CN101845460B - 基于振荡-补光策略的新型光合生物制氢工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于振荡-补光策略的新型光合生物制氢工艺。具体地，本发明提供了一种利用光合细菌制造氢气方法，包括步骤：(a)在非静置状态和光照强度I₁的初始入射光照射下，培养产氢的光合细菌，其中所述初始入射光的光照强度I₁满足以下条件：(i)I₁＞I₀，式中I₀是静置培养时初始入射光的最适光照强度；(ii)在所述光照强度I₁下，培养体系中至少70％区域(或体积)所受的实际光照强度I₁′大于或等于在静置培养所述下同一区域(或体积)所受的实际光照强度I₀′；(b)从培养体系中分离出产生的氢气。本发明方法可有效提高光合细菌制氢的效率，缩短产氢的周期并维持很高的底物转化率。

Description

基于振荡-补光策略的新型光合生物制氢工艺

技术领域

本发明涉及能源领域，更具体地涉及一种基于振荡-补光策略的新型光合生物制氢工艺。

背景技术

随着社会的不断进步和工业化程度的不断提高，人类对能源的需求日益增加，有限的化石能源已经不能满足世界各国对能源的需求。能源短缺，环境污染是人类未来面临的难题，寻找可再生的清洁能源已成为世界范围内能源界及其相关领域关注的焦点问题。目前全世界所需要的80％的能源都来自于化石燃料，但其储量有限，且趋于枯竭。化石燃料燃烧时生成CO_x、SO_x、NO_x、CH_x、烟雾、灰尘、焦油和其他有机化合物，造成了严重的环境污染并使全球气候发生变化^[1]。

氢是一种清洁的新型能源，不含碳、硫及其他的有害杂质，和氧燃烧时只生成水，不会产生CO_x、SO_x和致癌物质，大大地减轻了对环境的污染，可以实现真正的“零排放”，保护了自然界的生态平衡，被认为是矿石燃料的最佳替代能源。氢除了具有化石燃料的各种优点外，还有它独特的优点，即：可储存性、可运输性好；不仅是所有已知能源中能量密度最大的燃料(122kJ·g^-1)，还可作为其他初级能源(如核能、太阳能)的中间载能体使用；转换灵活，使用方便，清洁卫生^[2]。因此，从20世纪70年代起，世界各国就对氢能的开发研究十分重视。

氢气可以通过很多工艺制取，包括电解水、光解水、热解水、热化学分解水和热催化重整、热解、气化、汽化富氢有机化合物等^[3-5]。当前，90％以上的氢气来自于天然气、轻油馏分的气化重整工艺，电解水、气化煤和重整甲烷也是工业上常用的方法^[6]。但这些方法大都以化石燃料为能源，属能量密集型产业，不利于环境保护与社会的持续发展。

生物制氢作为一种符合可持续发展战略的方向，已在世界上引起广泛重视，迄今为止，已有的生物制氢方法有蓝细菌和绿藻产氢^[7]、体外酶法生物制氢^[8]、厌氧发酵产氢^[9-13]、光合细菌产氢^[14-16]以及厌氧细菌与光合细菌耦合发酵产氢^[17-19]等多种。

光合细菌简称PSB(Photosynthetic Bacteria)，是一种能在厌氧光照或好氧光照条件下利用有机物作供氢体兼碳源，进行光合作用的细菌^[20]。光合细菌在光合磷酸化提供能量和有机物降解提供还原力的情况下，由固氮酶催化，进行代谢产氢。在厌氧光照条件下，光合菌的固氮产氢代谢过程是一个消耗大量ATP的吸能过程：

N₂+6H⁺+6e^-+12ATP→2NH₃+12ADP+12Pi  (1)

2H⁺+4ATP+2e^-→H₂+4ADP+4Pi          (2)

方程式(1)和(2)中的ATP来自光合磷酸化，因此，光照是影响光合细菌产氢代谢的重要因素，一定光强范围内，光合细菌的产氢活性随着光照强度的增加而增大，但当光强超过极限值时，光合系统吸收了超过光合作用所需要的能量，会引起PSI系统的过量激发，使光合作用效率下降，产生光抑制现象。光转化效率是光合细菌产氢能力高低的主要决定因素^[21]。

与厌氧发酵产氢相比，光合细菌制氢具有底物转化率高的优点，但产氢速率过低是制约其产业化的瓶颈。光合细菌制氢过程中，影响光合产氢的因素很多，主要有光照条件、菌株特性、接种浓度、培养时间、pH值、温度、菌龄、氢供体、氮源以及与氢代谢相关的三种酶的酶活等因素，其中最大的问题就是光的供给效率。光在光生物反应器(Photobioreactor，PBR)内随着光程的增加光强急剧下降，光强度分布很不均匀；同时，有些底物在代谢过程中，往往会着色，更进一步妨碍光的透过。另一方面，随着光合菌代谢生长，生物量的增加，PBR内透光率随之下降，因此赖以光能的产氢效率会显著下降。这已成为PBR光合菌制氢研究中亟待解决的技术难题^[22-24]。

