CN104628148B

CN104628148B - 一种铜绿假单胞菌荧光铁载体的新用途

Info

Publication number: CN104628148B
Application number: CN201410764152.9A
Authority: CN
Inventors: 张卫卫; 李成华; 梁伟康
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2014-12-12
Filing date: 2014-12-12
Publication date: 2017-07-18
Anticipated expiration: 2034-12-12
Also published as: CN104628148A

Abstract

本发明公开了一种铜绿假单胞菌荧光铁载体的新用途，特点是该荧光铁载体对2216E培养基或海水中灿烂弧菌生长可产生抑制作用，该荧光铁载体来自铜绿假单胞菌，通过铜NTA琼脂糖柱子进行亲和层析得到纯化的荧光铁载体，加入3%体积纯化的荧光铁载体到含有灿烂弧菌的2216E培养基中，30℃培养24小时，对灿烂弧菌的抑制率达到50%，加入1%体积纯化的荧光铁载体都含有灿烂弧菌的海水中，30℃孵育24小时，可完全抑制海水中灿烂弧菌的生长，优点是该铁载体可望在病原灿烂弧菌的抑制中发挥重要作用。

Description

一种铜绿假单胞菌荧光铁载体的新用途

技术领域

本发明涉及环境微生物领域，尤其涉及一种铜绿假单胞菌荧光铁载体的新用途。

背景技术

随着近年来集约化海水养殖业的迅速发展，相应的养殖问题也日益突出。集约化的海水养殖容易导致养殖生物病害的发生。细菌性病害对海水养殖业造成了巨大的经济损失。据有关统计表明，每年病害造成的海水养殖业损失高达12.5亿美元，损失严重。灿烂弧菌是广泛存在于海水环境中的条件致病菌，灿烂弧菌的致病性受宿主生理状况及环境条件等多种因素的影响。正常状态下灿烂弧菌不引发生物体疾病，但是当养殖环境处于水质不良因素的强烈刺激、机械损伤、寄生虫感染等应激状态时，可以导致大菱鲆幼鱼、大西洋鲑、鳟鱼、鲈鱼和海参等水产养殖动物发病。实际水产养殖中多采用抗生素的方法，对于灿烂弧菌的抑制，以前有报道用氟甲喹拌入饲料中投喂，每千克鱼每天投喂30 mg，可以有效地降低由灿烂弧菌引起的死亡。但是众所周知，抗生素等药物的使用能够引起病原的抗药性。病原抗药性的产生不仅能够降低疾病治疗的效果，而且还会对养殖环境中其他的非病原微生物或益生菌群产生很大的破坏作用，打破了养殖环境中微生物菌群的竞争和平衡，为疾病的再次爆发或其他疾病的爆发埋下了很大的隐患。同时，抗生素会在养殖生物体内蓄积，通过食物链进入人体，最终危害人类的健康。

铁离子是所有活细胞的必须元素，因此细菌利用铁离子是一个非常重要的生存机制。铁离子在宿主体内被高亲和性蛋白结合，而在外界环境中以不溶性氧化物形式存在，因此病原菌必须有一个有效的铁吸收系统，使其具感染性或在外界环境中生存。细菌的铁吸收系统主要通过两种普遍机制行使功能：一是通过细胞膜上的受体直接结合外源铁或血红素；二是合成和释放血红素载体、铁载体等可高效鳌合铁的分子到外界环境中摄取铁并转运至细胞膜上的受体。铜绿假单胞菌在外界铁离子浓度较低的条件下可分泌大量的荧光铁载体，该荧光铁载体的结构分为三部分：（1）保守的二羟基喹啉荧光环；（2）与发色团的氨基相结合的酰基侧链；（3）与发色团C1通过氨基结合的可变的多肽。目前，国内外还没有公开任何关于利用铜绿假单胞菌荧光铁载体抑制灿烂弧菌的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种铜绿假单胞菌荧光铁载体的新用途，该铜绿假单胞菌荧光铁载体可有效抑制水产养殖病原灿烂弧菌。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种铜绿假单胞菌荧光铁载体的新用途，所述的荧光铁载体在抑制灿烂弧菌生长方面的用途。

所述的荧光铁载体来源于一株铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PA1，该菌株由申请人于2011年04月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 4799。

