CN103865797B - 一种富硒枯草芽孢杆菌酶解物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富硒枯草芽孢杆菌酶解物及其制备方法，该方法包括如下步骤：将富硒煤矸石通过酸液浸泡溶解硒元素，磷酸盐溶液沉降处理重金属，过滤，调节滤液pH至中性，加入枯草芽孢杆菌生长所必需的碳源和氮源得富硒培养基，灭菌，接种枯草芽孢杆菌培养，收集枯草芽孢杆菌菌体，并调节使菌体自溶，加溶菌酶后酶解细胞壁，得富硒枯草芽孢杆菌酶解物，可用于医药、食品、饲料等领域。

Description

一种富硒枯草芽孢杆菌酶解物及其制备方法

技术领域

本发明微生物技术领域，涉及利用枯草芽孢杆菌生产富硒枯草芽孢杆菌酶解物的方法和所得到的富硒枯草芽孢杆菌酶解物。

背景技术

硒是人体必需的微量元素之一，具有维护心脏生理功能增加免疫能力、对抗异常细胞和致突变作用、对抗生物体内有毒重金属、抗氧化、抗癌、排毒解毒、保肝护肝等作用。同时，硒对白内障心血管疾病、克山病、大骨节病、关节炎等疾病也有一定的防治作用。

硒以无机硒和有机硒两种形式存在，有机枯草芽孢杆菌硒具有安全高效的特点。研究表明，有机硒的中毒剂量远高于无机硒，其生物利用率也远高于无机硒产品。有机硒最主要的优点是有效硒的含量高，与亚硒酸钠比生物利用率高。Austincanor（1973）报告，在防止家禽胰腺退化方面，硒蛋氨酸的效果是亚硒酸钠的四倍，这表明有机硒的效果比无机硒（亚硒酸钠）好。

枯草芽孢杆菌作为一株安全常用菌，其菌体在生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用。这些酶类可以将大分子的蛋白质和淀粉降解为小分子的氨基酸、多肽和糖类物质。

目前，硒元素的主要来源是硒酸盐、亚硒酸盐，然而这些都是剧毒无机盐，在大规模生产过程中必定会对人体有一定程度的伤害。同时，未完全转化为有机硒的硒酸盐、亚硒酸盐经过处理后仍难以避免残存，不利于发酵食品的生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种富含有机硒的枯草芽孢杆菌酶解物及其制备方法。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究和不懈探索，最终获得了如下技术方案：

一种富硒枯草芽孢杆菌酶解物，所述的富硒枯草芽孢杆菌是将枯草芽孢杆菌在富硒培养基中培养后酶解所得，所述富硒培养基中的硒元素来源为富硒煤矸石。

一种上述富硒枯草芽孢杆菌酶解物的制备方法，该方法包括如下步骤：将富硒煤矸石通过酸液浸泡溶解硒元素，磷酸盐溶液沉降处理重金属，过滤，调节滤液pH至中性，加入枯草芽孢杆菌生长所必需的碳源和氮源得富硒培养基，灭菌，接种枯草芽孢杆菌培养，收集枯草芽孢杆菌菌体，并调节使菌体自溶，加溶菌酶后酶解细胞壁，得富硒枯草芽孢杆菌酶解物。

优选地，如上所述富硒枯草芽孢杆菌酶解物的制备方法，其中所述的酸液为亚硫酸溶液，所述的磷酸盐溶液为磷酸钠溶液。

进一步优选地，如上所述富硒枯草芽孢杆菌酶解物的制备方法，该方法具体包括如下步骤：

1）将富硒煤矸石粉碎至直径在40-100目之间，置于浓度为10%-20%（v/v）亚硫酸溶液中浸泡24-48h，同时使用超声震荡，加速富硒煤矸石中的硒元素溶解；

2）取磷酸钠溶液对富硒煤矸石中重金属进行沉淀处理，过滤，滤液用碱液调pH至中性；

3）加入枯草芽孢杆菌生长所必需的碳源和氮源得富硒培养基，灭菌，接种枯草芽孢杆菌培养，得富硒枯草芽孢杆菌；

4）将富硒枯草芽孢杆菌接种到发酵液中，发酵至其中生物量为50-70g/L；

5）发酵得到的菌液经分离浓缩得到含富硒枯草芽孢杆菌干物质100-150g/L的发酵液，调节发酵液pH值为8.5-9.5，75-85℃保温8-10h，继续升温至100℃煮沸10-60min，得到自溶枯草芽孢杆菌液；

