutylicum designados pKNT11 y pKNT14 (TRUFFAUT et al., 1989).
La invención se refiere también a una célula
huésped recombinante que comprende un ácido nucleico o un vector
recombinante según la invención.
Dicha célula huésped recombinante comprende
ventajosamente un ácido nucleico que codifica para la glicerol
deshidratasa independiente de la coenzima B12 o también un vector
que contiene un ácido nucleico de este tipo.
Preferentemente, dicha célula huésped
recombinante comprenderá un ácido nucleico que codifica a la vez
para las dos subunidades proteínicas de la glicerol deshidratasa
independiente de la coenzima B12 así como para la DHAT.
Puede tratarse indiferentemente de una bacteria,
de un hongo o de una levadura.
Una célula huésped recombinante bacteriana será
elegida preferentemente entre Escherichia coli, Clostridium o
también Bacillus, lactobacillus y lactococcus.
Una célula de levadura recombinante según la
invención será preferentemente de la cepa Saccharomyces
cerevisiae.
Una célula huésped recombinante preferida según
la invención es la cepa de Escherichia coli depositada en la
Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) el 24 de
junio de 1999 con el nº de acceso I-2243.
La invención tiene también por objeto los
polipéptidos que constituyen respectivamente una y la otra de las
dos subunidades proteínicas constitutivas de la glicerol
deshidratasa dimérica independiente de la coenzima B12 según la
invención.
Preferentemente, un polipéptido según la
invención se presenta en forma aislada o purificada.
La invención se refiere también a un
polipéptido que constituye la enzima 1,3-propanodiol
deshidrogenasa de Clostridium butyricum.
Más particularmente, la invención se refiere a
un polipéptido que comprende la totalidad o parte de una secuencia
de ácidos aminados que tienen por lo menos 50% de identidad en
ácidos aminados con la secuencia SEC ID nº 6 o SEC ID nº 7.
La invención se refiere también a una proteína
dimérica compuesta por un primer polipéptido que tiene por lo menos
50% de identidad en aminoácidos con el polipéptido de secuencia SEC
ID nº 6 y de un segundo polipéptido que tiene por lo menos 50% de
identidad en aminoácidos con el polipéptido de la secuencia SEC ID
nº 7.
De forma totalmente preferida, dicho polipéptido
presenta una actividad catalítica glicerol deshidratasa que no
necesita la presencia de la coenzima B12, pudiendo dicha actividad
catalítica ser medida de acuerdo con los ejemplos.
Otro objeto de la invención consiste en un
polipéptido que comprende la totalidad o parte de una secuencia de
ácidos aminados que tiene por lo menos 80% de identidad en ácidos
aminados con la secuencia SEC ID nº 8.
De forma totalmente preferida, un polipéptido de
este tipo presenta una actividad catalítica de
1,3-propanodiol deshidrogenasa.
La invención se refiere también a un
procedimiento de producción de un polipéptido según la invención,
caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- a)
- preparación de un vector de expresión recombinante según la invención;
- b)
- introducción del vector de expresión recombinante de la etapa a) en una célula huésped apropiada;
- c)
- cultivo de la célula huésped recombinante de la etapa b) en un medio de cultivo apropiado;
- d)
- recuperación del polipéptido recombinante producido en el sobrenadante de cultivo o en el lisado celular;
- e)
- en caso necesario, purificación del polipéptido recuperado.
\newpage
Los polipéptidos según la invención pueden ser
purificados por ejemplo por paso sobre una columna de cromatografía
de afinidad con iones níquel o cobre.
Estos polipéptidos pueden además estar
caracterizados por su actividad enzimática glicerol deshidratasa o
1,3-propanodiol deshidrogenasa, como se ha indicado
en los ejemplos.
Los polipéptidos según la invención pueden
también ser purificados por ejemplo por cromatografía líquida de
alto rendimiento tales como unas cromatografías HPLC en fase inversa
y/o de intercambio catiónico.
Forman parte también de la invención los
polipéptidos que comprenden unas modificaciones de ácidos aminados
que tienen de 1, 2, 3, 4, 5, 10 a 20 sustituciones, adiciones o
deleciones de un ácido aminado con respecto a la secuencia de una u
otra de las dos subunidades proteínicas de la glicerol deshidratasa
independiente de la coenzima B12 o de la
1,3-propanodiol deshidrogenasa.
De forma totalmente preferida, las
modificaciones de ácidos aminados en un polipéptido de la invención,
con respecto a los polipéptidos de referencia, no inducirán un
cambio importante en su actividad biológica. Así, las
modificaciones en la secuencia de ácidos aminados de las subunidades
proteínicas de la glicerol deshidratasa independiente de la
coenzima B12 según la invención serán tales que la actividad
catalítica será por lo menos igual a 50% de la actividad catalítica
inicial y estará preferentemente mejorada con respecto a la
actividad catalítica inicial.
Es lo mismo para las modificaciones de ácidos
aminados en la secuencia proteínica de la
1,3-propanodiol deshidrogenasa según la
invención.
Cualquiera de los polipéptidos según la
invención o también un fragmento peptídico de éste pueden ser
utilizados para la preparación de anticuerpos dirigidos
específicamente contra este último.
Constituye también un objeto de la invención un
polipéptido que comprende por lo menos 20 ácidos aminados
consecutivos de una secuencia de ácidos aminados elegida entre las
secuencias SEC ID nº 6 a SEC ID nº 8.
Ventajosamente, dicho polipéptido comprenderá de
20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 a 100, 125, 150 ó 200 ácidos aminados
consecutivos de un polipéptido elegido entre las secuencias SEC ID
nº 6 a SEC ID nº 8.
Preferentemente, un polipéptido de este tipo
comprenderá 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125,
150, 175, 200, 250 ó 300 ácidos aminados consecutivos de un
polipéptido elegido entre las secuencias de ácidos aminados SEC ID
nº 6 a SEC ID nº 8.