所述的荧光铁载体纯化方法具体步骤如下：

（1）铜NTA琼脂糖的制备：将镍NTA琼脂糖用缓冲液A洗下螯合的镍离子，再用5倍体积的蒸馏水洗涤残存的缓冲液A，加入0.5 ml的浓度为0.1 M的硫酸铜进行铜离子的螯合，用5倍体积的蒸馏水冲洗掉多余的铜离子，所得即为铜NTA琼脂糖；

（2）铜绿假单胞菌PA1培养：活化-80 ℃保存的铜绿假单胞菌种子，按10%的接种量将过夜培养的种子液接入以丁二酸为碳源的无机盐培养基中培养，摇瓶装液量30 %，体积为100 mL，培养温度为28～30 ℃，培养转速100～120 rpm/min，培养48 小时；

（3）荧光铁载体的纯化：将步骤（2）中的铜绿假单胞菌培养物在10，000 rpm的转速下离心，收集上清，将上清液与结合缓冲液按体积为1：2的比例进行混合得到混合液，将混合液加入到铜NTA琼脂糖柱上，再用5倍体积的结合缓冲液进行清洗，然后用5 mL洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液即为纯化的荧光铁载体。

步骤（1）中所述的缓冲液A的成分为0.02 M的磷酸钠，0.5 M的氯化钠，0.05 M的EDTA，pH 7.2；步骤（2）中所述的以丁二酸为碳源的无机盐培养基的配方为：磷酸氢二钾6.0g/L，磷酸二氢钾 3.0 g/L，硫酸铵 1.0 g/L，七水硫酸镁 0.1 g/L，丁二酸4.0 g/L；步骤（3）中所述的结合缓冲液的成分为0.02 M磷酸钠，1 M氯化钠，pH 7.2；所述的洗脱缓冲液的成分为0.02 M的磷酸钠，0.5 M氯化钠，pH 3.5。

所述的荧光铁载体抑制灿烂弧菌生长的方法为：在含有灿烂弧菌的2216E培养基中，加入2216E培养基体积3%的纯化的荧光铁载体，30 ℃培养24小时，对灿烂弧菌的抑制率达到50%。

所述的2216E培养基的配方为：胰蛋白胨5 g/L，酵母浸粉 1 g/L，磷酸铁0.01 g/L，海水1 L，灭菌备用。

所述的荧光铁载体抑制海水中灿烂弧菌的方法为：在含有灿烂弧菌的海水中，加入海水体积1%的纯化的荧光铁载体，30 ℃培养24小时，可完全抑制海水中灿烂弧菌的生长。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种铜绿假单胞菌荧光铁载体的新用途，该铜绿假单胞菌在外界铁离子浓度较低的条件下可分泌大量的荧光铁载体，通过铜NTA琼脂糖的亲和层析可得到高纯度的荧光铁载体，利用该荧光铁载体可螯合环境中的铁离子，通过与病原体灿烂弧菌竞争铁离子，使得病原体灿烂弧菌的生长因缺乏铁离子而受到抑制。而对相同条件下的其他细菌包括嗜水气单胞菌、科氏葡萄球菌和希瓦氏菌等均无抑制效果。因此，该荧光铁载体可作灿烂弧菌的抑制剂，以期在实际的疾病防治中发挥重要作用。

铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PA1，该菌株于2011年04月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 4799，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为不同量的铜绿假单胞菌上清液对灿烂弧菌浓度的抑制效应；灿烂弧菌菌液的起始浓度为1.0×10⁷ CFU/mL，平均分成7份，每份5 mL的菌液，分别加入0、100、200、400、800和1600 μL的上清液，30 ℃培养24小时，测定各菌液的吸光度；

图2为不同量的纯化荧光铁载体对2216E培养基中灿烂弧菌浓度的抑制效应；灿烂弧菌菌液的起始浓度为1.0×10⁷ CFU/mL，平均分成8份，每份5 mL的菌液，分别加入0、1、5、10、20、40、80和160 μL的荧光铁载体，30 ℃培养24小时，测定各菌液的吸光度；

图3荧光铁载体在相同条件下对嗜水气单胞菌、科氏葡萄球菌、希瓦氏菌和灿烂弧菌等的抑制效用。菌体的起始浓度为1.0×10⁷ CFU/mL，160μL的荧光铁载体分别加入到5mL的菌液中，30 ℃培养24小时，测定各菌液的吸光度。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

