CN105349446B

CN105349446B - 降解黄曲霉毒素m1的短小芽孢杆菌及其分泌的活性蛋白

Info

Publication number: CN105349446B
Application number: CN201510186382.6A
Authority: CN
Inventors: 桑亚新; 崔玉琦; 武瑞霞; 桑雨芃
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2015-04-20
Filing date: 2015-04-20
Publication date: 2019-09-10
Anticipated expiration: 2035-04-20
Also published as: CN105349446A

Abstract

本发明涉及一株用于降解黄曲霉毒素M₁的短小芽孢杆菌Bacillus pumilus，保藏编号为CGMCC NO.10228及其所分泌的活性蛋白，所述短小芽孢杆菌是从食草动物粪便中分离并筛选得到，活性蛋白为胞外活性蛋白。本发明还提供了所述短小芽孢杆菌菌体培养液或其分泌的活性蛋白用于降解黄曲霉毒素M₁的方法及其应用，通过所述方法，短小芽孢杆菌菌体培养液在37℃，12h后对黄曲霉毒素M₁降解率≥90％，活性蛋白在相同条件下对黄曲霉毒素M₁的降解率≥80％。本发明的短小芽孢杆菌及其所分泌的活性蛋白解毒活性高，特异性强，作用时间短，条件温和，适用于降解和消除动物源性食品中的黄曲霉毒素M₁，并且本发明中的短小芽孢杆菌具有生物活性强，益生性的优点。

Description

降解黄曲霉毒素M1的短小芽孢杆菌及其分泌的活性蛋白

技术领域

本发明涉及短小芽孢杆菌，特别是涉及一种用于降解黄曲霉毒素M₁的短小芽孢杆菌及其所分泌的活性蛋白。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxin，AF)是由曲霉属中的黄曲霉和寄生曲霉所产生的一类结构和理化性质相似的毒性极强的次生代谢产物。目前已经发现黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂等20余种。AFB₁和AFM₁于1993年和2002年分别被世界卫生组织国际癌症研究机构确定为Ⅰ类致癌物。AFM₁主要是由动物食用了含有AFB₁的饲料后，在体内通过代谢转化而来，因此主要出现在动物源性食品，例如奶及奶制品中。2011年某乳业生产的某一批次乳制品中检测出AFM₁含量超标，其危害远远大于三聚氰胺，由此AFM₁引起了消费者和研究人员的注意。目前控制AFM₁的方法只是通过控制它的前体物质AFB₁在饲料中的含量，减少转化来防止AFM₁对奶制品的污染，而当奶和奶制品中已经出现了AFM₁时却没有有效的办法来去除。

目前，用于降解黄曲霉毒素的方法主要包括理化法和生物法。理化法一般包括萃取法、吸附法、热处理法、辐射法、碱、氧化剂等，虽在降解黄曲霉毒素上具有一定效果，但是不可避免地会对食品或饲料的营养成分、品质造成破坏，同时还可能产生副产物和化学试剂残留，从而造成一定危害。生物去毒法利用抑制黄曲霉毒素的产生或利用微生物吸附、降解黄曲霉毒素，其条件温和，既不会破坏产品的营养成分，也不会产生副产物及化学残留，主要包括吸附去毒和降解去毒两方面。吸附去毒法由于吸附过程是可逆的，菌体培养时间过长时还会向基质中释放一部分毒素，在生产应用中效果不稳定，而微物降解法通过破坏黄曲霉毒素结构，将其转化为无毒或低毒的物质，降解过程不可逆，去毒效果稳定彻底，是一种更理想的方法。因此，筛选高效降解黄曲霉毒素的菌株，具有积极的现实意义。