Dichos anticuerpos específicos pueden ser
utilizados en unos tests de inmunodetección que permiten determinar
la presencia de una glicerol deshidratasa independiente de la
coenzima B12 o de una 1,3-propanodiol
deshidrogenasa en una muestra.
Dicho test de inmunodetección representa una
alternativa a la determinación de la actividad glicerol deshidratasa
o 1,3-propanodiol deshidrogenasa en una muestra que
se sospecha contiene estas enzimas.
Por "anticuerpos" el sentido de la
invención, se entenderán los anticuerpos policlonales pero también
unos anticuerpos monoclonales tales como los preparados a partir de
hibridomas según la técnica descrita por KOHLER & MILSTEIN
(1975).
Constituyen también unos anticuerpos en el
sentido de la presente invención, unos fragmentos de anticuerpos
(Fab', F(ab')_{2} así como unos fragmentos de anticuerpos
de cadena simple Fv (patente US Nº4.946.778; MARTINEAU et
al., (1998)) o también unos anticuerpos humanizados (REINMANN
et al., 1997; LEGER et al. 1997).
La invención será además ilustrada, sin en
cambio estar limitada, por las figuras y los ejemplos
siguientes.
La figura 1 representa un esquema de la vía
metabólica de bioconversión del glicerol en
1,3-propanodiol en la bacteria Clostridium
butyricum.
La figura 2 ilustra la construcción del vector
pSPD5.
La figura 3 ilustra la construcción del vector
pTPG (-).
La figura 4 ilustra la construcción del vector
pOPG.
La figura 5 ilustra la construcción del vector
pSGD.
La figura 6 ilustra la construcción del vector
pPPD2.
La figura 7 ilustra la producción de
1,3-propanodiol a partir del glicerol por la cepa de
Clostridium acetobutylicum DG1 (pSPD5).
La figura 8 ilustra la producción de
1,3-propanodiol a partir del glicerol por la cepa
de E. coli DH5\alpha transformada por el vector pSPD5 y
cultivada en anaerobiosis.
La figura 9 ilustra la producción de
1,3-propanodiol a partir del glicerol por la cepa no
recombinada de Clostridium butyricum VPI 1718.
La figura 10 ilustra la producción de
1,3-propanodiol a partir de glucosa por la cepa de
C-acetobutylicum DG1 [pSPD5].
La cepa de Clostridium butyricum a partir
de la cual han sido aisladas y caracterizadas las diferentes
secuencias de ácidos nucleicos según la invención es la cepa VPI
1718.
La cepa de Clostridium acetobutylicum
utilizada para la transformación con los diferentes vectores
descritos en los ejemplos es la cepa disponible en la American Type
Culture Collection con el nº ATCC824.
La cepa de Escherichia coli DH5\alpha
utilizada para la transfección con los diferentes plásmidos
descritos en los ejemplos es la cepa disponible en LIFE TECHNOLOGIES
Inc.
El plásmido pUC18, de un tamaño de 2,7kb ha sido
descrito por YANNISCH-PERRON et al.
(1985).
El plásmido pIMPI, de un tamaño de 4,9 kb ha
sido descrito por MERMELSTEIN (1992).
El plásmido pSOS95, de un tamaño de 7 kb ha sido
descrito por SOUCAILLE y PAPOUTSAKIS (1996).
Para el cultivo de la cepa Escherichia
coli, el medio LB (descrito en SAMBROOK et al., 1989) es
suplementado con unos antibióticos (ampicilina a 100 \mug/ml,
eritromicina a 300 \mug/ml, cloranfenicol a 35 \mug/ml).
Los cultivos de las cepas Clostridium, en
particular de las cepas de Clostridium butyricum o de las
cepas de Clostridium acetobutylicum DGI transformadas por el
vector pSPD5 han sido realizados en el medio siguiente, cuya
composición viene dada para 1 litro de medio de cultivo:
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
extracto de levadura \+ \hskip1.5cm \+ 4 g\cr glicerol
\+ \+ 60 g\cr KH _{2} PO _{4} \+ \+ 0,5 g\cr K _{2} HPO _{4} \+
\+ 0,5 g\cr MgSO _{4} \+ \+ 0,2 g\cr NH _{4} Cl \+ \+ 1,5 g\cr
FeSO _{4} \+ \+ 10 mg\cr biotina \+ \+ 0,04 mg\cr ácido
paraaminobenzoico \+ \+ 8
mg\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
El pH es ajustado a 6 por adición de amonio y la
temperatura de crecimiento es de 37ºC.
La claritromicina es añadida a una concentración
de 40 mg/l para el cultivo de la cepa C. acetobutylicum D61
(pSPP5).
El conjunto de los substratos (glucosa y
glicerol) y de los productos (acetato, butirato, lactato,
1,3-propanodiol) son dosificados por cromatografía
líquida de alto rendimiento (CLHP).
El aparato CLHP (bomba modelo 5810, Waters) está
provisto de un cambiador de muestras automático (SP 8775, Spectra
Physic.) que posee un bucle de inyección de 20
\mul, de un integrador (Intersmat ICR 1B, Shimadzu) y de un
refractómetro (HP 1047A).
La separación se obtiene por paso sobre una
columna con exclusión de iones (Aminex R HPX-87H,
300 mm x 7,8 mm, Biorad) equipada con una precolumna
(Micro-Guard, Biorad) provista con la misma resina
iónica H^{+}.
La fase móvil está constituida por ácido
sulfúrico a 0,031 mM, el flujo es de 0,7 ml por minuto y la
separación se realiza a temperatura ambiente.
La dosificación de la
1,3-propanodiol deshidrogenasa ha sido realizada en
un volumen de 1 ml del medio reacción siguiente:
| 1,3-propanodiol | \hskip2cm | 100 mM |
| NAD^{+} | 2 mM | |
| DTT | 2 mM | |
| (NH_{4})_{2}SO_{4} | 30 mM | |
| K_{2}CO_{3} | 100 mM | |
| extracto celular: ensayos sobre 5 \mul, 10 \mul, 50 \mul | ||
| H_{2}O completado a 1 ml |
La reducción del NAD^{+} es seguida por la
medición de la densidad óptica a la longitud de onda de 340
nanómetros.
