CN101130786A - 一种培养海洋光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及海洋技术领域，具体是利用海水养殖场污泥和污水培养海洋光合细菌光－暗发酵耦联制氢的方法。其方法为首先利用海水养殖中产生的富含有机质的污水和污泥等作为放氢培养基进行暗培养产氢，然后进行光培养产氢，最后将暗培养放氢后的培养基中加入光发酵细菌进行耦联产氢，以提高氢气的释放量，从而恢复海洋暗发酵产氢菌的产氢活性。采用本发明的方法既可以使海水养殖产生的有机废物无害化，减轻环境污染，又可以缓解当前紧张的能源危机压力。
Description
技术领域
本发明涉及海洋技术领域，具体是利用海水养殖场污泥和污水培养海洋光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法。
背景技术
目前，“化石能源”逐渐枯竭，且其燃烧形成的产物(如CO2和SO2)等会造成严重的环境污染(如温室效应和酸雨)。因此我们必需寻找清洁的可再生能源，来替代“化石能源”。由于氢能的能量密度高，运输方便，无污染等特点，最有希望成为未来主要的替代能源之一。各种制氢方法中，生物发酵制氢由于其能耗少、效率高、无污染等优点成为最有发展潜力的制氢方法之一。
降低制氢的生产成本对于制氢技术的推广具有重要的意义。发酵产氢菌利用有机废弃物制取氢能，不但使生物制氢成本大大降低，而且使生物制氢技术走向实用化。海水养殖产生了大量的有机废物，它们富含有各种有机碳和有机氮。如果这些有机废物未经处理或者资源化利用，就会造成严重的海水富营养化，引发频繁的海洋灾难——赤潮。从而严重影响该海区的渔业生产和周边居民的生活。利用海水养殖有机废弃物制备氢气不仅可以使其能源化，而且也可以改善环境。
现有技术中的生物制氢技术都是利用单一一种微生物进行放氢，很少能利用两种微生物进行耦联放氢。单独利用光合细菌或单独利用发酵细菌放氢量小，反应条件不好控制。如只用暗发酵细菌进行放氢时，随着有机物的降解，pH值不断下降，pH的下降会使发酵菌的放氢活性下降，甚至完全失去放氢活性。另一方面，单独利用光发酵菌进行产氢，光发酵菌分解大分子有机物的能力不强，不能单独处理有机废物。
以往也有一些关于暗发酵产氢菌和光发酵产氢菌放氢的专利，如：专利号CN02156024.2、CN92114474.1、CN200510010383.1、CN200410005733.0和CN200310116142.6等专利，但这些专利都是关于陆地淡水中的产氢细菌的分离以及以陆地淡水有机质为放氢培养基。
同时海洋暗发酵产氢菌和海洋光发酵产氢菌利用的有机物不同，具有高度特异性。一方面，海洋暗发酵产氢菌在产氢过程中可以降解大分子有机物，而海洋光发酵产氢菌分解大分子有机物的能力不强，但是它们能利用海洋暗发酵产氢菌分解大分子有机物后产生的小分子物质，两者混合培养可以充分利用有机质，提高产氢量。而针对海水养殖场污泥和污水培养海洋光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法未见报道。因此，以海洋光发酵产氢菌-海洋暗发酵产氢菌耦联二步法处理海水养殖场的污泥和污水制取氢能具有重要的战略意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够资源利用、优化环境的从海水养殖场污泥和污水中培养光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法。
为实现以上目的，本发明采用的技术方案为：
培养光发酵细菌光-暗发酵耦联制氢的方法包括以下步骤：
1)光培养产氢：
①富集培养：取样以10-50ml的污泥样品接种到50-500ml培养液中富集培养，培养箱温度为28-35℃，光照强度为2500-4000勒克斯，无氧条件培养3-5天；而后重复上述富集培养2-3次，直到富集培养液变成红色；
