CN102732525B - 一种用于克隆含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的dna分子及克隆方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种用于克隆来自于野蚕丝素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽（-RGD-）的DNA分子及克隆方法。该克隆方法操作简单，准确度高；获得的单倍、双倍、多倍含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因序列结果准确。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种用于克隆来自于野蚕丝素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽（-RGD-）的DNA分子及克隆方法。
背景技术
蚕丝是天然动物蛋白纤维，包括家蚕丝和野蚕丝（柞蚕丝、天蚕丝等）。家蚕丝素由于来源丰富，也是研究的热点，学者对其结构、性能及生物材料应用方面进行了大量的研究。然而，有关野蚕丝素方面的研究国内外报导极少。
再生野蚕丝素溶液及膜的分子构象以α-螺旋结构和无规卷曲结构为主，经过乙醇溶液处理的野蚕丝素膜的β-折叠结构含量增加。天蚕丝素来源比较稀少，有报导将编码天蚕基因导入家蚕中进行表达并从家蚕分泌的丝物质中检测到天蚕丝素蛋白。野蚕丝素蛋白肽链上含有一种特殊的序列：精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)三肽序列，柞蚕丝素蛋白分子含有12个RGD，约占柞蚕丝素氨基酸残基总数的1.35%。天蚕丝素蛋白分子含有14个RGD，约占天蚕丝素氨基酸残基总数的1.7%。这种RGD三肽序列广泛存在于胶原蛋白、粘着蛋白等细胞外基质中，有助于细胞粘附，促使贴壁细胞粘附生长。研究发现，经RGD化学修饰的丝素膜及其他改性材料如高分子聚合物等都能提高细胞粘附率。
因此预见野蚕（柞蚕和天蚕）丝素蛋白对细胞的亲和性比家蚕丝素蛋白更好，有作为高性能的生物材料的巨大潜力。经过对再生野蚕丝素蛋白的体外生物相容性的初步研究，发现再生野蚕丝素材料可以很好地支持大鼠骨髓间充质干细胞的粘附与增殖。
报导认为材料并不是有RGD的存在就一定有良好的促细胞黏附和增殖功能，还与RGD在肽链中的位置有关。为合理科学地设计野蚕丝素蛋白生物材料，首先必须知道肽链中RGD与细胞粘附性之间的规律性。因此，揭示野蚕丝素蛋白的组成与其生物学功能的关系具有重要意义。
传统的方法主要采用溶解蚕丝获得再生丝素蛋白的方法来研究其性能，但无法说明其生物学性能的结构（序列）。丝素蛋白研究方面，有学者通过化学合成肽段来研究其结构性能，但化学合成并不能合成大分子量的蛋白，而蛋白的分子量和聚合度与蛋白的结构或性能密切相关。Kozo Tsubouchi研究组将家蚕丝素用胰乳蛋白酶消化，分离出各种肽段，通过序列鉴定和细胞培养，发现丝素H链N-末端有2段基序NINDFDED和VITTDSDGNE对人皮肤成纤维细胞增殖有促进作用。但这种方法获得的是各种肽段混合液，种类繁多，分子量各异，肽段分割、精确分离复杂，不易获得高纯度的单序列。采用基因工程技术来研究其组成与生物学功能的关系，有研究报导，通过大肠杆菌表达获得的含RGD三肽的重组蛋白[TGRGDSPA(GVPGV)2GG(GAGAGS)3AS]n表现出良好的细胞粘附与增殖能力；与RGD序列共混的再生家蚕丝素蛋白以及重组RGD蜘蛛丝蛋白能支持未分化的小鼠成骨细胞的分化；将RGD重组蜘蛛丝和聚乙烯醇高分子材料结合能支持鼠胚胎成纤维细胞的生长。但是上述研究并不能够揭示重复多次的RGD分布与天蚕丝素蛋白可能具有的出色的促细胞粘附性之间的关系。
目前，提供用于修饰高分子材料的RGD短肽的方法多采用化学合成技术。化学合成方法只能得到分子量较小的多肽，很难得到大分子量的肽，所以难以进一步研究重复多次的RGD分布与野蚕丝素蛋白的促细胞粘附性之间的关系。因此，本发明提供了一种野蚕丝素蛋白基序及野蚕丝素蛋白基因的克隆方法，用于获得野蚕丝素蛋白RGD重复序列，以期研究野蚕丝素丝蛋白RGD三肽及其重复序列与其生物学功能的关系。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种用于克隆来自于野蚕丝素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽（-RGD-）的DNA分子及克隆方法。该克隆方法操作简单，准确度高；获得的单倍、双倍、多倍含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因序列结果准确。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于克隆来自于野蚕丝素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽（-RGD-）的DNA分子，其编码链的序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了一种克隆来自于野蚕丝素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因重复序列的方法，包括如下步骤：
步骤1：合成编码链序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子；所述DNA分子的编码链序列的5’端含有BglII的粘末端碱基，3’端具有BamHI的粘末端碱基，所述BglII位点的上游还具有AgeI的粘末端碱基；