El coeficiente de extinción
\varepsilon(NADH) es de 6,22 mM^{-1} x cm^{-1}.
La dosificación de la glicerol deshidratasa se
ha realizado sobre un extracto celular previamente pasado sobre una
columna de desalado. Esta dosificación se realiza en un volumen 1 ml
del medio de reacción siguiente:
| KCl | \hskip2cm | 0,05 M |
| 1,2-propanodiol | 0,06 M | |
| tampón KPO_{4} pH 7 | 0,035 M | |
| extracto celular ensayo sobre 5 \mul, 10 \mul, 20 \mul, 30 \mul. | ||
| H_{2}O completado a 1 ml |
La reacción es parada después de 10 minutos a
37ºC con la ayuda de 1 ml de tampón citrato con 100 mM pH 3,6 y 500
\mul de MBTH a 0,1%.
Después de 15 minutos a 37ºC, se añade 1 ml de
agua y el porcentaje de propionaldehído formado es determinado por
medición de la densidad óptica a la longitud de onda de 305
nanómetros.
El coeficiente de extinción molar para el
producto formado es de 13,3 x
10^{3} M^{-1} x cm^{-1}.
El crecimiento bacteriano es seguido por la
medición, en unas fracciones alícuotas extraídas en unos tiempos
determinados, de la densidad óptica a la longitud de onda de 620
nanómetros para un trayecto óptico de 1 cm. Se ha considerado que
una unidad de densidad óptica corresponde a aproximadamente 3 x
10^{8} bacterias/ml.
La cepa de E. Coli DH5a se hace
competente según el protocolo establecido por INOUE et al.
(1990). Este protocolo permite obtener unas eficacias de
transformación del orden de 10^{8} a 10^{9} transformantes/mg de
pUC18. Las células hechas competentes son a continuación conservadas
a -80ºC. La transformación de las células competentes por un
plásmido se realiza por choque térmico (SAMBROOK et al.,
1989).
El plásmido a introducir en C.
Acetobutylicum (ATCC 824 ó DG1) debe ser previamente metilado al
nivel de los lugares Cac8241 (= Bsofl). La metilación in vivo
se realiza introduciendo el plásmido a metilar en la cepa E.
coli ER 2275 que soporta el plásmido pAN1 (que contiene el gen
que codifica para la metilasa del fago f3TI de Bacillus
subtilis). La preparación de ADN plasmídico utilizada para
transformar C. Acetobutyilicum debe ser muy pura, purificada
por ultracentrifugación sobre gradiente de cloruro de cesio
(SAMBROOK et al., 1989) o utilizando el equipo Qiafilter
Plasmid Midiprep (QIAGEN).
Las transformaciones se realizan en anaerobiosis
estricta según el protocolo siguiente, adaptado del de MEMMERLSTEIN
(1992). Las eficacias son también muy bajas, del orden de 10^{2}
transformantes por mg de ADN.
A partir de un precultivo en medio CGM (10 ml) a
37ºC en una noche,
Inocular el 10% 50 ml de medio 2YTG.
Parar el cultivo con DO600 de 1,0 a 1,2.
A partir de este momento, el conjunto de las
manipulaciones se realizan en la campana anaerobia y en hielo.
Centrifugar las células durante 10 min a 4000
g.
Lavar el residuo celular en 10 ml de tampón de
electroporación.
Centrifugar 10 min a 3000-4000
g.
Suspender de nuevo las células en 500 ml de
tampón de electroporación.
La suspensión de células es puesta en contacto
con el plásmido (5 a 10 mg de ADN plasmídico disuelto en 5 a 50 ml
de tampón TE) previamente introducido en la cubeta de
electroporación (de 0,4 cm de espesor). Todo ello es conservado en
hielo.
La mezcla es inmediatamente sometida a una
descarga eléctrica con los parámetros siguientes: V = 2500 V, C =
25 mF, y R infinita (BioRad Gene pulser II y Gene controller II). En
estas condiciones, el tiempo de la descarga suministrada varía de 7
a 12 ms.
Las células son a continuación inmediatamente
transferidas en 10 ml de medio 2 YTG y puestas a incubar a 37ºC
hasta el reemprendido del metabolismo (formación de burbujas de
dióxido de carbono y de hidrógeno).
El cultivo es entonces centrifugado y el residuo
celular tomado de nuevo en un volumen mínimo del mismo medio. La
suspensión es a continuación extendida sobre el medio RCA con
antibiótico.
Composición del tampón de electroporación:
| Sacarosa | 270 mM | |
| Tampón fosfato (Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4}), pH 7,4 | 3 mM |
Los iniciadores nucleotídicos siguientes han
sido sintetizados, a fin de amplificar una secuencia nucleotídica
que contienen a la vez orf11, orf12 y dhaT, es
decir el conjunto de las secuencias que codifican a la vez para las
dos subunidades proteínicas de la glicerol deshidratasa
independiente de la coenzima B12 y de la
1,3-propanodiol deshidrogenasa, de Clostridium
butyricum.
El iniciador PDH3 (SEC ID nº 9) incluye el lugar
BamHI, el lugar de unión a los ribosomas y el inicio del
orf11.
El iniciador PDH4 (SEC ID nº 10) híbrida con la
rama complementaria y contiene el sitio SmaI y el final del gen
dhaT.
Se ha realizado una reacción de amplificación
con los iniciadores pDH3 y PDH4 sobre el ADN genómico de
Clostridium butyricum en las condiciones siguientes:
- \bullet
- temperatura de aparejamiento de los iniciadores: 55ºC;
- \bullet
- duración de alargamiento: 4 minutos;
- \bullet
- número de ciclos: 15 ciclos.
La reacción de amplificación ha sido realizada
con el equipo Expand Long Template PCR (comercializado por
Boehringer).
Esta reacción ha permitido amplificar un
fragmento del tamaño esperado de 4,6 kb.