②产氢培养：将富集培养后的接种物划线挑取单菌落，培养至含有产氢培养基的培养皿中可产氢，培养条件：每升样品中加入1-2克醋酸钠或1-2克丁酸钠，培养温为28-32℃，pH为7.5-8.2，光照强度为2500-4000勒克斯，同时保持无氧状态；
2)暗培养产氢：
①预处理：将污泥或污水样品通过碱性或酸性溶液调节其PH值，而后将样品静止0.5-1.5小时备用；
②培养产氢：将2)①预处理得到的菌种接种到海水养殖场污水或污泥中培养放氢，其培养条件为：反应温度28-35℃，光照强度为2500-4000勒克斯；
3)光-暗产氢耦联放氢：
将步骤1)①中得到的光合细菌加入到步骤2)②中继续放氢，其反应条件为：反应温度控制在28-35℃，光照强度控制在2500-4000勒克斯。
所述富集培养中的培养基为：氯化铵1.0-2.0g、乙酸钠2.0-4.0g、酵母粉0.2g-1.0g、蛋白胨0.1-0.5g、碳酸氢钠1-2g、海水1000ml、PH 7.5-8.2。
所述富集培养基中的乙酸钠可用丁酸钠替换。
所述产氢培养中的培养基为：谷氨酸钠1.0-2.0g、乙酸钠2.0-4.0g、酵母粉0.2g-1.0、蛋白胨0.1-0.5g、碳酸氢钠1-2g、海水1000ml、PH7.5-8.2。
所述氢培养基中的谷氨酸钠可用D、L-苹果酸替换，乙酸钠可用丁酸钠替换。
步骤2)暗培养产氢预处理中所述碱溶液为：氢氧化钠溶液，将其pH值调节到10-14；酸溶液为：盐酸溶液，将其pH值调节到1-4。
步骤1)和2)中所述样品为海水养殖场的污泥和污水。
步骤1)所述的光培养产氢中的产氢细菌可为：沼泽红假单胞菌(Rhodoseudomonas pallustris)，荚膜红假单胞菌(Rhodoseudomonascapsulata)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。
步骤2)所述的暗培养中的光合细菌可为：巴氏芽孢梭菌(Clostridiumpasteurianum)、类腐败梭菌(Clostridium paraputrificum)、丁酸梭菌(Clostridium butylicum)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。
本发明的原理：海洋暗发酵产氢菌在发酵放氢的过程中产生大量的有机酸使培养环境的pH下降。暗发酵放氢，无论起始pH是多少，最终pH基本维持在4.0-4.8之间。而酸性的培养环境会抑制暗发酵产氢菌的放氢活性，使氢气产量下降。海洋光发酵产氢菌可以利用这些小分子物质，将其分解产生氢气，同时提高培养环境中的pH值，从而恢复海洋暗发酵产氢菌的产氢活性。
本发明的优点：
1.优化环境，本发明的原料为海水养殖场污泥和污水，原料经过暗发酵产氢菌在产氢过程可以降解大分子有机物，随后光发酵产氢菌利用海洋暗发酵产氢菌分解大分子有机物后产生的小分子物质，两者混合培养可以充分利用有机质，将海洋中的废物的到充分降解使环境得到改善。
2.产氢率高，本发明制氢方法将光反应与暗反应有机结合，使产氢率与单一的光反应和暗反应相比得到大大提高。
3.资源利用，本发明将光合细菌光-暗发酵耦联，有利于提高底物的利用率和产氢量，将暗培养中产生大量的有机酸废弃物通过光培养进行进一步的分解，可以减轻海洋的环境污染，而且还可以将这些有机废物进行能源化利用。
4.降低成本，利用光-暗发酵菌耦联处理有机废弃物，不但可以避免常规的处理有机废物的高额费用的支出，又能生产出氢能，一举两得。
5.减轻环境污染，氢能是一种洁净的能源，它不会对环境产生污染，这样就避免了“化石能源”利用过程中，产生的大量的环境污染问题。
附图说明
图1为本发明产氢工艺流程图。
图2为本发明光发酵产氢菌处理海水养殖场污泥和污水产氢量变化图。
图3为本发明碱处理得到海洋暗发酵产氢菌群与光发酵产氢菌耦联处理海水养殖场污泥和污水产氢量变化图。