因此，本领域迫切需要开发提高光合细菌制氢速度和效率的有效方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种提高光合细菌制氢速度和效率的有效方法。

在本发明的第一方面，提供了一种利用光合细菌制造氢气方法，包括步骤：

(a)在非静置状态和光照强度I₁的初始入射光照射下，培养产氢的光合细菌，其中所述的初始入射光的光照强度I₁满足以下条件：

(i)I₁＞I₀

式中，I₀是静置培养所述光合细菌时初始入射光的最适光照强度；

(ii)在所述光照强度I₁下，在非静置培养的光合细菌的培养体系中，至少70％区域(或体积)所受到的实际光照强度I₁′大于或等于在静置培养所述光合细菌时在最适光照强度I₀的初始入射光照射下同一区域(或体积)所受到的实际光照强度I₀′；

(b)从培养体系中分离出所述光合细菌所产生的氢气。

在另一类优选例中，I₁′与I₀′之比为1.2-2.0，更佳地为1.3-2.0。

在另一类优选例中，在步骤(a)中，平均产氢速率比静置培养时(在最适光照强度I₀下)的平均产氢速率高30％-80％；更佳地为40-60％。

在另一类优选例中，所述的初始入射光的光照强度I₁满足以下条件：

在所述光照强度I₁下，在非静置培养的光合细菌的培养体系中，至少80％(较佳地至少90％，更佳地至少99％，最佳地100％)区域(或体积)所受到的实际光照强度大于或等于在静置培养所述光合细菌时在最适光照强度Io的初始入射光照射下同一区域(或体积)所受到的实际光照强度。

在另一类优选例中，所述的光合细菌选自：类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)，荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)，或沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、或其组合等。

在另一类优选例中，所述的光合细菌是类球红细菌ZX-5。

在另一类优选例中，所述的光照强度I₁为5000-8000Lux，更佳地为6000-8000lux。

在另一类优选例中，在步骤(a)中，每L培养体系每小时的最大产氢速率≥125ml氢气，较佳地≥140ml氢气，更佳地≥150ml氢气，最佳地≥160ml氢气(例如每小时125-166ml氢气/l)。

在另一类优选例中，所述的非静置状态包括振荡培养、流动培养、或搅拌培养。

在本发明的第二方面，提供了一种提高光合细菌的产氢速率的方法，包括步骤：

(a)测定在静置培养光合细菌的条件下的最适初始入射光的光照强度，记为I₀，并测定在初始入射光的光照强度为I₀且静置培养光合细菌的条件下，所述静置培养体系的OD值，记为OD₀；然后根据静置培养的最适初始入射光的光照强度为I₀和所述静置培养体系的OD值，确定所述静置培养体系中不同区域所受到的实际光照强度；

(b)测定在非静置培养光合细菌的条件下，所述非静置培养体系的OD值，记为OD₁；

(c)根据非静置培养体系的OD值，确定非静置培养时最适的初始入射光的光照强度I₁，其中所述的初始入射光的光照强度I₁满足以下条件：

(i)I₁＞I₀

式中，I₀是静置培养所述光合细菌时初始入射光的最适光照强度；

(ii)在所述光照强度I₁下，在非静置培养的光合细菌的培养体系中，至少70％区域(或体积)所受到的实际光照强度I₁′大于或等于在静置培养所述光合细菌时在最适光照强度Io的初始入射光照射下同一区域(或体积)所受到的实际光照强度I₀′；和

(c)在非静置状态和所述的光照强度I₁的初始入射光照射下，培养光合细菌。

在另一类优选例中，所述的产氢速率包括平均产氢速率、或最大产氢速率。

在另一类优选例中，I₁′与I₀′之比为1.2-2.0，更佳地为1.3-2.0。

在另一类优选例中，所述的OD值是OD_660nm。

在另一类优选例中，在步骤(a)中，通过以下公式确定所述静置培养体系中不同区域所受到的实际光照强度：

I＝I₀e^{-(0.4762+0.3266OD660nm)·L}      (1)