Este fragmento amplificado ha sido purificado
sobre gel de agarosa y después digerido por las enzimas BamHI y
SmaI.
En paralelo, el fragmento
BamHI-EheI de 4970 pb del vector lanzadera E.
coli/C. Acetobutylicum pSOS95 ha sido purificado sobre gel de
agarosa y después ligado con el producto PCR de 4,6 kb. El vector
recombinante así construido, llamado pSPD5 (figura 2), permite la
expresión constitutiva de los genes orf11, orf12 y dhaT bajo el
control del promotor del gen de la tiolasa de C.
Acetobutylicum.
Los vectores pTPG(-) y pOPG son unos vectores
derivados del vector lanzadera E.
Coli-clostridium pTLH1 (Harris et al.,
1999) que permiten a una célula huésped adecuada realizar la
conversión directa de la glucosa en 1,3-propanodiol.
Esencialmente, permiten la expresión de los genes orf11,
orf12 y dhaT de C. Butyricum (operón
1,3-propanodiol) así como la de los genes GPD1 y
GPD2 de S. Cerevisae que codifican respectivamente para la
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa y
la glicerol-3-fosfatasa (operón
artificial gly, soportado por el plásmido pS2 (GELIS et
al., 1999) derivado del plásmido pSOS95, que permite en E.
Coli y C. Acetobutylicum la conversión de la glucosa en
glicerol). Estos dos plásmidos se diferencian por la organización de
estos genes, en dos operones (1,3-propanodiol y
gly) en pTPG(-), y sobre un mismo operón en pOPG.
En un primer tiempo, el fragmento SalI de
4,9 kpb del plásmido pSPD5 que contiene la totalidad del operón
1,3-propanodiol ha sido purificado sobre gel de
agarosa y después ligado al vector-lanzadera pTLH1
digerido por SalI, para obtener el plásmido pTLP de 10,6
kpb.
En paralelo, los iniciadores nucleotídicos
OPGLY-D y OPGLY-R han sido
sintetizados a fin de amplificar la totalidad del operón artificial
gly.
El iniciador OPGLY-D incluye el
lugar SmaI así como el inicio del operón artificial
gly. Su secuencia es la si-
guiente:
guiente:
- 5'-GTTACCCGGGGCTCCTGCAGCTCGACTTTTTAAC-3'
El iniciador OPGLY-R híbrida con
la rama complementaria e incluye el lugar SmaI así como el
final del operón artificial gly. Su secuencia es la
siguiente:
- 5'-TTTCACCCGGGAAACAGCTATGACCATGATTACG-3'
Se ha realizado una reacción de amplificación
con los iniciadores OPGLY-D y
OPGLY-R sobre el plásmido pS2, en las condiciones
siguientes:
- -
- temperatura de aparejamiento de los iniciadores: 48ºC,
- -
- duración de alargamiento: 3,5 min
- -
- número de ciclos: 10.
La reacción ha permitido amplificar un fragmento
del tamaño esperado de 2,2 kpb.
Este fragmento amplificado ha sido purificado
sobre gel de agarosa y digerido por la enzima SmaI, y después
ligado al plásmido pTLP linealizado por SmaI para
proporcionar el plásmido pTPG(-) de 12,8 kpb (figura 3).
En un primer tiempo, el fragmento
PvuII-PstI de 2,2 kpb del plásmido pS2 que contiene la
totalidad del operón glicerol ha sido purificado sobre gel de
agarosa y después ligado al fragmento
SmaI-PstI de 5,7 kpb del
vector-lanzadera pTLH1, para obtener el plásmido
pTLG1 de 7,9 kpb.
\newpage
En paralelo, los iniciadores nucleotídicos
dhaT-F y dhaT-R han sido
sintetizados a fin de amplificar el extremo 5' del gen
dhaT.
El iniciador DHAT-F incluye el
lugar BamHI así como la región central del gen dhaT.
Su secuencia es la siguiente:
- 5'-TTGGATCCAGTATCTATAAATGATCCAATGC-3'
El iniciador DHAT-R hibrida con
la rama complementaria e incluye el lugar BglII así como el
final del gen dhaT. Su secuencia es la siguiente:
- 5'-TTAGATCTTTTAAATAGTATTAATTAATAAGCAGCC-3'
Se ha realizado una reacción de amplificación
con los iniciadores dhaT-F y dhaT-R
sobre el plásmido pSPD5, en las condiciones siguientes:
- -
- temperatura de aparejamiento de los iniciadores: 48ºC
- -
- duración del alargamiento: 1 min
- -
- número de ciclos: 10.
La reacción ha permitido amplificar un fragmento
del tamaño esperado de 0,65 kpb.
Este fragmento amplificado ha sido purificado
sobre gel de agarosa y digerido por las enzimas BamHI y
BglII, y después ligado al plásmido pTLG1 linealizado por
BamHI para producir el plásmido pTPG de 8,55 kpb.
En un último tiempo, el fragmento
BamHI-SbfI de 4,0 kpb del plásmido pSPD5 ha sido
purificado sobre gel de agarosa y después ligado al fragmento
BamHI-SbfI de 8,55 kpb del plásmido pTPG para obtener
el plásmido pOPG de 12,55 kpb (figura 4).
El vector pSGD es derivado del plásmido
pSPD5.
Esencialmente, el vector pSGD expresa
funcionalmente orf11 y orf12 (que codifican
respectivamente para la primera y la segunda subunidades proteínicas
de la glicerol deshidratasa) y contiene una deleción en la región
que codifica para DHAT (1,3-propanodiol
deshidrogenasa).
El vector pSPD5 ha sido sometido a una digestión
por la enzima de restricción SbfI y el fragmento de 4082 pb
purificado sobre gel de agarosa.
Ha continuación se ha procedido a una digestión
del vector pSOS95 por la enzima de restricción PstI y el fragmento
de 4858 pb purificado sobre gel de agarosa.
Estos dos fragmentos han sido a continuación
ligados a fin de obtener el plásmido pSGD.
