CN102220345B - 重组犬α干扰素的优化基因、菌种及高效表达 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一条重组犬干扰素α编码基因的优化序列、含有该序列的表达载体，以及一株含有该表达载体的重组犬干扰素α的大肠埃希氏菌，本发明所述菌种能够高效表达犬α干扰素，其表达量可达40%以上，表达蛋白比活性高，本发明还涉及一种制备犬干扰素α的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种优化的重组犬α干扰素基因及表达菌种，属于基因工程生物制药领域。
背景技术
犬类动物作为伴侣动物、警犬、救护犬等在人类的生活中占据日益重要的地位，与之相伴的犬类各种病毒性疾病也在人们的生活中重复发生，有些成为人畜共患病的病原，引起全社会的关注。但在兽医临床方面，目前还没有一种治疗病毒性疾病的特效药。
1957年，英国科学家Alick Isaacs和Iean Lindenmann首次发现一种能够干扰病毒繁殖的物质，称之为干扰素（interferon, IFN），从此开始了干扰素的研究工作。
1987年，Himmler等首先开始了犬干扰素α（CaINF-α）的研究工作，报道了CaINF-α基因序列（GenBank M28624.1 GI:163973）[Himmler A,Hauptmann R,Adolf G R.Structure and expression in Escherichia coli of canine interferon-alpha genes.J Interferon Res.1987.7:173]，并申报了相关专利。我国的科学工作者于上世纪90年代也相续开始了犬干扰素α的研究工作，并在犬干扰素α的基因重组、克隆、表达等方面取得了一系列的研究结果。其中，夏春等[夏春，汪明，夏兆飞.拉布拉犬和德国牧羊犬干扰素α基因克隆及测序.农业生物技术学报1999，7（3）]进行了拉布拉多犬和德国牧羊犬干扰素α基因克隆及测序的研究，但没有后续的关于表达、应用等方面的研究报道。王艳等[王艳，王海震，曹瑞兵等.犬α干扰素基因的高效表达及其活性测定.中国病毒学2005，20（2）189－192]对犬干扰素α基因的克隆、表达和活性测定进行了比较系统的研究。
现有技术中，重组犬干扰素α存在表达率不高、比活性低的特点，通常表达量都不会超过30%。王艳等（对比文件1）[王艳，王海震，曹瑞兵等.犬α干扰素基因的高效表达及其活性测定.中国病毒学2005，20（2）189－192]对犬干扰素α基因的克隆、表达和活性测定进行了比较系统的研究，4h时目的蛋白表达量约占菌体的27.6%，纯化后蛋白的比活性仅为5.11×106U/mg，中国专利CN200610041237.X（对比文件2）公开了一种重组犬α干扰素的制备方法，通过构建一优化的大肠杆菌密码子DNA序列，转入表达载体后再转化大肠杆菌，表达所得的重组犬α干扰素的比活仅为105数量级。中国专利CN101798573A（对比文件3）公开了一种全基因犬α干扰素基因及蛋白表达，所得目的蛋白比活相对较高，可以达到1.67×107U/mg。
发明内容
本发明的目的在于提供一条重组犬干扰素α编码基因的大肠杆菌密码子优化DNA分子，或者，在严格条件下，与该序列限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白的DNA分子。优选地，本发明所述的优化的DNA分子具有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列至少90%的同源性且编码相同功能蛋白的DNA分子，更优选地，为具有95%、96%、97%、98%、99%同源性或完全一致的DNA分子。
本发明的再一目的在于提供一种含有本发明所述大肠杆菌密码子优化DNA分子的重组载体。