目前利用微生物降解黄曲霉毒素的报道多集中在AFB₁，例如：例如申请号200810224726.8，公开号CN101457212A“一株同时降解黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A的菌株的筛选、培养和应用”，申请号200910087595.8，公开号CN101580810A “一种筛选降解黄曲霉毒素B₁细菌的方法”，申请号200910092920.X，公开号CN101659929A的专利“用于降解黄曲霉毒素B₁的粘球菌菌株及其活性蛋白”，申请号201210017977.5，公布号CN103215191A“一株平菇及其在降解黄曲霉毒素中的应用”，申请号201410001901.2，公布号CN103725636A的专利“用于降解黄曲霉毒素B₁的芬氏纤维微菌SLAQ001 及其应用”等，另外也有一些利用微生物降解多种黄曲霉毒素的报道，申请号201010539983.8，公开号为CN102031234A 的专利“用于降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌及其分泌的活性蛋白”,申请号201410001212.1，公开号CN103710292A“一株铜绿假单胞菌及其在降解黄曲霉毒素方面的应用”，申请号201410203045.9，公布号CN103981132A“一株节杆菌及其在降解黄曲霉毒素中的应用”申请号201410204210.2，公布号CN103981135A“一株沙氏芽孢杆菌及其在降解黄曲霉毒素中的应用”等，但是所申请保护的菌种不同。申请号201410292766.1，公布号CN104087528A，“一种短小芽孢杆菌及其在降解黄曲霉毒素中的应用”，虽然其对AFM₁有一定的降解作用，但是所申请的短小芽孢杆菌是从植物材料百合花中筛选，所针对的主要产品是粮食、酱油和饲料，需要接触96h时才能达到最佳的降解效果，时间较长，并且没有明确其降解的主要活性物质。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于降解黄曲霉毒素M₁的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，其保藏号为CGMCC NO.10228，及其所分泌的活性蛋白。

本发明所提供的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)是从食草动物粪便筛选得到。

本发明的另一目的是提供上述短小芽孢杆菌的培养方法及其所分泌的活性蛋白的制备方法。

本发明的进一步目的是提供上述短小芽孢杆菌及其所分泌的活性蛋白在降解黄曲霉毒素M₁中的应用。

所述短小芽孢杆菌是从食草动物粪便分离并筛选得到的Bacillus pumilus E-1-1-1，通过微生物菌落形态观察，16SrDNA分子测序以及Biolog生理生化实验对其进行了鉴定。

其细菌生理生化特征见表1：

表1.细菌生理生化特征

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性，“/”表示半阳性

本发明还提供所述短小芽孢杆菌的培养方法，取所述短小芽孢杆菌种子液以3％的接种量接种到1000mL培养基中进行摇瓶发酵培养。

其中，所述短小芽孢杆菌种子液的培养基和培养条件与发酵的培养基和培养条件相同。

在发酵时，该短小芽孢杆菌的最佳碳源为麦芽糖，最佳氮源为酵母粉。

在本发明具体方案中，所述培养基由如下组分组成：麦芽糖6g、酵母粉8g、氯化钠10g、蒸馏水1000mL，pH值为7.0-7.4。所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度为35-45℃，发酵时间14-16h，pH值7.0-7.4，转速100-150r/min。

本发明还提供所述短小芽孢杆菌，其保藏号为CGMCC NO.10228及所分泌的活性蛋白，其通过以下方法制备得到：

(1)对短小芽孢杆菌进行发酵培养；

(2)发酵结束后，离心除菌体，用60％-80％硫酸铵提取上清液中的活性蛋白，沉淀，5000r/min离心20min得到蛋白沉淀；

(3)将得到的蛋白沉淀溶于PBS缓冲液，冻干浓缩即得活性蛋白。

本发明还提供所述短小芽孢杆菌(保藏号为CGMCC NO.10228)及其所分泌的活性蛋白在降解黄曲霉毒素M₁中的应用。本发明还提供利用上述短小芽孢杆菌(保藏号为CGMCCNO.10228)及其所分泌的活性蛋白降解黄曲霉毒素M₁的方法，取所述短小芽孢杆菌的发酵液或所述活性蛋白的PBS溶液900μL，加入黄曲霉毒素M₁溶液100μL。将反应体系的pH值调节为 5.0-7.5，在35-45℃,12h后对溶液中的AFM₁消减率分别达到90％以上和80％以上。

本发明提供的短小芽孢杆菌可以在相对简单的培养条件下降解AFM₁，并且本发明提供的降解AFM₁的方法，操作简便、条件温和，反应时间短，降解效果显著。

附图说明

图1为短小芽孢杆菌菌株在保藏培养基上的菌落形态图；

图2为短小芽孢杆菌菌株在显微镜下的菌体形态图；

图3为对照组黄曲霉毒素M₁色谱图；

图4为短小芽孢杆菌处理组黄曲霉毒素M₁色谱图。

保藏信息说明

本发明所述的短小芽孢杆菌Bacillus pumilus E-1-1-1，已于2014年12月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址北京市朝阳区北辰西路中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.10228。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

黄曲霉毒素M₁购自Fermentek公司(生产批号为A2240)。

PBS(0.01mol/L)的制备：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调节溶液的pH值至7.2，最后加蒸馏水定容至1L。