其中I₀为初始入射光强度(lux)，I为一定光程距离上的光强(lux)，L为光程距离(em)，OD_660nm为以消光度表示的菌体浓度。

在另一类优选例中，所述的光合细菌是类球红细菌，更佳地是类球红细菌ZX-5。

在本发明的第三方面，提供了一种确定制造氢气的初始入射光的光照强度的方法，包括步骤：

(a)测定在静置培养光合细菌的条件下的最适初始入射光的光照强度，记为I₀，并测定在初始入射光的光照强度为I₀且静置培养光合细菌的条件下，所述静置培养体系的OD值，记为OD₀；然后根据静置培养的最适初始入射光的光照强度为I₀和所述静置培养体系的OD值，确定所述静置培养体系中不同区域所受到的实际光照强度；

(b)测定在非静置培养光合细菌的条件下，所述非静置培养体系的OD值，记为OD₁；

(c)根据非静置培养体系的OD值，确定非静置培养时最适的初始入射光的光照强度I₁，其中所述的初始入射光的光照强度I₁满足以下条件：

(i)I₁＞I₀

式中，I₀是静置培养所述光合细菌时初始入射光的最适光照强度；

(ii)在所述光照强度I₁下，在非静置培养的光合细菌的培养体系中，至少70％区域(或体积)所受到的实际光照强度I₁′大于或等于在静置培养所述光合细菌时在最适光照强度Io的初始入射光照射下同一区域(或体积)所受到的实际光照强度I₀′。

在另一类优选例中，所述的产氢速率包括平均产氢速率、或最大产氢速率。

在另一类优选例中，I₁′与I₀′之比为1.2-2.0，更佳地为1.3-2.0。

在另一类优选例中，所述的OD值是OD_660nm。

在另一类优选例中，在步骤(a)中，通过以下公式确定所述静置培养体系中不同区域所受到的实际光照强度：

I＝I₀e^{-(0.4762+0.3266OD660nm)·L}  (1)

其中I₀为初始入射光强度(lux)，I为一定光程距离上的光强(lux)，L为光程距离(cm)，OD_660nm为以消光度表示的菌体浓度。

在另一类优选例中，所述的光合细菌是类球红细菌，更佳地是类球红细菌ZX-5。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。以数值范围为例，一个范围的下限(如30％-80％中的30％)可以与另一个优选范围的上限(如40-60％中的60％)构成一个新的范围30-60％；反之亦然(例如构成范围40-80％)。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了光照强度对细胞生长(以OD_660nm表示)和氢气产量的影响。

图2显示了光程和菌体浓度对光强衰减的影响，其中图2a为平面图，图2b为曲面图。

图3显示了发酵液内部不同深度处光强的真实值与计算值的比较。

图4显示了静置培养与振荡培养的产氢过程曲线。

图5显示了静置培养与振荡培养过程中，OD_660nm、pH的变化曲线。

图6显示了振荡培养模式下，不同初始入射光强度对底物转化率和菌体生长(以OD_660nm表示)的影响。

图7显示了振荡培养模式下，不同初始入射光强度对最大产氢速率和平均产氢速率的影响。

图8显示了不同培养模式及初始入射光强度下，氢气产生速率的过程变化曲线。

图9显示了接种量变化对静置发酵和振荡发酵的底物转化率的影响。

具体实施方式

本发明人通过对影响光合产氢的诸多因素进行的广泛而深入的研究，意外地发现，通过非静置培养(如振荡培养)结合补光，可以非常有效地提高光合细菌制氢的效率，缩短光合细菌的周期同时维持很高的底物转化率。在此基础上完成了本发明。

具体而言，本发明人研究了不同培养模式下光照强度对光合细菌生长和产氢的影响，得出静置培养和振荡培养模式下的光饱和点分别为4000lux和6000lux。考察了Rhodobacter sphaeroides ZX-5培养体系中，光强随菌体浓度及光程距离衰减的规律，得到了描述光在菌液中衰减的数学关系式，并据此对培养过程中光强沿反应器径向的动态分布情况进行了测算。首次提出了振荡-补光的新型光发酵制氢策略，使得最大产氢速率可高达165.9ml H₂/lh。

光照强度

光照强度是光合生物生长和产氢的重要影响因子；发明人模拟了光在菌液中的传递，量化了光强在菌液中的分布；并通过静置培养和振荡培养的比较，指出光合细菌光饱和点不是固定不变的，而是随着外部培养环境和生理条件的变化而改变的；同时确立了振荡-补光的培养模式，大大提高光合细菌的产氢速率。

在本发明中，在非静置培养状态下，所采用的初始入射光的光照强度I₁满足以下条件：

(i)I₁＞I₀

式中，I₀是静置培养所述光合细菌时初始入射光的最适光照强度；

(ii)在所述光照强度I₁下，在非静置培养的光合细菌的培养体系中，至少70％(较佳地至少80％，更佳地至少90％，更佳地至少99％，最佳地100％))区域(或体积)所受到的实际光照强度I₁′大于或等于在静置培养所述光合细菌时在最适光照强度Io的初始入射光照射下同一区域(或体积)所受到的实际光照强度I₀′；