铜绿假单胞菌的上清液对灿烂弧菌生长的抑制

铜绿假单胞菌在以丁二酸作为碳源的无机盐培养基中，可以大量分泌荧光铁载体。其中以丁二酸作为碳源的无机盐培养基的配方为：磷酸氢二钾6.0 g/L，磷酸二氢钾3.0 g/L，硫酸铵 1.0 g/L，七水硫酸镁 0.1 g/L，丁二酸4.0 g/L。活化-80 ℃保存的铜绿假单胞菌种子，按10%的接种量将过夜培养的种子液接入以丁二酸为碳源的无机盐培养基中培养，摇瓶装液量30%，培养温度为28～30 ℃，培养转速100～120 rpm/min，培养48 小时。将细菌培养物在10，000 rpm的转速下离心，收集上清。上清在100 ℃的水浴中加热，并用0.45 μm的滤膜过滤除菌。

活化-80 ℃保存的灿烂弧菌种子，按10%的接种量将过夜培养的种子液接入2216E培养基中，其中，2216E培养基的配方为胰蛋白胨5 g/L，酵母浸粉 1 g/L，磷酸铁0.01 g/L，海水1 L，灭菌备用。灿烂弧菌在2216E培养基中的起始浓度为1.0×10⁷ CFU/mL，在5 mL的培养液中分别加入0、100、200、400、800和1600 μL的铜绿假单胞菌的上清液，30 ℃培养24小时，在紫外分光光度计600 nm波长处测定菌液吸光度。以不同的上清液体积为横坐标，以菌液的吸光值为纵坐标，作图1，并计算不同浓度的上清液对灿烂弧菌的抑制效率。由图1可见，随着加入上清液的体积的增加，灿烂弧菌的生物量明显受到抑制。加入7%体积的上清液，可对灿烂弧菌达到75%的抑制。

鉴于荧光铁载体在上清中的存在量大，且具有螯合铁载体的功能，我们接下来验证了荧光铁载体对灿烂弧菌的抑制效应。

实施例2

荧光铁载体的纯化

①铜NTA琼脂糖的制备：镍NTA琼脂糖购自上海生物科技工程有限公司，采用缓冲液A洗下琼脂上螯合的镍离子，其中，缓冲液A的成分为0.02 M的磷酸钠，0.5 M的氯化钠，0.05 M的EDTA，pH 7.2。用5倍体积的蒸馏水洗涤残存的缓冲液A。加入0.5 ml的浓度为0.1M的硫酸铜进行铜离子的螯合，用5倍体积的蒸馏水冲洗掉多余的铜离子，所得即为铜NTA琼脂糖；

②铜绿假单胞菌PA1培养：活化-80 ℃保存的铜绿假单胞菌种子，按10%的接种量将过夜培养的种子液接入以丁二酸为碳源的无机盐培养基中培养，摇瓶装液量30 %，培养温度为28～30 ℃，培养转速100～120 rpm/min，培养48 小时；其中以丁二酸作为碳源的无机盐培养基的配方为：磷酸氢二钾6.0 g/L，磷酸二氢钾 3.0 g/L，硫酸铵 1.0 g/L，七水硫酸镁 0.1 g/L，丁二酸4.0 g/L；

③荧光铁载体的纯化：将步骤②中的铜绿假单胞菌培养物在10，000 rpm的转速下离心，收集上清。上清液与结合缓冲液按体积为1：2的比例进行混合得到混合液，结合缓冲液的成分为0.02 M磷酸钠，1 M氯化钠，pH 7.2，混合液加入到铜NTA琼脂糖柱上，荧光铁载体与铜NTA琼脂糖进行特异结合，用5倍体积的结合缓冲液进行清洗；最后，结合到铜NTA琼脂糖的荧光铁载体用5 mL洗脱缓冲液洗脱，洗脱缓冲液的成分为0.02 M的磷酸钠，0.5 M氯化钠，pH 3.5，收集洗脱液即为纯化后的荧光铁载体，将纯化后的荧光铁载体在紫外分光光度计下测定紫外吸光度，在405 nm左右有最大的吸收峰，值约为0.38。得到的纯化荧光铁载体用NaOH将pH调至7.2，并采用0.45 μm的滤膜过滤除菌，储存备用。