El vector pPPD2 es un vector derivado del
plásmido pSPD5 capaz de expresar el gen dhat (que codifica
para la 1,3-propanodiol deshidrogenasa) y en el cual
orf11 (que codifica para la primera subunidad de la glicerol
deshidratasa) ha sido completamente delecionado así como 100 pb en
el extremo 5' de orf12 (que codifica para la segunda
subunidad de la glicerol deshidratasa).
El vector pSPD5 ha sido digerido en principio
simultáneamente por las enzimas de restricción BamHI y MfeI.
El fragmento BamHI-MfeI de 6326
pb obtenido por la doble digestión con la ayuda de las endonucleasas
de restricción correspondientes ha sufrido un tratamiento en
presencia de ADN polimerasa T4 a fin de obtener unos extremos
francos.
El fragmento ha sufrido entonces un religado
sobre sí mismo a fin de obtener el plásmido pPPD2.
La cepa de Clostridium acetobutylicum DGI
transformada con el plásmido pSPD5 como se ha descrito en la parte
Materiales y Procedimientos ha sido puesta en cultivo en presencia
de glicerol durante unos tiempos determinados y diferentes
parámetros han sido seguidos en el curso de la fermentación:
- -
- el crecimiento bacteriano ha sido seguido por medición de la densidad óptica a la longitud de onda de 620 nanómetros y está representada en la figura 6 por los círculos abiertos;
- -
- la concentración de glicerol ha sido seguida a todo lo largo de la fermentación y está representada en la figura 7 por los cuadrados macizos;
- -
- la síntesis de 1,3-propanodiol ha sido también seguida a todo lo largo de la fermentación y está representada por lo círculos macizos;
- -
- asimismo la concentración de acetato y de butirato ha sido medida todo a lo largo de la fermentación y está representada en la figura 7 respectivamente por los triángulos abiertos con la punta hacia arriba o la punta hacia abajo.
Los resultados presentados en la figura 7
muestran que una cantidad significativa de
1,3-propanodiol es sintetizada por la cepa de
Clostridium acetobutylicum DGI transformada por el plásmido
pSPD5 desde las cuatro primeras horas de cultivo. Al cabo de 20
horas de fermentación, puede ser observada la producción de 38 g/l
de 1,3-propanodiol. La producción de
1,3-propanodiol alcanza un escalón en los
alrededores de 18 horas después del inicio de la fermentación,
siendo este escalón de producción esencialmente debido al hecho de
que casi la totalidad del glicerol inicial ha sido consumida por la
bacteria transformada.
Es importante observar que la cepa C.
Acetobutylicum DG1 transformada por el plásmido de control pIMP1
que no contienen las regiones que codifican para la glicerol
deshidratasa y la 1,3-propanodiol deshidrogenasa
(Memmerlstein, 1992) no se desarrolla sobre el medio de cultivo con
el glicerol como única fuente carbonada y por tanto no produce
1,3-propanodiol (Tabla 1).
Una cepa de Escherichia coli DH5\alpha
ha sido transformada con el vector pSPD5, como se ha descrito en la
parte Materiales y Procedimientos.
La cepa de Escherichia coli transformada
con el plásmido pSPD5 ha sido puesta en cultivo en anaerobiosis
sobre medio LB suplementado con glicerol (40 g/l) y con eritromicina
(300 \mug/ml), la producción de 1,3-propanodiol ha
sido medida en unos tiempos determinados.
Los resultado están reunidos en la figura
8.
Los resultados de la figura 8 muestran que una
producción significativa de
1,3-propanodiol se obtiene desde las primeras horas
de fermentación. Después de 80 horas de fermentación, se ha
observado una producción de aproximadamente 4,5 g/l de
1,3-propanodiol.
La cepa de control E. Coli
DH5\alpha[pIMP1] cultivada sobre el mismo medio no conduce
a la producción de 1,3-propanodiol (Tabla 1).
| 1,3-propanediol (g/l) | |
| E. Coli DH5\alpha (pIMP1) | 0 |
| E. Coli DH5\alpha(pSPD5) | 4,5 |
| C. Acetobutylicum DG1 (pIMP1) | sin crecimiento |
| C. Acetobutylicum DG1 (pSPD5) | 38 |
Los resultados de la tabla 1 muestran que una
producción significativa de 1,3-propanediol
(aproximadamente 5 g/l) se obtiene con la cepa de Escherichia
coli DH\alpha5 transfectada por el plásmido pSPD5, mientras
que la cepa de E. Coli transfectada con el plásmido testigo
pIMP1 no produce cantidad detectable de
1,3-propanodiol.
Con la construcción pSPD5, se observa una
cantidad de 1,3-propanediol aproximadamente 7,6
veces superior con la cepa Clostridium acétobutylicum con
respecto a la cepa de Escherichia coli DH5\alpha. Esto es
debido mayoritariamente al hecho de que las señales de regulación
del plásmido pSPD5 han sido optimizadas por la expresión del operón
1,3-propanediol en Clostridium
acetobutylicum.
Unas señales de regulación, tales como un
promotor muy activo en Escherichia coli son susceptibles de
permitir la obtención de cantidad de
1,3-propanodiol tan importantes en Escherichia
coli como la observada en Clostridium acetobutylicum.
La cepa de Clostridium butyricum VPI 1718
ha sido puesta en cultivo en presencia de glicerol y la síntesis de
1,3-propanodiol ha sido medida en unos tiempos
determinados a todo lo largo de la fermentación.
Los resultados están representados en la figura
9.
Los resultados de la figura 9 muestras que una
producción de 34 g/l de 1,3-propanodiol es observada
al cabo de 60 horas de fermentación.
Si se hace referencia a los resultados
representados en la figura 7, se puede observar que la producción
de 1,3-propanodiol por la cepa de Clostridium
acetobutylicum DG1 transformada por el plásmido pSPD5 es mucho
más rápida (22 horas contra 60 horas) y superior a la producción de
1,3-propanodiol obtenida con la cepa de
Clostridium butyricum que expresa naturalmente la glicerol
deshidratasa independiente de la coenzima B12 y la
1,3-propanodiol deshidrogenasa según la
invención.