6）待自溶枯草芽孢杆菌菌液温度降至30-40℃，调整pH值至6.5-7.0，加入自溶枯草芽孢杆菌菌液重量的0.02%-0.05%（w/v）的溶菌酶，30-40℃酶解60至90min；

7）煮沸10-30min灭酶，离心分离，去除枯草芽孢杆菌细胞壁；所得枯草芽孢杆菌发酵液经干燥后，即得富硒枯草芽孢杆菌酶解物。

再进一步优选地，如上所述富硒枯草芽孢杆菌酶解物的制备方法，其中步骤（2）中所述的碱液是以下任一种或多种碱的水溶液：氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钾、氢氧化钙。

本发明在培养枯草芽孢杆菌的过程中加入硒元素，枯草芽孢杆菌生长时吸收利用了硒，使硒与枯草芽孢杆菌内的蛋白质有机结合转化为生物硒，合成硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸，从而获得了富硒枯草芽孢杆菌，其作为食品加工的原料时消除了无机硒不易被人吸收，且无机硒过量摄入容易中毒的问题。

与现有技术相比，本发明涉及的富硒枯草芽孢杆菌酶解物及其制备方法具有如下优点和进步：

（1）本发明的富硒芽孢杆菌发酵得到的产品生物量高，枯草芽孢杆菌细胞中的有机硒含量高，每公斤富硒枯草芽孢杆菌酶解物中含有机硒100-320mg，氨基酸态氮含量为1.5-2.5%（w/w），酶解物中碱性蛋白酶活力为4200-4800U/g，脂肪酶活力450-480U/g，可用于医药、食品、饲料等领域。

（2）通过本发明的制备方法所得到的富硒枯草芽孢杆菌酶解物含有大量的氨基酸及短肽，极易被动物所消化吸收，枯草芽孢杆菌中的有机硒随氨基酸及小肽的吸收而被充分吸收，大大提高了有机硒的消化利用率，同时酶解富硒枯草芽孢杆菌还有特殊的风味。

（3）采用富硒煤矸石作为硒元素的来源，拓宽了用于枯草芽孢杆菌富硒的硒源材料，有利于硒矿资源的充分利用，同时避免了无机亚硒酸盐的使用，从而提高了生产过程及产品的安全性。

具体实施方式

无机硒和有机硒的定性分析方法：取枯草芽孢杆菌菌液和富硒枯草芽孢杆菌菌液分别加入试管中，再加入15％（v/v）的半胱氨酸溶液，摇匀静置，加入0.05-0.1mL0.25％（v/v）亚甲蓝溶液，并计时。对于有机硒，亚甲蓝的褪色时间为5-10min，对于无机硒，亚甲蓝的褪色时间为30-60s。根据亚甲蓝的褪色时间可定性鉴别无机硒和有机硒。

无机硒和有机硒的定量分析方法：吸取样品处理滤液0.5-2.0mL于聚四氟乙烯内，依次加2.0-3.0mL硝酸、1.0mL过氧化氧，摇匀，消化。选择溶样压力1.0-2.0MPa，时间5-10min内消解完全。样品溶液无色透明，取出冷却，用纯水定容至25mL备用。同时做试剂空白。测定菌液中无机硒含量。总硒量减去无机硒含量即得有机硒含量。

氨基酸态氮含量测定方法：在枯草芽孢杆菌和富硒枯草芽孢杆菌菌液中加入10.0mL40%甲醛溶液，混匀，再用氢氧化钠标准液继续滴定至pH9.2，记下消耗氢氧化钠标准液的量（mL）；同时取100mL水先用氢氧化钠溶液调节pH至8.2，再加入10.0mL40%甲醛溶液，用氢氧化钠标准液滴定至pH9.2，同时做空白实验。根据消耗氢氧化钠标准液的量，计算出氨基酸态氮的含量。

碱性蛋白酶活的测定方法：富硒前后枯草芽孢杆菌菌液分别加入1%酪蛋白溶液1mL，于40℃水浴15min，加入0.4mol/L三氯醋酸3mL，摇匀过滤。吸取滤液1mL加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL，福林试剂1mL，摇匀于40℃水浴15min，在680nm处测定吸光度，即得碱性蛋白酶活。