步骤2：取所述DNA分子与pSLFA1180FA质粒连接获得转化质粒，转化感受态细胞，筛选阳性克隆、提取质粒、BglII/BamHI双酶切、收集小片段即得。
在本发明提供的一些实施例中，连接具体为取限制性核酸内切酶AgeI和BamHI消化pSLFA1180FA质粒，收集大片段，与编码序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子经T4连接酶连接。
本发明还提供了一种克隆单倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因序列的方法，取限制性核酸内切酶AgeI和BamHI消化pSLFA1180FA质粒收集大片段，与编码链序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子经T4连接酶连接，获得单倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆；转化感受态细胞，筛选阳性克隆、提取质粒、BglII/BamHI双酶切、收集小片段即得。
本发明还提供了一种克隆双倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因序列的方法，包括如下步骤：
步骤1：取限制性核酸内切酶AgeI和BamHI消化pSLFA1180FA质粒，收集大片段P1，与编码序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子经T4连接酶连接，获得单倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYR1；
步骤2：取限制性核酸内切酶BglII/EcoRI消化所述单倍克隆pSL-AYR1，收集小片段P2；取限制性核酸内切酶BamHI/EcoRI消化所述单倍克隆pSL-AYR1，收集大片段P3；取所述小片段P2与所述大片段P3经T4连接酶连接，获得双倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYR2；
步骤3：转化感受态细胞，筛选阳性克隆、提取质粒、BglII/BamHI双酶切、收集小片段即得。
本发明还提供了一种克隆多倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因序列的方法，所述多倍为大于1的奇数倍，包括如下步骤：
步骤1：取限制性核酸内切酶AgeI和BamHI消化pSLFA1180FA质粒，琼脂糖凝胶电泳回收第一消化产物中的大片段P1，与编码链序列如SEQ IDNO：1所示的DNA分子经T4连接酶连接，获得单倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYR1；
步骤2：取限制性核酸内切酶BglII/EcoRI消化所述单倍克隆pSL-AYR1，琼脂糖凝胶电泳回收第二消化产物中的小片段P2；取限制性核酸内切酶BamHI/EcoRI消化所述单倍克隆pSL-AYR1，琼脂糖凝胶电泳回收第三消化产物中的大片段P3；取所述小片段P2与所述大片段P3经T4连接酶连接，获得含双倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYR2；
步骤3：取限制性核酸内切酶BglII/EcoRI消化所述双倍克隆pSL-AYR2，琼脂糖凝胶电泳回收第四消化产物中的小片段P4；取限制性核酸内切酶BamHI/EcoRI消化所述单倍克隆pSL-AYR1，琼脂糖凝胶电泳回收第三消化产物中的大片段P3；取所述小片段P4与所述大片段P3经T4连接酶连接，获得三倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYR3；
步骤4：重复步骤3，取限制性核酸内切酶BglII/EcoRI消化所述双倍克隆pSL-AYR2，琼脂糖凝胶电泳回收第四消化产物中的小片段P4；取限制性核酸内切酶BamHI/EcoRI消化所述三倍克隆pSL-AYR3，琼脂糖凝胶电泳回收第五消化产物中的大片段P5；取所述小片段P4与所述大片段P5经T4连接酶连接，获得五倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYR5；
步骤5：重复步骤4，获得奇数倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因序列的克隆；
步骤6：转化感受态细胞，筛选阳性克隆、提取质粒、BglII/BamHI双酶切、收集小片段即得。
本发明还提供了一种克隆多倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因序列的方法，所述多倍为大于2的偶数倍，包括如下步骤：
步骤1：取限制性核酸内切酶AgeI和BamHI消化pSLFA1180FA质粒，琼脂糖凝胶电泳回收第一消化产物中的大片段P1，与编码链序列如SEQ IDNO：1所示的DNA分子经T4连接酶连接，获得单倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYR1；
步骤2：取限制性核酸内切酶BglII/EcoRI消化所述单倍克隆pSL-AYR1，琼脂糖凝胶电泳回收第二消化产物中的小片段P2；取限制性核酸内切酶BamHI/EcoRI消化所述单倍克隆pSL-AYR1，琼脂糖凝胶电泳回收第三消化产物中的大片段P3；取所述小片段P2与所述大片段P3经T4连接酶连接，获得双倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYR2；