图4为本发明酸处理得到海洋暗发酵产氢菌群与光发酵产氢菌耦联处理海水养殖场污泥和污水产气量变化图。
具体实施方式
实施例1：
1)光培养产氢(参见图1)：
①富集培养：从海水养殖场污泥中取样进行海洋光合细菌的培养，取样后马上以50ml样品加入500ml的申请人设计的筛选培养基中富集培养中，尽量充满整个培养瓶，以尽量减少培养瓶中空气的量。在整个操作过程中始终对样品吹氮气，在盖上培养瓶橡胶塞之前，向培养瓶通氮气15分钟，以达到无氧的培养条件培养3天。培养条件为：培养箱温度为28℃，光照强度为2500勒克斯。其中：培养基为液体培养基成分为：氯化铵1.0g、乙酸钠2.0g、酵母粉0.2g、蛋白胨0.1、碳酸氢钠1、海水1000ml、PH 7.5；而后重复上述富集培养2次，富集培养液变成红色或紫红色，产氢细菌可为：沼泽红假单胞菌(Rhodoseudomonas pallustris)，荚膜红假单胞菌(Rhodoseudomonas capsulata)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。
②产氢培养：将富集培养后的接种物划线挑取单菌落，此时的培养基为产氢培养基中加入琼脂1.5，挑取的单菌落培养至含有产氢培养基的培养皿中进行产氢培养，其培养条件：每升样品中分别加入1克醋酸钠增加碳源，培养温为28℃，pH为7.5，光照强度为2500勒克斯，同时保持无氧状态。其中产氢的体培养基为：谷氨酸钠1.0g、乙酸钠2.0g、酵母粉0.2g、蛋白胨0.1g、碳酸氢钠1g、海水1000ml、PH7.5；无氧条件操作为：将含有培养基的培养皿置于盛有焦性没食子酸和10％氢氧化钠的干燥器中，然后将干燥器内的空气用真空泵减压吸除，再充入氮气以平衡干燥器内的压力平衡，如些反复三次，以除去干燥器内大部分的氧气，以达到厌氧条件。
培养期间的产氢过程：起始反应阶段，海水养殖场的污泥和污水中含有大量的铵态氮，它会抑制氢气的生成，所以产氢量很少。但在反应一段时间后，铵态氮大部分都被消耗掉，而且光合细菌积累了一定的生物量，这时产氢量也大大增加。再过一段时间，光合细菌已将大部分的有机营养物质分解，产氢量又开始下降。反应期间每升品被光发酵产氢菌处理后共产氢量达720ml(参见图2)。其中：气体排出量用排水法进行收集，并进行定量。氢气含量用气相色谱(含热导检测仪)测量。
2)暗培养产氢：
由于海洋暗发酵产氢菌能适应广泛的pH范围，而产甲烷菌是一种主要的抑制氢气生成的细菌，只能在一个很窄的pH范围内生长。所以选用极端pH处理，使产甲烷细菌的活性受到抑制，而使暗发酵产氢菌得到富集，一般富集得到的暗发酵菌主要是厌氧梭菌，巴氏芽孢梭菌(Clostridiumpasteurianum)、类腐败梭菌(Clostridium paraputrificum)、丁酸梭菌(Clostridium butylicum)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。
①预处理：取海水养殖场污泥作为暗产氢菌群，采用1摩尔氢氧化钠调节样品的PH值到14，而后将样品静止1小时备用，用此法得到的细菌菌群作为下一步放氢试验的菌种。
②暗发酵产氢：将预处理得到的菌种接种到3个不同pH值的海水养殖场污水或污泥中培养暗发酵放氢，其培养条件为：反应温度28℃，光照强度为2500勒克斯，采用3个不同起始pH值分别为6.0、6.5和7.0
暗发酵产氢过程：在起始阶段反应约5小时暗发酵基本不产气，因为在这个阶段暗发酵产氢菌的细菌量不大，所以放氢量也很小，在反应12小时以后产气量迅速增加，因为这时暗发酵产氢菌的生物量也已积累的一定的量，并且产氢能力不断增加。反应42小时后基本上没有气体放出，这时大分子有机物已基本被分解成为小分子的有机酸，暗发酵产氢菌的放氢能力已经很弱，甚至完全没有产氢能力。暗发酵产氢菌处理海水养殖场污泥和污水产氢量达360ml/L(参见图3)。CODCr达10.43(参见表1)明显的改善了海水养殖场污水的水质。