(b)从培养体系中分离出所述光合细菌所产生的氢气。

在优选例中，非静置培养状态下的实际光照强度I₁′与静置培养状态下同一区域(或体积)所受到的实际光照强度I₀′之比为1.2-2.0，更佳地为1.3-2.0。

光合细菌

可用于本发明的光合细菌没有特别限制，可以是任何一种在厌氧光照或好氧光照条件下利用有机物作供氢体兼碳源，进行光合作用的细菌^[20]。代表性的光合细菌包括(但并不限于)：类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)，沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、或其组合。

一类优选的光合细菌是类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。

一种特别优选的光合细菌菌株是公开号为CN 101168729A的中国专利申请中所公开的Rhodobacter sphaeroides(类球红细菌)ZX-5。Rhodobactersphaeroides(类球红细菌)ZX-5已经在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉)保藏，保藏号为CCTCC M 206099，保藏日为2006年9月18日。

Rhodobacter sphaeroides(类球红细菌)ZX-5的基本特性如下：

形态特征

类球红细菌ZX-5为革兰氏阴性，在RCVBN培养基中呈卵圆形，单个排列，菌体长0.99-1.31μm，宽0.5-0.7μm，繁殖方式是二分裂，无单根极生鞭毛，光合内膜结构为囊泡状。既能进行光照厌氧生长，又能进行黑暗需氧生长，该细菌在光照厌氧条件下生长较快，呈棕红色，菌落呈圆形，光滑，湿润，稍突起，边缘整齐，有光泽，不粘；它在暗好氧条件下，呈深红色，在平皿上菌落中央呈红色，四周呈乳白色。从光合色素成分分析，ZX-5的活细胞扫描结果为，该菌株既有类胡萝卜素的特征吸收峰，即478nm和513nm；还有细菌叶绿素a的特征吸收峰，即590nm、801nm和852nm.。

生理生化特征

在分光光度计660nm，测的菌株ZX-5稳定产氢时期的OD值为1.73左右，对数生长期OD值1.5左右为最佳接种时期。

其培养的pH值7.0±1.0，最适的pH值为6.8-7.5；

培养的温度在30±5℃，最适的温度为28-31℃；

光照条件为4500±2500lux，最佳光照强度为4500±500lux；

该细菌有广泛的碳源谱和产氢底物，产氢的最佳碳源为琥珀酸、丁酸、乳酸、苹果酸、乙酸、丙酸以及单糖、甘露醇等。但在利用己酸、苯甲酸、纤维二糖、可溶性淀粉和丙三醇类等碳源作底物时，菌株生长很好，但产氢性能相对来说不如利用琥珀酸、丁酸、乳酸、苹果酸、乙酸、丙酸以及单糖、甘露醇作为底物的情况；所述的底物浓度为10mM-60mM。

发酵或培养条件

在本发明中，适用的发酵和培养条件没有特别限制。根据所选择的光合细菌，可以选用本领域中常规的适合产氢的发酵和培养条件。

例如，以类球红细菌为例，可选用的发酵和培养条件包括：

(1)制备液体培养基：配制RCVBN种子培养基^[25]和产氢培养基(其中氮源由L-谷氨酸钠代替氯化铵)，将液体培养基放入高压灭菌锅内以121℃灭菌20分钟，取出培养基冷却至常温待用；其中，液体培养基的初始pH为：7±0.5；

(2)种子培养阶段：将Rhodobacter sphaeroides ZX-5甘油管菌液接种于装有RCVBN种子培养基的三角瓶中，并将接种后的液体培养基置于旋转式恒温摇床柜中培养；其中，培养条件：温度为30±1℃，转速为200rpm，无光照有氧培养，约17h后接种于产氢培养基；

(3)光合细菌产氢阶段：将种子培养液接种到装有RCVBN产氢培养基的38ml光生物反应器中，并将接种后的液体培养基置于恒温室，以白炽灯为光源，光照厌氧培养，并采用50ml无菌注射器或水排法收集氢气；其中，培养条件：温度为30±1℃。

应用前景

生物制氢所用的原料是城市污水、生活垃圾、动物粪便等有机废物。通过光合细菌或发酵细菌的处理可以获得氢气，同时净化水质，达到保护环境的作用。因此无论从环境保护，还是从新能源开发的角度来看，生物质制氢都具有很大的发展前途，它不仅能给人们提供清洁的能源，又能处理有机废物，保护环境，获得可观的经济效益，是一条可持续发展的路子。