脂肪酶活的测定方法：将枯草芽孢杆菌及富硒枯草芽孢杆菌菌液加入到以对硝基苯酚辛酸酯作为酶催化水解的底物，反应体系为1mL，缓冲体系为50mmol/LTris-HCl(pH8.5)的溶液中，对硝基苯酚辛酸酯的终浓度为0.2mmol/L，酶终浓度100μg/mL，在43℃反应1min，用紫外-可见分光光度计测定420nm的吸光度。1个酶活力单位(U)定义为1min内水解底物生成1μmol对硝基苯酚所需要的酶量，即得脂肪酶活力。

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1

1）选取颗粒大小均匀，直径在100目的富硒煤矸石100g，置于400mL亚硫酸溶液（浓度为20%，v/v）中浸泡36h，同时使用超声震荡，加速富硒煤矸石溶解；

2）取200mL磷酸钠溶液（浓度为10%，v/v）对富硒煤矸石中的重金属进行沉淀处理，过滤；

3）将滤液用0.1mol/L的NaOH溶液调pH至7.0，加入LB液体培养基中得富硒培养基（含硒200μg/mL）。LB培养基：1%（w/w）蛋白胨，0.5%（w/w）酵母浸粉，1%（w/w）氯化钠，用蒸馏水配置，pH7.0，121℃灭菌20min；

4）一级液体种子培养：将枯草芽孢杆菌ATCC6633株按5%的接种量接种在富硒LB液体培养基中，在37℃、pH值为7的条件下培养20h即为液体菌种；

5）二级液体种子培养：将一级液体种子按3%的量接入10L的卡氏罐中，其中含硒量为100μg/mL的LB液体培养基，在37℃、pH值为7的条件下培养20h即为二级液体菌种。

6）三级液体种子发酵培养：将二级液体种子按5%的接种量接种到含硒量为300μg/mL的LB液体培养基，在37℃、pH值为7的条件下培养20h即为三级液体菌种。

7）发酵罐发酵：将三级种子培养液按10%的接种量接入装有10m³的含硒量为400μg/mL的LB液体培养基，在37℃、pH值为7的条件下培养至发酵液生物量为70g/L。

8）将步骤7）得到的发酵液通过碟式离心机离心（3500r/min）洗涤，去除无机硒及其他杂质浓缩至含干富硒枯草芽孢杆菌物质为100μg/mL的发酵液，然后调整pH为7.0，升温至80℃保温自溶8h，自溶期间每隔1h开动搅拌2-5min，加快细胞内酶的反应速度。继续升温至100℃煮沸30min。自溶结束后，调整物料pH为7.0，在自溶枯草芽孢杆菌液中加入液重的0.05%（w/v）溶菌酶，在55℃条件下保温酶解70min。

9）煮沸30min灭酶，碟式离心机离心（3500r/min）分离，去除枯草芽孢杆菌细胞壁。酶解完成的枯草芽孢杆菌酶解液在薄膜蒸发器中浓缩至含固含物40%的浓缩酶解富硒枯草芽孢杆菌膏状物。

10）用泵将浓缩酶解富硒枯草芽孢杆菌膏状物泵入喷雾干燥塔的喷雾盘，通过喷雾盘以转速为15000r/min将浓缩富硒枯草芽孢杆菌膏状物产品瞬间干燥成含水量在6.0%以下的粉状产品，并抽样检测有机硒含量、氨基酸态氮含量、碱性蛋白酶活和脂肪酶活，结果见表1。

表1实施例1中富硒前后枯草芽孢杆菌参数对照

实施例2

1）选取颗粒大小均匀，直径在80目的富硒煤矸石100g，置于300mL亚硫酸溶液（浓度为15%，v/v）中浸泡24h，同时使用超声震荡，加速富硒煤矸石溶解；

2）取150mL磷酸钠溶液（浓度为10%，v/v）对富硒煤矸石中的重金属进行沉淀处理，过滤；

3）将滤液用0.1mol/L的NaOH溶液调pH至6.0，加入LB液体培养基中得富硒培养基。LB培养基：1%（w/w）蛋白胨，0.5%（w/w）酵母浸粉，1%（w/w）氯化钠，用蒸馏水配置，pH7.0，121℃灭菌20min；