3)光-暗产氢耦联放氢：
将步骤1)①中得到光合细菌加入到步骤2)②中的继续放氢，其反应条件为：反应温度控制在30℃，光照强度控制在3000勒克斯。此时再测定气体的总量和氢气的含量。加入光合细菌后，有大量的气体放出，放出氢气3000ml/L。
通过耦联放氢后产氢量大大增加，海水养殖场中的有机物完全分解，同时可使海水养殖场的污泥和污水的COD等明显降低。CODCr达6.45(参见表1)为本发明酸处理与碱处理海水关殖场污水CODCr变化。比单独使用暗发酵菌处理海水养殖场污水更明显的改善了的水质。
表1酸处理和碱处理海水养殖场CODCr变化
| CODCr(mg/l) | 处理前 | 暗发酵放氢后 | 光发酵放氢后 |
| 酸处理 | 21.11 | 11.23 | 6.45 |
| 碱处理 | 21.11 | 10.43 | 5.12 |
实施例2
与实施例1不同之处在于：
1)光培养产氢：
①富集培养：从海水养殖场污泥中取样进行海洋光合细菌的培养，取样后马上以40ml样品加入400ml的申请人设计的筛选培养基中富集培养中，无氧条件培养4天，培养条件为：培养箱温度为35℃，光照强度为2500勒克斯。其中：培养基为液体培养基成分为：氯化铵2.0g、乙酸钠4.0g、酵母粉1.0g、蛋白胨0.5g、碳酸氢钠2g、海水1000ml、PH8.2；而后重复上述富集培养3次，富集培养液变成红色或紫红色，荚膜红假单胞菌(Rhodoseudomonas capsulata)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。
②产氢培养：将富集培养后的接种物划线挑取单菌落，此时的培养基为产氢培养基中加入琼脂2.0克，挑取的单菌落培养至含有产氢培养基的培养皿中进行产氢培养，其培养条件：每升样品中分别加入1克丁酸钠增加碳源，培养温为28℃，pH为8.2，光照强度为2500勒克斯，同时保持无氧状态。其中产氢的体培养基为：D、L-苹果酸2.0g、丁酸钠4.0g、酵母粉1.0、蛋白胨0.5g、碳酸氢钠2g、海水1000ml、PH8.2。
2)暗培养产氢：
①预处理：取海水养殖场污泥作为暗产氢菌群，采用1摩尔盐酸调节样品的PH值到4，而后将样品静止1.5小时备用，用此法得到的细菌菌群作为下一步放氢试验的菌种。一般富集得到的暗发酵菌主要巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)、类腐败梭菌(Clostridiumparaputrificm)、丁酸梭菌(Clostridium butylicum)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。
②暗发酵产氢：将预处理得到的菌种接种到3个不同pH值的海水养殖场污水或污泥中培养暗发酵放氢，其培养条件为：反应温度30℃，光照强度为4000勒克斯，采用3个不同起始pH值分别为6.0、6.5和7.0
暗发酵产氢过程：在起始阶段反应约5小时暗发酵基本不产气，因为在这个阶段暗发酵产氢菌的细菌量不大，所以放氢量也很小，在反应10小时以后产气量迅速增加，因为这时暗发酵产氢菌的生物量也已积累的一定的量，并且产氢能力不断增加。反应42小时后基本上没有气体放出，这时大分子有机物已基本被分解成为小分子的有机酸，暗发酵产氢菌的放氢能力已经很弱，甚至完全没有产氢能力。暗发酵产氢菌处理海水养殖场污泥和污水产氢量达264ml/L(参见图4)。CODCr达11.23(参见表1)明显的改善了海水养殖场污水的水质。
3)光-暗产氢耦联放氢：
将步骤1)①中得到光合细菌加入到步骤2)②中的继续放氢，其反应条件为：反应温度控制在35℃，光照强度控制在4000勒克斯。此时再测定气体的总量和氢气的含量。加入光合细菌后，有大量的气体放出，放出氢气2200ml/L。CODCr达6.45(参见表1)，比单独使用暗发酵菌处理海水养殖场污水更明显的改善了的水质。