步骤3：取限制性核酸内切酶BglII/EcoRI消化所述双倍克隆pSL-AYR2，琼脂糖凝胶电泳回收第四消化产物中的小片段P4；取限制性核酸内切酶BamHI/EcoRI消化所述双倍克隆pSL-AYR2，琼脂糖凝胶电泳回收第六消化产物中的大片段P6；取所述小片段P4与所述大片段P6经T4连接酶连接，获得四倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYR4；
步骤4：重复步骤3，取限制性核酸内切酶BglII/EcoRI消化所述四倍克隆pSL-AYR4，琼脂糖凝胶电泳回收第七消化产物中的小片段P7；取限制性核酸内切酶BamHI/EcoRI消化所述双倍克隆pSL-AYR2，琼脂糖凝胶电泳回收第六消化产物中的大片段P6；取所述小片段P7与所述大片段P6经T4连接酶连接，获得六倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYR6；
步骤5：重复步骤4，获得偶数倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因序列的克隆；
步骤6：转化感受态细胞，筛选阳性克隆、提取质粒、BglII/BamHI双酶切、收集小片段即得。
本发明提供一种用于克隆来自于野蚕丝素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的DNA分子及克隆方法。该克隆方法操作简单，准确度高；获得的单倍、双倍、多倍含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因序列结果准确。获得的单倍、双倍或多倍克隆的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因表达产物能够用来制备细胞培养基质、组织诱导材料或组织工程支架。
附图说明
图1示质粒pSLFA1180FA图谱；
图2示实施例2中构建质粒pSL-AYR2的构建方法；
图3示实施例12中对质粒pSL-AYR1、pSL-AYR2、pSL-AYR4、pSL-AYR8、pSL-AYR12、pSL-AYR16、pSL-AYR24采用限制核酸性内切酶BglII/BamHI消化，然后进行DNA琼脂糖凝胶电泳，用EB染色观察鉴定结果；其中，泳道M示DNA标准分子量（bp），泳道1示质粒pSL-AYR1，泳道2示质粒pSL-AYR2，泳道3示质粒pSL-AYR4，泳道4示质粒pSL-AYR8，泳道5示质粒pSL-AYR12，泳道6示质粒pSL-AYR16，泳道7示质粒pSL-AYR24。
具体实施方式
本发明公开了一种用于克隆来自于野蚕丝素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽（-RGD-）的DNA分子及克隆方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的一种用于克隆来自于野蚕丝素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的DNA分子及克隆方法中所用试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1单倍含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆
用限制性内切酶AgeI/BamHI消化pSLFA1180FA质粒（所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品），反应体系如下：
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μL。
在37℃恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收，回收AgeI与BamHI之间大片段。与设计合成的“-RGD-”的双链DNA分子混合，在T4DNA连接酶的作用下4℃连接过夜（8~12h）。连接反应体系：
连接体系总量为10μL。
将连接产物转化入Top10感受态细胞，铺于含氨苄青霉素（抗生素）的固体培养基上倒置培养，挑克隆，接入含有氨苄青霉素的液体培养基中培养，抽提质粒，用限制性内切酶和DNA测序（Invitrogen公司）鉴定获得单倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR1。
实施例2双倍含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆
用限制性核酸内切酶BglII/EcoRI消化实施例1制得的质粒pSL-AYR1（所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品），反应体系如下：
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μL。
在37℃恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收，回收BglII与EcoRI之间小片段。
用限制性核酸内切酶BamHI/EcoRI消化质粒pSL-AYR1（所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品），反应体系如下：