实施例1本发明短小芽孢杆菌的培养方法

取短小芽孢杆菌Bacillus pumilus，保藏编号为CGMCC NO.10228，0.3ml(活菌浓度为109CFU/ml)，接种于100ml培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为37℃，发酵时间14h，pH值7.2，转速130r/min。

其中，摇瓶发酵培养基由下述组分组成：麦芽糖6g、酵母粉8g、氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH值为7.2。

实施例2本发明活性蛋白制备方法

取实施例1发酵结束后菌液，离心除菌体，用75％硫酸铵提取上清液中的活性蛋白，沉淀，5000r/min离心20min，将得到的沉淀溶于PBS缓冲液，冻干浓缩即得活性蛋白。

实施例3菌液对黄曲霉毒素M₁的降解

取实施例1制备的菌液900μL加入灭菌的离心管中，加入100μL浓度为400ng/mL的AFM₁，混合均匀后置于温度为37℃的恒温培养箱中，12h取样，采用高效液相色谱测定黄曲霉毒素M₁的含量；同时分别以无菌的发酵培养基作为空白对照，检测条件：色谱柱为C18(250mm×4.6mm，10μm)；流动相为乙腈：水(25:75)，流速为1ml/min，激发波长为360nm，发射波长为410nm，进样量为10μL，12h时AFM ₁的降解率为92.5％。

实施例4活性蛋白对黄曲霉毒素M₁的降解

取实施例2制备的活性蛋白900μL(10mg/mL)，加入灭菌的离心管中，加入100μL浓度为400ng/mL的AFM₁，混合均匀后置于温度为37℃的恒温培养箱中，12h取样，采用高效液相色谱测定黄曲霉毒素M₁的含量；同时分别以无菌的发酵培养基作为空白对照，检测条件：色谱柱为C18(250mm×4.6mm，10μm)；流动相为乙腈：水(25:75)，流速为1ml/min，激发波长为360nm，发射波长为410nm，进样量为10μL，12h时AFM ₁的降解率为85％。

实施例5菌液对牛奶中黄曲霉毒素M₁的降解

取牛奶样品，以100ng/mL AFM₁浓度加标，将其分为三份，每份5g，分别与10mL实施例1制备的菌液混合，将混合后的样品置于37℃的恒温培养箱中放置12h后，加入5ml甲醇水(7:3)，再加入5ml氯仿，超声提取10min，用分液漏斗进行分液，收集下层氯仿于100ml鸡心瓶中，将此过程重复3次后25℃旋转蒸发至近干，用1ml乙腈复溶。经检测，实施例1制备的发酵液对牛奶中黄曲霉毒素M₁的降解率为90.5％。

实施例6活性蛋白对牛奶中黄曲霉毒素M₁的降解

取牛奶样品，以100ng/mL AFM₁浓度加标，将其分为三份，每份5g，分别与5mL实施例2制备的活性蛋白(10mg/mL)混合，将混合后的样品置于37℃的恒温培养箱中放置12h后，加入5ml甲醇水(7:3)，再加入5ml氯仿，超声提取10min，用分液漏斗进行分液，收集下层氯仿于100ml鸡心瓶中，将此过程重复3次后25℃旋转蒸发至近干，用1ml乙腈复溶。经检测，实施例2制备的活性蛋白对牛奶中黄曲霉毒素M₁的降解率为82％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

核苷酸序列

Claims

1.一株降解黄曲霉毒素M₁的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，保藏编号为CGMCCNO.10228，其特征在于：(1)根据黄曲霉毒素M₁的形成转化特点，从食草动物粪便中筛选得到；(2)短小芽孢杆菌菌体培养液在37℃，12h对黄曲霉毒素M₁的降解率≥90％。

2.制备权利要求1所述的短小芽孢杆菌的细胞外活性蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)对权利要求1所述保藏编号为CGMCC NO.10228的短小芽孢杆菌进行发酵培养；(2)发酵结束后，离心除菌体，60％-80％硫酸铵提取上清液中的活性蛋白，沉淀离心；(3)将得到的沉淀溶于PBS缓冲液，透析、冻干浓缩即得细胞外活性蛋白。

3.根据权利要求2所述的制备方法获得的细胞外活性蛋白，其特征在于，所述细胞外活性蛋白对黄曲霉毒素M₁的降解率≥80％。

4.权利要求1所述的降解黄曲霉毒素M₁的短小芽孢杆菌或权利要求3所述的细胞外活性蛋白在降解黄曲霉毒素M₁中的应用，其特征在于，所述应用为应用于含有黄曲霉毒素M₁的动物源性食品中。