Por otra parte, los niveles de actividad
catalítica, expresados en unidades por mg, de glicerol deshidratasa
y de 1,3-propanodiol deshidrogenasa han sido medidos
a la vez en Clostridium acetobutylicum y en Clostridium
butyricum.
Los resultados están representados en la tabla 2
DG1 [pSPD5] siguiente.
| Glicerol deshidratasa (U/mg) | 1,3-propanodiol deshidrogenasa (U/mg) | |
| C. acetobutylicum | 3,5 | 2,4 |
| DG1 (PSPD5) | ||
| crecimiento sobre glicerol | ||
| C. acetobutylicum | 0,01< | 0,005< |
| DG1 (pIMP1) | ||
| crecimiento sobre glucosa | ||
| C. butyricum | 0,45 | 0,56 |
| crecimiento sobre glicerol |
Los resultados presentados en la tabla 2 indican
que los niveles de actividad de la glicerol deshidratasa y de la
1,3-propanodiol deshidrogenasa expresados en la cepa
de Clostridium acetobutylicum transformada por el plásmido
pSPD5 son muy superiores (respectivamente 7,8 y 4,3 veces
superiores) a los niveles de actividad glicerol deshidratasa y
1,3-propanodiol deshidrogenasa expresados por la
cepa de Clostridium butyricum que producen naturalmente
estas enzimas.
Como control, una cepa de Clostridium
acétobutylicum transformada con el plásmido pIMPI que no
contiene las regiones que codifican para la glicerol deshidratasa y
la 1,3-propanodiol deshidrogenasa no produce una
cantidad detectable de estas dos enzimas, lo que muestra claramente
que la actividad observada en la cepa transformada por el plásmido
pSPD5 es únicamente debida a la expresión del operón
1,3-propanodiol según la invención.
\newpage
Los resultados presentados en la tabla 2
demuestran claramente el interés de transformar una cepa de
microorganismo que no produce naturalmente la glicerol deshidratasa
y la 1,3-propanodiol deshidrogenasa según la
invención con un vector recombinante tal como el vector pSPD5
puesto que es posible en este caso, por ejemplo por el empleo de
promotores apropiados, obtener unos niveles de expresión que no han
sido nunca alcanzados naturalmente.
| Medio MSL | ||
| Sales | g/l | |
| \hskip0.5cm - (NH_{4})_{2}SO_{4} | 5 | |
| \hskip0.5cm - MgSO_{4}, 7H_{2}O | 0,5 | |
| \hskip0.5cm - KH_{2}PO_{4} | 1 | |
| \hskip0.5cm - NaCl | 0,1 | |
| \hskip0.5cm - CaCl_{2}, 2H_{2}O | 0,1 | |
| Vitaminas | mg/l | |
| \hskip0.5cm - d-biotina | 0,02 | |
| \hskip0.5cm - Ca D(+)pantotenato | 0,4 | |
| \hskip0.5cm - mio-Inositol | 2,0 | |
| \hskip0.5cm - tiamina HCl | 0,4 | |
| \hskip0.5cm - piridoxina HCl | 0,4 | |
| \hskip0.5cm - p-ácido aminobenzoico | 0,2 | |
| \hskip0.5cm - ácido fólico | 0,02 | |
| \hskip0.5cm - niacina | 0,4 | |
| \hskip0.5cm - riboflavina | 0,2 | |
| Oligoelementos | mg/l | |
| \hskip0.5cm - ZnSO_{4}, 7H_{2}O | 0,4 | |
| \hskip0.5cm - MnSO_{4} | 0,4 | |
| \hskip0.5cm - CuSO_{4}, 5H_{2}O | 0,04 | |
| \hskip0.5cm - Na_{2}MoO_{4}, 2H_{2}O | 0,2 | |
| \hskip0.5cm - FeCl_{3}, 6H_{2}O | 0,2 | |
| \hskip0.5cm - H_{3}BO_{3} | 0,5 | |
| \hskip0.5cm - Kl | 0,1 | |
| Fuente de carbono | g/l | |
| \hskip0.5cm - glucosa | 10 | |
| \hskip0.5cm - glicerol | 10 | |
| \hskip0.5cm AA (drop-out) | g/l | |
| \hskip0.5cm - L Arg | 0,02 | |
| \hskip0.5cm - Thre | 0,05 | |
| \hskip0.5cm - L Tryp | 0,04 | |
| \hskip0.5cm - L Isoleu | 0,06 | |
| \hskip0.5cm - Lys | 0,04 | |
| \hskip0.5cm - Met | 0,01 | |
| \hskip0.5cm - Phe | 0,06 | |
| \hskip0.5cm - Tyr | 0,05 | |
| \hskip0.5cm - Adenina | 0,01 | |
| \hskip0.5cm - Ergosterol | 0,01 | |
| \hskip0.5cm - Tween 80 | 0,42 |
Los genes orf11, orf12 y dhat han
sido individualmente amplificados por PCR introduciendo gracias a
los iniciadores un lugar SmaI en el extremo 5' y un lugar
ApaI en el extremo 3'. Cada gen ha sido a continuación
introducido, gracias a estos dos lugares de restricción, en el
vector pYGK (CROUX y SOUCAILLE, 1999) que permite construir un
casete de expresión bajo el control del promotor del gen PGK
y del terminador del gen CYC1. Los tres genes en su casete
de expresión han sido a continuación extraídos de cada uno de los
vectores obtenidos anteriormente (pYGK11, pYGK12 y pYGKT) por
digestión NotI-SacII introducidos en tres
vectores multiméricos de la familia pRS42x que difieren por la
naturaleza de su marcador de selección (HIS3 para pRS423,
LEU2 para pRS425 y URA3 para pRS426) previamente
digeridos por las mismas enzimas de restricción. Cada uno de los
tres plásmidos obtenidos (pRSGK11, pRSGK12 y pRSGKT) ha sido a
continuación introducido en la cepa S. Cerevisae JF624
(leu2 ura3 lys2 trp1 his3) y seleccionado por
complementación de las 3 auxotrofias de esta cepa. La cepa S.