利用廉价的生物质产氢是解决能源危机，实现废物利用、改善环境的有效手段。随着对能源需求量的日益增加，对氢气的需求量也不断加大，改进旧的和开发新的制氢工艺势在必行。从产氢的发展趋势上看，重点是选育高产氢的优势菌种和菌群，探索影响菌种和菌群的产氢适宜条件；设计产氢率高、易于推广使用的工艺和设备；从处理有机废水到直接的复杂有机废弃物(如天然纤维素、木质素和其它有机物)来大规模产氢；并且，利用其它一些物理、化学(如预处理和膜技术)和生物(如共培养技术)的方法对生物制氢的发酵末端产物进行更深一步的利用，提高产氢速率，使生物制氢绿色能源生产技术更具有开发潜力和巨大的优越性。

由光合细菌代谢制得氢气的纯度高，虽因生产规模等因素的不同，其纯度有所不同，但一般来说，只夹带有百分之几的水分和二氧化碳。对于氢气纯度要求高的应用对象，如磷酸性燃料电池要求纯度在60％以上，石油精制和化学材料等方面要求纯度在95％以上，半导体和冶金等工业则要求纯度在99.999％以上；光合细菌代谢制得氢气的纯度都能满足要求。若光合细菌产氢得到的氢气用于燃料电池，那么气体分离操作就不需要，这可能简化可再生能源生产系统。有文献预测日本的产业、畜牧业废水、生活污水处理的污泥和厨房垃圾等生物质经光合细菌得到的氢气可达55亿m³/年，相当于日本国内小轿车的11％(相当于日本九州小轿车总数)所消耗的能源，利用生物质光合细菌产氢的生物转化技术，开发21世纪新能源是造福于人类的重要创举。

作为环境友好的洁净能源和高能燃料，氢气在国民经济诸多领域中具有十分重要的用途。可广泛用于航天飞机、火箭等航天工业部门和城市公共交通工具的清洁燃料，世界上一些发达国家已开发出以液氢为燃料的公共汽车；氢气用作保护气体在电子工业和金属高温加工过程中(例如：集成电路，显像管的制备等)也具有广泛的用途。此外，氢气在炼油工业中可用于加氢精制，在有机合成、合成氨工业及食品加工等行业中用途也十分广泛。1994年美国用氢量已达66.1亿m³，日本在1996年用氢量已达1.81亿m³，其中，液氢用量4000m³，都呈逐年递增趋势。氢能的应用将势不可挡的进入社会生活的各个领域，以氢为燃料的燃料电池将替代靠热机原理工作的发电机，汽车等现代交通工具将从根本上解决尾气的环境污染问题。生物制氢技术作为一种符合可持续发展战略的课题，正在成为各发达国家和发展中国家的短期和长期发展战略目标。氢能源将与人类生产、生活关系越来越密切，发展生物制氢技术势在必行。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明建立并验证了一种新型的“非静置培养+补光”光发酵产氢工艺，有效地提高了光合细菌的产氢速率，缩短了光合细菌的发酵周期并可以维持很高的底物转化率，大大降低了发酵生产成本；

(2)本发明提出一种模拟光在菌液中的传递，建立光衰减动力学方程式，量化光强在菌液中的动态分布，进而确定光合细菌最适光强的研究方法和思路。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)以及陈坚等人，生物实验室系列-发酵工程实验技术(北京：化学工业出版社，2003)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另外说明，否则份数和百分比为重量份数和重量百分比。

实施例1

1材料与方法

1.1菌种和培养条件

菌种：Rhodobacter sphaeroides ZX-5(公开号CN 101168729A购自中国科学院上海生命科学研究院)；

种子培养：1ml Rhodobacter sphaeroides ZX-5甘油管菌液接种于装有100mlRCVBN种子培养基的250ml三角瓶中，初始pH＝7±0.5，30±1℃，200rpm，无光照有氧培养，约17h接种于产氢培养基；

产氢培养：1ml种子液接种于装有34ml RCVBN产氢培养基(其中氮源由L-谷氨酸钠代替)的38ml光合试管(用橡皮塞密封)中，初始pH＝7±0.5，30±1℃，光照厌氧培养，并采用50ml无菌注射器收集氢气。

1.2光衰减动力学的测定

取一系列不同培养期的光合细菌培养液，注入比色皿中，并通过改变比色皿的个数改变光程，以白炽灯为光源，用光照度计测量光通过不同浓度的菌液时的衰减情况，菌液的深度(即光程)分别为1、2、3、4cm。入射光的初始光强为6800lux。