4）一级液体种子培养：将枯草芽孢杆菌ATCC6633株按5%的接种量接种在富硒LB液体培养基中（含硒100μg/mL），在37℃、pH值为7.4的条件下培养20h即为液体菌种。

5）二级液体种子培养：将一级液体种子按5%的量接入10L的卡氏罐中，其中含硒量为250μg/mL的LB液体培养基，在37℃、pH值为7.4的条件下培养20h即为二级液体菌种。

6）三级液体种子发酵培养：将二级液体种子按5%的接种量接种到含硒量为350μg/mL的LB液体培养基，在37℃、pH值为7.4的条件下培养20h即为三级液体菌种。

7）发酵罐发酵：将三级种子培养液按10%的接种量接入装有10m³的含硒量为550μg/mL的LB液体培养基，在37℃、pH值为7.4的条件下培养至发酵液生物量为70g/L。

8）将步骤7）得到的发酵液通过碟式离心机离心（3500r/min）洗涤，去除无机硒及其他杂质浓缩至含干富硒枯草芽孢杆菌物质为100μg/mL的发酵酶解液，调整pH为7.0，升温至80℃保温自溶8h，自溶期间每隔1h开动搅拌2-5min，加快细胞内酶的反应速度。继续升温至100℃煮沸30min。自溶结束后，调整物料pH为7.4，在自溶枯草芽孢杆菌液中加入液重的0.1%（w/v）溶菌酶，在55℃条件下保温酶解80min。

9）煮沸30min灭酶，碟式离心机离心（3500r/min）分离，去除枯草芽孢杆菌细胞壁。酶解完成的枯草芽孢杆菌酶解液在薄膜蒸发器中浓缩至含固含物50%的浓缩酶解富硒枯草芽孢杆菌膏状物。

10）用泵将浓缩酶解富硒枯草芽孢杆菌膏状物泵入喷雾干燥塔的喷雾盘，通过喷雾盘以转速为15000r/min将浓缩富硒枯草芽孢杆菌膏状物产品瞬间干燥成含水量在6.0%以下的粉状产品，并抽样检测有机硒含量、氨基酸态氮、碱性蛋白酶活和脂肪酶活，结果见表2。

表2实施例2中富硒前后枯草芽孢杆菌参数对照

。

Claims (2)

1.一种富硒枯草芽孢杆菌酶解物的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：将富硒煤矸石通过酸液浸泡溶解硒元素，磷酸盐溶液沉降处理重金属，过滤，调节滤液pH至中性，加入枯草芽孢杆菌生长所必需的碳源和氮源得富硒培养基，灭菌，接种枯草芽孢杆菌培养，收集枯草芽孢杆菌菌体，并调节使菌体自溶，加溶菌酶后酶解细胞壁，得富硒枯草芽孢杆菌酶解物；该方法具体包括如下步骤：

1）将富硒煤矸石粉碎至直径在40-100目之间，置于浓度为10%-20%（v/v）亚硫酸溶液中浸泡24-48h，同时使用超声震荡，加速富硒煤矸石中的硒元素溶解；

2）取磷酸钠溶液对富硒煤矸石中重金属进行沉淀处理，过滤，滤液用碱液调pH至中性；

3）加入枯草芽孢杆菌生长所必需的碳源和氮源得富硒培养基，灭菌，接种枯草芽孢杆菌培养，得富硒枯草芽孢杆菌；

4）将富硒枯草芽孢杆菌接种到发酵液中，发酵至其中生物量为50-70g/L；

5）发酵得到的菌液经分离浓缩得到含富硒枯草芽孢杆菌干物质100-150g/L的发酵液，调节发酵液pH值为8.5-9.5，75-85℃保温8-10h，继续升温至100℃煮沸10-60min，得到自溶枯草芽孢杆菌液；

6）待自溶枯草芽孢杆菌菌液温度降至30-40℃，调整pH值至6.5-7.0，加入自溶枯草芽孢杆菌菌液重量的0.02%-0.05%（w/v）的溶菌酶，30-40℃酶解60至90min；

7）煮沸10-30min灭酶，离心分离，去除枯草芽孢杆菌细胞壁；所得枯草芽孢杆菌发酵液经干燥后，即得富硒枯草芽孢杆菌酶解物。

2.根据权利要求1所述富硒枯草芽孢杆菌酶解物的制备方法，其特征在于步骤（2）中所述的碱液是以下任一种或多种碱的水溶液：氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钾、氢氧化钙。