Cerevisae JF624 (pRSGK11, pRSGK12 y pRSGKT) y la cepa de control
S. Cerevisae JF624 (PRS423, PRS425, pRS426) han sido a
continuación cultivadas en anaerobiosis durante 36 horas en el medio
MSL.
Los resultados de la expresión de los genes del
operón 1,3-propanodiol cuyas cepas de S.
Cerevisiae JF624 descritas en el párrafo A.2 anterior se
presentan en la tabla 3 siguiente.
Los resultados de la tabla 3 muestran que la
cepa S. Cerevisiae JF624 que contiene las inserciones de los
genes orf11, orf12 y dhat insertados respectivamente
en los plásmidos pRSGK11, pRSGk12 y pRSGKT es capaz de producir
1,3-propanodiol a partir de una fuente de glicerol
sin adición de vitamina B12.
\vskip1.000000\baselineskip
| Etanol (g/l) | 1,3-propanodiol (g/l) | |
| S. Cerevisae JF624 | 4,5 | 0 |
| (pRS423, pRS425, pRS426) | ||
| S. Cerevisae JF624 | 4,8 | 0,1 |
| (pRSGK11, pRSGK12, pRSGKT) |
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa Clostridium acetobutylicum DG1
transformada por el plásmido pSPD5 como se ha descrito en la parte
Materiales y Procedimientos ha sido cultivada en presencia de
glucosa como única fuente carbonada y diferentes parámetros han sido
seguidos en el curso de la fermentación.
Los resultados están representados en la figura
10.
Los resultados de la figura 10 muestran una
síntesis, aunque débil (0,3 g/l) de 1,3-propanodiol,
mientras que la totalidad de la glucosa ha sido consumida. Esta
producción, debida a la presencia de una baja concentración de
glicerol intracelular en Clostridium acetobutylicum DG1
[pSPD5] demuestra sin embargo la realizabilidad de un procedimiento
de conversión directa de la glucosa en
1,3-propanodiol en una cepa que lleva los genes
reivindicados por la presente invención.
La cepa Bacillus subtilis 168
transformada por el plásmido pSPD5 como se ha descrito en la parte
Materiales y Procedimientos, ha sido cultivada sobre medio LB + 10
g/l glicerol + 20 mM nitrato + 2 \mug/ml eritromicina en
anarobiosis y comparada con la misma cepa transformada por el
plásmido de control pIMP1.
\newpage
Los resultados están representados en la tabla 4
siguiente.
| Acetato (g/l) | 2,3-butanodiol (g/l) | 1,3-propanodiol (g/l) | |
| B. subtilis 168 (pSPD5) | 0,84 | 1,2 | 0 |
| B. subtilis 168 (pSPD5) | 0,9 | 1,0 | 0,2 |
Los resultados de la tabla 3 muestran que la
expresión del operón 1,3-propanodiol en B.
Subtilis permite la producción de
1,3-propanodiol a partir de glicerol sin adición de
vitamina B12.
El plásmido pTPG(-) y el plásmido de control
pTLH1 han sido introducidos en la cepa E. Coli NZN 111
(pfl:cat, idh:kan), una cepa incapaz de producir formiato y
lactato en anaerobiosis. Estas dos cepas recombinantes han sido a
continuación cultivadas en anaerobiosis durante 48 horas en el medio
LB + glucosa + 10 \mug/ml de tetraciclina sin regulación de pH.
Los resultados presentados en la tabla 5 muestran que E. Coli
puede producir cantidades significativas de
1,3-propanodiol a partir de glucosa después de
transformación por el plásmido pTPG.
\vskip1.000000\baselineskip
| Acetato g/l | Succinato (g/l) | Glicerol (g/l) | 1,3 propanodiol (g/l) | |
| E. coli NZN111 (pTLH1) | 0,15 | 0,4 | 0 | 0 |
| E. coli NZN111 (pTPG) | 1,25 | 0,2 | 2,1 | 0,7 |
\vskip1.000000\baselineskip
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<110> INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE
AGRONOMIQUE (INRA)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de preparación del
1,3-propanodiol a partir de un microorganismo
recombinante, en ausencia de coenzima B12 o de uno de sus
precursores.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1,3-propanodiol
INRA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2364
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium butyricum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
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<211> 915
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<212> ADN
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<213> Clostridium butyricum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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<210> 3
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Clostridium butyricum
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<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskiptagataaaac aaacaaaaat gttattat
\hfill28
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<210> 4
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<211> 1158
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<212> ADN
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<213> Clostridium butyricum
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 4963
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<212> ADN
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<213> Clostridium butyricum
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 787
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<212> PRT
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<213> Clostridium butyricum
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<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 304
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<212> PRT
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<213> Clostridium butyricum
\newpage
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 385
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<212> PRT
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<213> Clostridium butyricum
\newpage
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\hskip1.5cm
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<210> 9
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatccg tgattggagg agtaaaaatg ataag
\hfill35
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<210> 10
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<211> 40
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Iniciador
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\hskip-.1em\dddseqskiptcccccgggg gaatccttta aatagtatta attaataagc
\hfill40
Claims (28)
1. Procedimiento de preparación del
1,3-propanodiol a partir de una sustancia carbonada,
comprendiendo dicho procedimiento por lo menos una etapa de
cultivo de un microorganismo recombinante en el cual ha sido
introducido por lo menos un ácido nucleico que codifica para las
dos subunidades de una glicerol deshidratasa cuya actividad
catalítica es independiente de la presencia de coenzima B12 o de uno
de sus precursores, estando esta proteína dimérica compuesta por un
primer polipéptido que tiene por lo menos 50% de identidad en
aminoácidos con el polipéptido de secuencia SEC ID nº 6 y por un
segundo polipéptido que tiene por lo menos 50% de identidad en amino
ácidos con el polipéptido de secuencia SEC ID nº 7.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la glicerol deshidratasa, cuya actividad
catalítica es independiente de la presencia de coenzima B12 o de uno
de sus precursores, es originaria de Clostridium
butyricum.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el
microorganismo recombinante comprende además un ácido nucleico que
codifica una 1,3-propanodiol deshidrogenasa, y de
forma preferida una 1,3-propanodiol deshidrogenasa
de Clostridium butyricum VPI 1718.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque la 1,3-propanodiol
deshidrogenasa es un polipéptido que tiene por lo menos 90% de
identidad en amino ácidos con el polipéptido de secuencia SEC ID nº
8.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la etapa de
cultivo del microorganismo recombinante se efectúa en ausencia de
coenzima B12 o de uno de sus precursores.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la sustancia
carbonada se elige entre los ósidos y los polioles.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque el ósido es la glucosa y el poliol es el
glicerol.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el
microorganismo se elige entre los microorganismos que no producen
naturalmente la coenzima B12 o uno de sus precursores.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque se trata de una bacteria, de una
levadura o de un hongo.
10. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque se trata de una bacteria que pertenece
al género Clostridium, Escherichia, Bacillus, Lactobacillus o
Lactococcus.
11. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque se trata de la levadura Saccharomyces
cerevisiae.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el
microorganismo recombinante comprende también unos ácidos nucleicos
que codifican respectivamente para una
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa y
una glicerol-3-fosfatasa.
13. Ácido nucleico que comprende por lo menos
30 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido que codifica para
por lo menos una subunidad de una glicerol deshidratasa cuya
actividad catalítica es independiente de la presencia de coenzima
B12 o de uno de sus precursores, comprendiendo dicho ácido nucleico
la totalidad o parte de un polinucleótido que tiene por lo menos
50% de identidad en nucleótidos con el polinucleótido de secuencia
SEC ID nº 1, o SEC ID nº 2 o un polinucleótido de secuencia
complementaria.
14. Ácido nucleico según la reivindicación 13,
caracterizado porque comprende un primer polinucleótido que
tiene por lo menos 50% de identidad en nucleótidos con el
polinucléotido de secuencia SEC ID nº 1 y un segundo polinucleótido
que tiene por lo menos 50% de identidad en nucleótidos con el
polinucleótido de secuencia SEC ID
nº 2.
nº 2.
15. Ácido nucleico según la reivindicación 14,
caracterizado porque comprende además una secuencia con
función de promotor de la transcripción, funcional en la célula
huésped en la cual la expresión del polinucleótido se busca.
16. Ácido nucleico según la reivindicación 15,
caracterizado porque la secuencia promotora es la secuencia
SEC ID nº 3 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad
en nucleótidos con esta última.
17. Ácido nucleico con función de promotor
bacteriano que comprende un polinucleótido que tiene por lo menos
80% de identidad en nucleótidos con la secuencia SEC ID nº 3, o un
polinucleótido de secuencia complementaria.
18. Ácido nucleico que comprende, del extremo 5'
hacia el extremo 3', un primer ácido nucleico según la
reivindicación 14, y un segundo ácido nucleico que comprende la
totalidad o parte de un polinucleótido que codifica para una
1,3-propanodiol deshidrogenasa que tiene por lo
menos 90% de identidad en nucleótidos con el polinucleótido de
secuencia SEC ID nº 4.
19. Ácido nucleico según la reivindicación 18,
caracterizado porque se trata de un polinucleótido que tiene
por lo menos 50% de identidad en nucleótidos con la secuencia
nucleotídica SEC ID nº 5.
20. Ácido nucleico según la reivindicación 18,
caracterizado porque comprende además un tercer ácido
nucleico que codifica para una
glicerol-3-fosfato deshidrogenasa y
un cuarto ácido nucleico que codifica para una
glicerol-3-fosfatasa.
21. Vector de clonado y/o de expresión
recombinante que comprende un ácido nucleico según una de las
reivindicaciones 14 a 20.
22. Vector recombinante según la reivindicación
21, caracterizado porque se trata del plásmido pSPD5
contenido en la cepa de Escherichia coli depositada en la
Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) el 24 de
junio 1999 con el Nº de acceso I-2243.
23. Célula huésped recombinante que comprende
un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 14 a 20 o un
vector recombinante según una de las reivindicaciones 21 y 22.
24. Célula huésped recombinante según la
reivindicación 23, caracterizada porque se trata de la cepa
Escherichia coli depositada en la Colección Nacional de
Cultivos de Microoganismos (CNCM) el 24 de junio 1999 con el Nº de
acceso I-2243.
25. Polipéptido codificado por un ácido
nucleico según una de las reivindicaciones 13 y 14, que comprende
por lo menos 20 ácidos aminados consecutivos de una secuencia de
ácidos aminados que tienen por lo menos 50% de identidad en ácidos
aminados con la secuencia SEC ID nº 6 o SEC ID nº 7.
26. Proteína dimérica compuesta por un primer
polipéptido que tiene por lo menos 50% de identidad en aminoácidos
con el polipéptido de secuencia SEC ID nº 6 y un segundo polipéptido
que tiene por lo menos 50% de identidad en aminoácidos con el
polipéptido de secuencia SEC ID nº 7.
27. Procedimiento de producción de un
polipéptido según una de las reivindicaciones 25 y 26,
caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- a)
- preparación de un vector de expresión recombinante según una de las reivindicaciones 21 y 22;
- b)
- introducción del vector de expresión recombinante de la etapa a) en una célula huésped apropiada;
- c)
- cultivo de la célula huésped recombinante de la etapa b) en un medio de cultivo apropiado;
- d)
- recuperación del polipéptido recombinante producido en el sobrenadante de cultivo o en el lisado celular;
- e)
- en caso necesario, purificación del polipéptido.
28. Anticuerpo dirigido específicamente contra
un polipéptido elegido entre los polipéptidos de secuencia en ácidos
aminados SEC ID nº 6 o SEC ID nº 7.
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