1.3实验器材与检测方法

光源采用60W白炽灯；

pH值测量采用FE 20型实验室pH计(Mettler-Toledo仪器有限公司)；

生物量的测量以OD_660nm表示，采用Spectrumlab 22pc型分光光度计(上海棱光技术有限公司)；

光照度的测量采用ZDS-10自动量程照度计(上海市嘉定学联仪表厂)；

气体成分及氢气含量的测定采用尾气质谱分析仪(Extrel CMS Max 300-LG，USA)；

种子培养采用旋转式恒温调速摇床柜(上海欣鑫自动化设备有限公司)；

振荡产氢培养采用TS-1型脱色摇床(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

2实验结果

2.1光照强度对光合细菌生长和产氢性能的影响

实验研究了点光源垂直照射培养面的最大光照强度为2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000lux时对光合细菌产氢能力的影响，结果见表1。从表1可知，随着光照强度的增加，发酵周期由91h缩短至72h，最大产氢速率和平均产氢速率逐渐增加，但pH几乎不随光强的变化而变化。另外，从图1可知，光强从2000lux增加到4000lxu时，氢气的产量逐渐增加；光强为4000lux时产量最大，达到123ml H₂/34ml培养基；光强从4000lux增加到9000lux过程中，氢气产量略有下降，但变化不大。

说明光强4000lux为该培养条件下Rhodobacter sphaeroides ZX-5的最适光强，达到“光饱和”现象(图1)。

表1-光照强度对光合细菌生长和产氢能力的影响

2.2光衰减动力学方程的建立

实验研究了光在菌液传递过程中衰减的特性，在光合细菌Rhodobactersphaeroides ZX-5的培养体系中，以6800lux为初始入射光光强，分别测量不同菌体浓度(以OD_660nm表示)和不同菌液深度(即光程距离)对光的衰减，结果见表2和图2。

表2-发酵液的深度(光程)以及菌体浓度对光强衰减的影响

从图2可以看出，在Rhodobacter sphaeroides ZX-5的培养体系中，随着菌体浓度和光程距离的增加，光强迅速下降。这一结果表明：在同一光程距离处，光强是随着菌体浓度的增加而变化的，培养初期，菌体浓度小，光衰减程度低，而培养后期，随着菌体浓度的增加，具体细胞的遮光作用增强，光衰减严重。

将上述结果进行回归分析，即可得到光强在Rhodobacter sphaeroides ZX-5的培养体系中衰减的方程式：

I＝I₀e^{-(0.4762+0.3266OD660nm)·L}    (1)

其中I₀为初始入射光强度(lux)，I为一定光程距离上的光强(lux)，L为光程距离(cm)，OD_660nm为以消光度表示的菌体浓度。

由(1)式计算的不同距离和菌体浓度下I值与实测值进行比较，结果见图3。从图3中可知，除了去离子水(OD_660nm＝0)的计算值与实测值误差较大，其余的计算值与实测值均能够较好地吻合，说明所获得的光衰减动力学方程能够较好地描述光强在菌液中随光程及菌体浓度的变化情况。

光衰减动力学方程的建立，有助于对光强在发酵液内部分布的了解；可以量化光强在菌液传递的衰减情况，并据此对培养过程中光强沿反应器径向的动态分布情况进行了估算。

2.3不同培养方式对光发酵产氢的影响

实验2.1采用静置培养的方式，发现产氢过程中试管底部有菌体沉淀的现象；因此，在该部分实验中，采用振荡培养的方式使得菌液混合更加均匀，同时通过振荡培养使氢气析出迅速，尽量减少底物抑制，观察能否提高产氢速率。

根据实验2.1的结果，振荡培养选在4000lux光强下进行，实验结果见表3和图4。

表3-不同培养模式对光发酵产氢的影响

	静置培养	振荡培养
			氢气总产量(ml H2/34ml)	123±4	95±4
氢气含量(％)	81.85	82.68
			底物转化率(％)	89.72	69.3
最大氢气产率(ml H2/lh)	104.38	100.99
			平均氢气产率(ml H2/lh)	44.66	46.57
发酵周期(h)	81±5	60±4
			最终OD660nm	1.73±0.12	2.35±0.09
最终pH	7.16±0.06	7.17±0.08

从表3可知，振荡光发酵与静置光发酵相比，大大的缩短了发酵周期，但是底物转化率较低，仅为静置培养时的77.24％；导致了最终无法提高最大产氢速率和平均产氢速率；所以，能否提高振荡发酵的底物转化率，直接影响是否可以大幅度提升光发酵的产氢速率。