实施例3
与实施例1不同之处在于：
1)光培养产氢：
①富集培养：取样后马上以15ml样品加入60ml的申请人设计的筛选培养基中富集培养中无氧条件培养4天，培养条件为：培养箱温度为30℃，光照强度为3500勒克斯。其中：培养基为液体培养基成分为：氯化铵4.5g、乙酸钠2.5g、酵母粉0.5g、蛋白胨0.5g、碳酸氢钠1.5g、海水1000ml、PH 7.8；而后重复上述富集培养3次，富集培养液变成红色或紫红色，荚膜红假单胞菌(Rhodoseudomonas capsulata)、类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)。
②产氢培养：将富集培养后的接种物划线挑取单菌落，此时的培养基为产氢培养基中加入琼脂1.8克，其培养条件：每升样品中分别加入1.5克丁酸钠增加碳源，培养温为30℃，pH为7.8，光照强度为3500勒克斯，同时保持无氧状态。其中产氢的体培养基为：谷氨酸钠1.5g、乙酸钠2.5g、酵母粉0.6、蛋白胨0.4g、碳酸氢钠1.5g、海水1000ml、PH7.8。
2)暗培养产氢：
①预处理：取海水养殖场污泥作为暗产氢菌群，采用1摩尔盐酸调节样品的PH值到3，而后将样品静止0.8小时备用，用此法得到的细菌菌群作为下一步放氢试验的菌种。一般富集得到的暗发酵菌主要巴氏芽孢梭菌(Clostridium pasteurianum)、类腐败梭菌(Clostridium)paraputrificum)、丁酸梭菌(Clostridium butylicum)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。
②暗发酵产氢：培养条件为：反应温度30℃，光照强度为3500勒克斯，采用3个不同起始pH值分别为6.2、6.7和7.2
3)光-暗产氢耦联放氢：
将步骤1)放氢结束的最终光合细菌加入到步骤2)中继续放氢，其反应条件为：反应温度控制在30℃，光照强度控制在3000勒克斯。
实施例4
与实施例1不同之处在于：
1)光培养产氢：
①富集培养：取样后马上以30ml样品加入300ml的申请人设计的筛选培养基中富集培养中，无氧的培养条件培养3天。培养条件为：培养箱温度为32℃，光照强度为3500勒克斯。其中培养基为液体培养基成分为：氯化铵1.8g、丁酸钠2.6g、酵母粉0.4g、蛋白胨0.4g、碳酸氢钠1.6g、海水1000ml、PH 8。而后重复上述富集培养2次，富集培养液变成红色或紫红色，沼泽红假单胞菌(Rhodoseudomonas pallustris)，荚膜红假单胞菌(Rhodoseudomonas capsulata)。
②产氢培养：将富集培养后的接种物划线挑取单菌落，此时的培养基为产氢培养基中加入琼脂1.6g，其培养条件：每升样品中分别加入1.8克醋酸钠增加碳源，培养温为31℃，pH为7.5，光照强度为2800勒克斯，同时保持无氧状态。其中产氢的体培养基为：谷氨酸钠1.8g、D、L-苹果酸3g、酵母粉0.7、蛋白胨0.3g、碳酸氢钠1.5g、海水1000ml、PH8。
2)暗培养产氢：
由于海洋暗发酵产氢菌能适应广泛的pH范围，而产甲烷菌是一种主要的抑制氢气生成的细菌，只能在一个很窄的pH范围内生长。所以选用极端pH处理，使产甲烷细菌的活性受到抑制，而使暗发酵产氢菌得到富集，一般富集得到的暗发酵菌主要是厌氧梭菌如巴氏芽孢梭菌(Clostridiumpasteurianum)、类腐败梭菌(Clostridium paraputrificum)。
①预处理：取海水养殖场污泥作为暗产氢菌群，采用1摩尔氢氧化钠调节样品的PH值到12，而后将样品静止1.2小时备用，。
②暗发酵产氢：培养条件为：反应温度30℃，光照强度为3500勒克斯，采用3个不同起始pH值分别为5.8、6.3和6.8。
3)光-暗产氢耦联放氢：