本发明的还一目的在于提供一种含有本发明所述重组载体的重组菌，所述重组菌的宿主菌可以是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌或酵母菌，优选为大肠埃希氏菌。本发明所述重组大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BL21(DE3)/pBV220/Ca IFN-αCGMCC NO.4881。该菌株已于2011年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.4881。保藏期限为30年，分类命名为：大肠埃希氏菌Escherichia coli。
本发明的还一目的在于提供本发明所述优化DNA分子、含有本发明所述优化DNA分子的表达载体以及含有所述表达载体的大肠杆菌在工业化制备重组犬干扰素α中的运用。本发明所述重组菌表达目的蛋白量高，可以达到40%以上，所得纯化后的目的蛋白抗病毒比活性高，可以达到4×107U/mg。
本发明的还一目的在于提供一种制备犬干扰素α的方法，本发明所述的方法，包括如下步骤：发酵上述所述重组菌，经过破碎提取，复性，纯化得到犬干扰素α。
将重组菌复性后接入发酵罐中，菌体生长到一定密度后，快速升温诱导表达。菌体通过离心的方法收集。使用高压匀浆、超声或球磨等常规的方法破碎菌体，然后离心，收集沉淀。可以通过离心、洗涤和色谱分离的方法对包涵体进行初步纯化。
获得的包涵体用高浓度变性剂的溶解，变性剂可以是脲、盐酸胍、以及溶解包涵体常用的变性剂。溶解后的包涵体可以通过硫酸胺沉淀和色谱法进行纯化，也可以不经过纯化直接用于复性。
本发明中重组犬α干扰素以包涵体的形式表达，必须通过复性使其回复生物学功能。由于犬干扰素含有6个半胱氨酸残基，形成3对分子内二硫键，本发明在复性时添加氧化还原对，用以启动二硫键交换，促进正确二硫键形成，提高复性率。氧化还原对由含一定比例的氧化巯残基和还原巯残基组成，氧化巯残基的最佳浓度是0.05~2mmol/L，还原巯残基的最佳浓度是0.1~20mmol/L。氧化巯残基可以由氧化型谷胱甘肽和、胱氨酸、或/和其它含有氧化巯残基的物质提供，还原型巯残基可以由还原型谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基乙醇、或/和其它含有还原巯残基的物质提供。
包涵体溶解液可以采用透析法、稀释法、超滤法、色谱法等复性手段，降低变性剂的浓度，使犬α干扰素处于有利于重折叠的溶液条件中，并最终使其恢复活性。
本发明采用离子交换色谱法对犬干扰素α进行纯化。离子交换介质可以是SP-Sepharose、CM-Sepharose、以及常用的阳离子型交换介质。经过纯化后可得到电泳纯度大于95％的犬α干扰素。
附图说明
图1为含有本发明优化的基因片段的质粒图。
图2为本发明工程菌质粒EcoRI/SalI双酶切图，其中左边泳道为核酸分子量标准，右边泳道为本发明质粒双酶切后的效果，得到大小为520bp和3500bp的两条带。
图3为本发明基因片段测序图谱。
图4为本发明重组菌表达产物SDS-PAGE电泳检测图，自左至右依次为：泳道1为对比文献1的表达产物（表达量约为23%）、泳道2为对比文献2的表达产物（表达量约为20%）、泳道3为本发明表达产物（表达量为40%）、泳道4为对比文献3的表达产物（表达量约为30%）、泳道5为蛋白分子量标准。
图5为SDS-PAGE电泳图，自左至右依次为：表达产物纯化前样品、蛋白分子量标准、纯化后样品。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、工程菌的构建
1、犬α干扰素基因的获得
参考Genbank M28624 犬α干扰素氨基酸序列，结合报道的大肠杆菌偏爱密码子，人工合成30条编码犬α干扰素的核苷酸序列，分别构建到测序载体，测序验证。
2、构建重组表达载体
用限制性内切酶EcoRI/SalI双酶切回收目的基因片段；用限制性内切酶EcoRI/SalI双酶切原核表达载体pBV220，回收目的载体片段；连接，转化大肠杆菌E.Coli.BL21(DE3)感受态细胞，PCR筛选阳性克隆，再进行测序验证，得到序列完全正确的重组表达质粒pBV220/CaIFN-α（见图1）。
3、构建重组工程菌