静置培养与振荡培养过程中，OD_660nm、pH的变化曲线如图5所示。

由图5可知：在光发酵过程中，振荡培养从第9小时开始，OD_660nm值始终大于静置培养的OD_660nm值，并且从18小时开始，两个体系的OD_660nm值均趋于稳定，达到菌体生长的稳定期；另外，与图4比较，不管是振荡光发酵还是静置光发酵，产氢均发生在生长稳定期内。

根据2.2得到的光衰减动力学方程可知，OD_660nm值大，意味着光在菌液传递的过程中衰减更加严重；所以推断：可能是因为菌液中光强的不足，导致振荡光发酵的底物转化率偏低。

拟设计补光实验，通过提高初始入射光光强，观察是否可以提高振荡光发酵的底物转化率低，从而达到提高光发酵产氢速率的目的。

2.4振荡-补光发酵工艺的确立

2.4.1实验目的

根据振荡培养OD_660nm偏大的实验结果，进行光强的补充实验，观察是否可以通过增加入射光强度来提高底物的转化率。

从2.3实验结果看出，振荡培养发酵结束的OD_660nm较高，可能振荡培养使得发酵液混合均匀，菌体不会聚集沉淀(静置培养有菌体沉淀的现象)，有利于菌体的生长，与此同时，菌体的生长(OD_660nm的增加)导致光在发酵体系中衰减严重，使得光照强度不足，产氢量下降。因此，采取补充光强的策略，观察能否改善菌体的生理环境，提高底物转化率。

2.4.2实验原理

根据实验2.2得到的光衰减动力学方程进行估算：

I＝I₀e^{-(0.4762+0.3266OD660nm)L}

假设初始入射光(incident light)为4000lux时，静置培养结束时OD_660nm为1.73，振荡培养结束时OD_660nm为2.35，见表3；又因为从18小时开始，两个体系的OD_660nm值均趋于稳定，见图5，所以假定发酵结束时的OD_660nm等于产氢过程中的OD_660nm，试管内径2cm；那么，相同光强在振荡培养和静置培养时菌液中的分布，见表4。

通过提高初始入射光的强度，使得光强在振荡培养时菌液中的分布与静置培养时的相当或者优于静置发酵的光照条件，观察能否提高振荡光发酵的底物转化率。

表4-不同培养模式及初始入射光强度对发酵液中光强分布的影响

与静置光发酵相比，初始入射光光强同样为4000lux时，在振荡培养条件下的衰减要严重的多；当初始入射光光强达到5000lux时，可以保证光强在1cm光程以内，能够与静置条件下(初始入射光为4000lux)的光强分布相似，但是1cm以外，则要则要弱于静置条件下的光强分布；而当把初始入射光光强提高至6000lux时，则在光程为2cm处，光强度几乎与静置发酵时一致，而在反应器内部则优于静置光发酵的光强分布；当振荡光发酵的光强到达7000lux～8000lux时，其在反应器内部的光强分布则远远优于入射光为4000lux时的静置光发酵。

2.4.3实验结果

结果如表5和图6所示。

表5-不同培养模式及不同初始入射光强度对光发酵产氢的影响

由实验结果表5可知，通过补光实验，随着光强的增加，振荡培养的氢气产量上升，OD_660nm下降；说明光照强度不足是导致振荡培养发酵底物转化率低的原因之一。

由图6知，光强从4000lux增加到8000lux过程中，对pH影响不大，基本维持稳定在pH：7.18±0.03；而OD_660nm却从2.35下降到1.86，与静置培养的OD非常接近。另外，随着光强的补充，氢气的得率逐渐增加；但是当光强达到6000lux时，再增加光强，振荡培养的氢气得率不再增加，几乎维持恒定，达到振荡培养时的光饱和点，说明6000lux为振荡光发酵条件下的光饱和点，这与静置培养时400lux为光饱和点是不一致的。

通过该实验可以得出：光合细菌的光饱和点是随着外部环境条件的变化而发生变化的，并非固定不变的。

振荡培养模式下，不同初始入射光强度对最大产氢速率和平均产氢速率的影响如图7所示。

由图7知：通过光强的增加，振荡培养的发酵周期缩短，氢气得率提高，进而使得平均产氢反应速率和最大产氢速率均得到大幅度的提高。

表6为国内外报道的采用不同底物、不同菌种进行光合细菌产氢所得到的最大产氢速率及底物转化率等数据；通过比较可知，采用本实验发明的振荡-补光发酵工艺，其最大产氢速率高达165.9ml H₂/l h，达到国际先进水平。

表6-国内外报道的一些光发酵产氢的

最大产氢速率和底物转化率的部分数据汇总

2.4.4反馈验证及现象解释

通过补光实验，在底物转化率提高的同时，伴随着OD_660nm值的下降，那么根据补光实验后的OD_660nm值，重新计算各个光照强度下，振荡培养时光强在菌液中的分布，见表7。