将步骤1)①中得到光合细菌加入到产氢结束的暗发酵产氢体系中(2)中的②继续放氢，其反应条件为：反应温度控制在30℃，光照强度控制在3000勒克斯。
上述详细说明针对本发明的实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围。
Claims (9)
1.一种培养光发酵细菌光-暗发酵耦联制氢的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)光培养产氢：
①富集培养：取样以10-50ml的污泥样品接种到50-500ml培养液中富集培养，培养箱温度为28-35℃，光照强度为2500-4000勒克斯，无氧条件培养3-5天；而后重复上述富集培养2-3次，直到富集培养液变成红色；
②产氢培养：将富集培养后的接种物划线挑取单菌落，培养至含有产氢培养基的培养皿中可产氢，培养条件：每升样品中加入1-2克醋酸钠或1-2克丁酸钠，培养温为28-32℃，pH为7.5-8.2，光照强度为2500-4000勒克斯，同时保持无氧状态；
2)暗培养产氢：
①预处理：将污泥或污水样品通过碱性或酸性溶液调节其PH值，而后将样品静止0.5-1.5小时备用；
②培养产氢：将2)①预处理得到的菌种接种到海水养殖场污水或污泥中培养放氢，其培养条件为：反应温度28-35℃，光照强度为2500-4000勒克斯；
3)光-暗产氢耦联放氢：
将步骤1)①中得到的光合细菌加入到步骤2)②中继续放氢，其反应条件为：反应温度控制在28-35℃，光照强度控制在2500-4000勒克斯。
2.按权利要求1所述培养光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法，其特征在于：所述富集培养中的培养基为：氯化铵1.0-2.0g、乙酸钠2.0-4.0g、酵母粉0.2g-1.0g、蛋白胨0.1-0.5g、碳酸氢钠1-2g、海水1000ml、PH7.5-8.2。
3.按权利要求2所述培养光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法，其特征在于：所述权利要求2富集培养基中的乙酸钠可用丁酸钠替换。
4.按权利要求1所述培养光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法，其特征在于：所述产氢培养中的培养基为：谷氨酸钠1.0-2.0g、乙酸钠2.0-4.0g、酵母粉0.2g-1.0、蛋白胨0.1-0.5g、碳酸氢钠1-2g、海水1000ml、PH7.5-8.2。
5.按权利要求4所述培养光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法，其特征在于：所述权利要求4产氢培养基中的谷氨酸钠可用D、L-苹果酸替换，乙酸钠可用丁酸钠替换。
6.按权利要求1所述培养光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法，其特征在于：步骤2)暗培养产氢预处理中所述碱溶液为：氢氧化钠溶液，将其pH值调节到10-14；酸溶液为：盐酸溶液，将其pH值调节到1-4。
7.按权利要求1所述培养光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法，其特征在于：步骤1)和2)中所述样品为海水养殖场的污泥和污水。
8.按权利要求1所述培养光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法，其特征在于：步骤1)所述的光培养产氢中的产氢细菌可为：沼泽红假单胞菌，荚膜红假单胞菌或类球红细菌。
9.按权利要求1所述培养光合细菌光-暗发酵耦联制氢的方法，其特征在于：步骤2)所述的暗培养中的光合细菌可为：巴氏芽孢梭菌、类腐败梭菌、丁酸梭菌或阴沟肠杆菌。
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