将上述重组表达载体pBV220/CaIFN-α转化大肠杆菌E.Coli.BL21(DE3)感受态细胞，得到重组菌；将重组菌涂布于含Amp的LB琼脂平板，30℃培养16-18h，长出的单菌落即可初步判断为阳性克隆；对初步筛选得到的阳性克隆进行PCR扩增验证，酶切验证（见图2），测序验证（见图3），获得插入正确序列的重组表达载体及阳性克隆。
将上述30株重组菌（带有不同CaIFN-α核苷酸编码序列）在相同条件下，表达验证，SDS-PAGE和生物学效价测定，最终筛选出表达量最高，比活性最强的重组菌株（含有本发明优化的基因序列SEQ ID NO：1），命名为BL21（DE3）/pBV220/Ca IFN-α，该菌株已于2011年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.4881，分类命名为：大肠埃希氏菌Escherichia coli。
实施例2、用本发明重组菌制备犬α干扰素的生产工艺
1.发酵表达
温度诱导表达：按1％接种量将重组菌接种于500ml TB培养液中，30℃ 220rpm的振摇30-36h。一级菌按5％接种于15升发酵罐，30℃培养至OD＝5－6时,快速升温至42℃，诱导培养3小时。表达产物用SDS-PAGE电泳检测，如图4所示，目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的40％，产量极高。
2.破碎
诱导结束后，5000r/min离心，收集菌体。使用高压匀浆机破碎菌体，8000r/min离心20min，收集沉淀，即为包涵体。包涵体用8mol/L尿素, 50mmol/L Tirs, 1mmol/L EDTA, pH=8.5溶解，浓度为500～800ug/mL，即得到包涵体溶解液。
3.复性
采用稀释的方法，将上述包涵体溶解液以1：10的比例稀释到含有0.3~0.7mol/L 精氨酸, 0.1mmol/L 氧化型谷胱甘肽, 1mmol/L 还原型谷胱甘肽, pH=8.5的折叠缓冲液中，室温放置24h，即得到具有活性的犬α干扰素。
4.纯化
上述经过复性的样品，用分子截留量为3kD的超滤膜超滤浓缩，至蛋白质浓度为1～2mg/mL，用盐酸调解pH=4.0，上载阳离子交换色谱柱，阳离子交换色谱柱预先用20mmol/L 乙酸－乙酸钠平衡。样品上载后，用20mmol/L Na2HPO4－NaH2PO4, pH=6.0淋洗，然后用20mmol/L Na2HPO4－NaH2PO4, 0.3mol/L NaCl, pH=6.0洗脱，即得到纯度大于95％的犬干扰素α（见图5）。
实施例3 重组犬α干扰素抗病毒比活性测定
采用微量细胞病变抑制法
MDCK接种96孔板，待长成单层后弃去生长液，加入10倍倍比稀释的重组犬α干扰素，每个稀释度做8个重复，培养24小时候弃上清，用10TCID50的水疱性口炎病毒（VSV）进行供毒，同事设立阴性对照（只加10倍稀释的干扰素，不加病毒）、阳性对照（只加病毒，不加干扰素）、空白对照（不加干扰素、不加病毒），倒置显微镜下逐日观察细胞病变，最后细胞以结晶紫染液染色，在每联仪上测定样品的OD550值，并按指数回归方程计算相当于50%病变OD值的稀释度，即样品活性单位，测得发酵产物比活性为4×106U/mg，纯化产物的比活性为4×107U/mg。
Claims (1)
1. 一种重组大肠杆菌，其保藏编号为CGMCC No.4881。
2. 权利要求1所述的重组大肠杆菌在工业化生产重组犬干扰素α中的应用。
3. 一种制备犬干扰素α的方法，包括：发酵权利要求1所述重组大肠杆菌，经破碎提取、复性、纯化步骤，得到犬干扰素α。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述纯化为离子交换色谱法纯化法。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中离子交换介质是SP-Sepharose或CM-Sepharose。
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