实施例3

荧光铁载体对2216E培养基中灿烂弧菌生长的抑制效应

将上述实施例2中纯化后的荧光铁载体用NaOH将其pH调至7.0-7.2，并用0.45 μm的滤膜过滤除菌，储存备用。

将-80 ℃保存的灿烂弧菌接种到2216E培养基中，于28～30 ℃的气浴恒温振荡器中100～120 rpm/min过夜培养。培养后的菌液按10%的接种量接种到灭菌的2216E培养基，使菌浓度达到1.0 ×10⁷ CFU/mL。取8支试管，每管加入5 mL含有灿烂弧菌的2216E培养液，分别加入0、1、5、10、20、40、80和160 μL纯化后的荧光铁载体。30 ℃培养24小时，在紫外分光光度计600 nm处测定所培养菌液的吸光度。以不同的荧光铁载体体积为横坐标，以菌液的吸光值为纵坐标，作图2，并计算荧光铁载体对灿烂弧菌生物量的影响。由图2可见，加入纯化的荧光铁载体可明显抑制灿烂弧菌的生长。随着加入荧光铁载体体积的增加，灿烂弧菌的生物量明显受到抑制。加入3%体积的荧光铁载体，可对灿烂弧菌的生物量达到50%的抑制。

为了检测荧光铁载体对灿烂弧菌抑制的特异性，将160 μL纯化的荧光铁载体分别按如上的方法加入到5 mL分别含有起始菌浓度为1.0 ×10⁷ CFU/mL的科氏葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、嗜水气单胞菌和灿烂弧菌的2216E培养基中。30 ℃培养24小时，在紫外分光光度计600 nm处测定所培养菌液的吸光度。以不同的菌种为横坐标，以对照组为100%，作图3，并计算荧光铁载体对不同细菌生长的生物量的影响。由图3可见，科氏葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和嗜水气单胞菌的生长不受铜绿假单胞菌分泌的该荧光铁载体的影响，而在该荧光铁载体的存在的情况下，灿烂弧菌的生物量明显受到抑制。

实施例4

荧光铁载体对海水中灿烂弧菌的抑制。

陈海水采用0.45 μm的滤膜过滤除菌，储存备用。

将-80℃保存的灿烂弧菌接种到2216E培养基中，于28～30 ℃的气浴恒温振荡器中100～120 rpm/min过夜培养。培养后的菌液按10%的接种量接种到除菌的海水中，使菌浓度达到1.0 ×10⁷ CFU/mL。取8支试管，每管加入5 mL含有灿烂弧菌的海水，分别加入0、1、5、10、20、40、80和160 μL纯化后的荧光铁载体。30 ℃培养24小时，将培养液稀释1000倍，取50 μL涂布2216E平板，并进行菌落计数。由表1可见，加入纯化的荧光铁载体可明显抑制海水中灿烂弧菌的生长。随着加入荧光铁载体体积的增加，灿烂弧菌的生物量明显受到抑制。加入1%体积的荧光铁载体，可完全抑制海水中灿烂弧菌的生长。因此，该荧光铁载体可作灿烂弧菌的抑制剂，以期在实际的疾病防治中发挥重要作用。

表1 加入海水的荧光铁载体的量及对应平板上的菌落数。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范畴。

Claims

1.一种铜绿假单胞菌荧光铁载体的新用途，其特征在于：所述的荧光铁载体在抑制灿烂弧菌生长方面的用途；所述的荧光铁载体抑制灿烂弧菌生长的方法为：在含有灿烂弧菌起始浓度为1.0×10⁷CFU/mL的2216E培养基中，加入2216E培养基体积3％的纯化的荧光铁载体，30℃培养24小时，对灿烂弧菌的抑制率达到50％；所述的荧光铁载体抑制海水中灿烂弧菌的方法为：在含有灿烂弧菌起始浓度为1.0×10⁷CFU/mL的海水中，加入海水体积1％的纯化的荧光铁载体，30℃培养24小时，可完全抑制海水中灿烂弧菌的生长，所述的荧光铁载体来源于一株铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PA1，该菌株于2011年04月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4799。