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μL。
在37℃恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收，回收BamHI与EcoRI之间大片段。
将BglII与EcoRI之间小片段与BamHI与EcoRI之间大片段混合，在T4DNA连接酶的作用下4℃连接过夜（8~12h）。连接反应体系：
BglII与EcoRI之间小片段5μL(1%琼脂糖凝胶电泳回收的上清液)
BamHI与EcoRI之间大片段3μL(1%琼脂糖凝胶电泳回收的上清液)
T4DNA连接酶 1μL
10×连接酶Buffer 1μL
连接体系总量为10μL。
将连接产物转化入Top10感受态细胞，铺于含氨苄青霉素的固体培养基上倒置培养，挑克隆，接入含有氨苄青霉素的液体培养基中进行培养，抽提质粒，用限制性内切酶和DNA测序（Invitrogen公司）鉴定获得含有双倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR2。
实施例3三倍含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆
用限制性核酸内切酶BglII/EcoRI消化实施例2制得的质粒pSL-AYR2（所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品），反应体系如下：
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μL。
在37℃恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收，回收BglII与EcoRI之间小片段。
用限制性核酸内切酶BamHI/EcoRI消化实施例1制得的质粒pSL-AYR1（所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品），反应体系如下：
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μL。
在37℃恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收，回收BamHI与EcoRI之间大片段。
将BglII与EcoRI之间小片段与BamHI与EcoRI之间大片段混合，在T4DNA连接酶的作用下4℃连接过夜（8~12h）。连接反应体系：
BglII与EcoRI之间小片段5μL(1%琼脂糖凝胶电泳回收的上清液)
BamHI与EcoRI之间大片段3μL(1%琼脂糖凝胶电泳回收的上清液)
T4DNA连接酶 1μL
10×连接酶Buffer 1μL
连接体系总量为10μL。
将连接产物转化入Top10感受态细胞，铺于含氨苄青霉素的固体培养基上倒置培养，挑克隆，接入含有氨苄青霉素的液体培养基中进行培养，抽提质粒，用限制性内切酶和DNA测序（Invitrogen公司）鉴定获得含有三倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR3。
实施例4四倍含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆
用限制性核酸内切酶BglII/EcoRI消化实施例2制得的质粒pSL-AYR2（所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品），反应体系如下：
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μL。
在37℃恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收，回收BglII与EcoRI之间小片段。
用限制性核酸内切酶BamHI/EcoRI消化实施例2制得的质粒pSL-AYR2（所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品），反应体系如下：
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μL。
在37℃恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收，回收BamHI与EcoRI之间大片段。
将BglII与EcoRI之间小片段与BamHI与EcoRI之间大片段混合，在T4DNA连接酶的作用下4℃连接过夜（8~12h）。连接反应体系：
BglII与EcoRI之间小片段5μL(1%琼脂糖凝胶电泳回收的上清液)
BamHI与EcoRI之间大片段3μL(1%琼脂糖凝胶电泳回收的上清液)
T4DNA连接酶 1μL
10×连接酶Buffer 1μL
连接体系总量为10μL。
将连接产物转化入Top10感受态细胞，铺于含氨苄青霉素的固体培养基上倒置培养，挑克隆，接入含有氨苄青霉素的液体培养基中进行培养，抽提质粒，用限制性内切酶和DNA测序（Invitrogen公司）鉴定获得含有四倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR4。
实施例5四倍含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆
用限制性核酸内切酶BglII/EcoRI消化实施例3制得的质粒pSL-AYR3（所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品），反应体系如下：