表7-不同培养模式及初始入射光强度对发酵液中光强分布的影响

^*注：I₁′/I₀′为同一区域的实际光照强度之比。

通过计算发现，初始入射光强度从5000lux到8000lux，振荡培养菌液内部的光强分布均优于光强为4000lux的静置发酵，直观上表现在振荡培养的光照强度的饱和点为6000lux左右，而静置发酵仅为4000lux；这就说明振荡发酵改变了菌体的生长和产氢的生理环境，导致需要更强的光照才能满足菌体产氢的生理需要。

此外，当90％以上(更佳地95％以上(如100％))的同一区域的实际光照强度之比(I₁′/I₀′)为1.2-2.0时，非静置培养的光合细菌的平均产氢速率和最大产氢速率有显著提高。

不同培养模式及初始入射光强度下，氢气产生速率的过程变化曲线如图8所示。

图8选取了入射光为6000lux和8000lx的振荡光发酵，以及入射光为4000lux静置发酵，对它们发酵过程中的产氢速率的变化进行比较，发现：与静置发酵相比，振荡发酵维持高产氢速率的时间较长，而静置发酵短暂的出现最大产氢速率后，产氢速率就开始缓慢的下降，形成“拖尾”现象，而不能在较长时间维持较高的产氢速率。

由于光合细菌要维持较高的产氢速率，必须需要充足的能量(ATP)的供给，ATP来源于细菌内部的光合系统吸收光子，通过光合磷酸化作用获得大量能够(ATP)维持菌体的产氢需求；所以，要维持较高的产氢速率，必须要供给相对于静置发酵更多的光能，才能满足振荡条件下菌体产氢的需求^[20-21]。

3结论

1、实验研究了不同光照强度对光合细菌产氢的影响，确定了4000lux为静置培养条件下的最佳光照强度；

2、实验模拟了光在菌液中的衰减情况，建立了光衰减动力学方程；

3、实验研究了不同培养方式下的光饱和点的变化，指出光合细菌的光饱和点随着外部培养环境的变化而的改变，并非固定不变的；

4、实验提出了振荡-补光的新型光发酵思路与工艺，提高了光发酵的最大严氢速率，使之达到国际领先水平。

实施例2

用荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)进行振荡发酵产氢

重复实施例1，不同点主要在于：用表6中所给出的荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)(Shi X-Y等人，2005)替换类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)ZX-5。

结果表明，在碳源为30mM乙酸的情况下，当I₀为4000lux，I₁为6000lux的情况下，底物总转化率虽然提高幅度不大(约10-20％)，但是产氢速度大幅提高，最大产氢速率提高80％，平均产氢速率也提高70％，从而大幅度缩短了生产周期。

实施例3

其他因素(如接种量)对底物转化率的影响

在本实施例中，通过改变接种量，观察其对静置培养或非静置培养(振荡发酵)时底物转化率以及产氢速率的影响。

试验方法同实施例1，不同点在于，光合细菌的接种量分别采用0.30％、0.60％、1.20％、2.40％、3％、6％、12％、15％、20％、25％和30％。其中，振荡培养和静置培养的初始入射光强度都是4000Lux。

结果如图9所示。由图9可知，接种量的变化，对底物转化率的影响并不显著，不能有效的提高振荡发酵的底物转化率，因此没有达到提高产氢速率的目的。通常可选用2.40-6％的接种量。接种量太小，发酵的延滞期变长，导致发酵周期延长；接种量过大，会导致光合试管培养基的体积减少，也不利于氢气的生产。

此外，还测定了改变碳源浓度(如改变培养基中的苹果酸浓度)对底物转化率的影响。结果表明，不管是静置培养还是振荡培养，减少或者增加C源浓度对提高底物转化率基本上没有影响(数据未示出)。

从接种量实验和C源浓度变化实验可知，采用该两种方法并不能显著的改善振荡培养的底物转化率。与之相反，采用振荡-补光的策略，却出乎意料地提高了振荡培养的底物转化率，进而大幅度的提高产氢速率。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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Claims (5)

1.一种利用光合细菌制造氢气的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在非静置状态和光照强度I₁的初始入射光照射下，培养产氢的光合细菌，所述的光照强度I₁为5000-8000Lux；：

(b)从培养体系中分离出所述光合细菌所产生的氢气。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，平均产氢速率比静置培养时的平均产氢速率高30％-80％。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的光合细菌选自：类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)，或沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)，或其组合。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的光照强度I₁为6000-8000lux。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，每L培养体系每小时的最大产氢速率≥125ml氢气。

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