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μL。
在37℃恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收，回收BglII与EcoRI之间小片段。
用限制性核酸内切酶BamHI/EcoRI消化实施例1制得的质粒pSL-AYR1（所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品），反应体系如下：
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μL。
在37℃恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收，回收BamHI与EcoRI之间大片段。
将BglII与EcoRI之间小片段与BamHI与EcoRI之间大片段混合，在T4DNA连接酶的作用下4℃连接过夜（8~12h）。连接反应体系：
BglII与EcoRI之间小片段5μL(1%琼脂糖凝胶电泳回收的上清液)
BamHI与EcoRI之间大片段3μL(1%琼脂糖凝胶电泳回收的上清液)
T4DNA连接酶 1μL
10×连接酶Buffer 1μL
连接体系总量为10μL。
将连接产物转化入Top10感受态细胞，铺于含氨苄青霉素的固体培养基上倒置培养，挑克隆，接入含有氨苄青霉素的液体培养基中进行培养，抽提质粒，用限制性内切酶和DNA测序（Invitrogen公司）鉴定获得含有四倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR4。
实施例6五倍含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆
用限制性核酸内切酶BglII/EcoRI消化实施例4或实施例5制得的质粒pSL-AYR4（所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品），反应体系如下：
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μL。
在37℃恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收，回收BglII与EcoRI之间小片段。
用限制性核酸内切酶BamHI/EcoRI消化实施例1制得的质粒pSL-AYR1（所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品），反应体系如下：
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μL。
在37℃恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收，回收BamHI与EcoRI之间大片段。
将BglII与EcoRI之间小片段与BamHI与EcoRI之间大片段混合，在T4DNA连接酶的作用下4℃连接过夜（8~12h）。连接反应体系：
BglII与EcoRI之间小片段5μL(1%琼脂糖凝胶电泳回收的上清液)
BamHI与EcoRI之间大片段3μL(1%琼脂糖凝胶电泳回收的上清液)
T4DNA连接酶 1μL
10×连接酶Buffer 1μL
连接体系总量为10μL。
将连接产物转化入Top10感受态细胞，铺于含氨苄青霉素的固体培养基上倒置培养，挑克隆，接入含有氨苄青霉素的液体培养基中进行培养，抽提质粒，用限制性内切酶和DNA测序（Invitrogen公司）鉴定获得含有五倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR5。
实施例7五倍含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆
用限制性核酸内切酶BglII/EcoRI消化实施例3制得的质粒pSL-AYR3（所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品），反应体系如下：
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μL。
在37℃恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收，回收BglII与EcoRI之间小片段。
用限制性核酸内切酶BamHI/EcoRI消化实施例2制得的质粒pSL-AYR2（所用内切酶及相应缓冲液为fermentas产品），反应体系如下：
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μL。
在37℃恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行凝胶电泳并进行DNA凝胶回收，回收BamHI与EcoRI之间大片段。
将BglII与EcoRI之间小片段与BamHI与EcoRI之间大片段混合，在T4DNA连接酶的作用下4℃连接过夜（8~12h）。连接反应体系：
BglII与EcoRI之间小片段5μL(1%琼脂糖凝胶电泳回收的上清液)
BamHI与EcoRI之间大片段3μL(1%琼脂糖凝胶电泳回收的上清液)
T4DNA连接酶 1μL
10×连接酶Buffer 1μL
连接体系总量为10μL。
将连接产物转化入Top10感受态细胞，铺于含氨苄青霉素的固体培养基上倒置培养，挑克隆，接入含有氨苄青霉素的液体培养基中进行培养，抽提质粒，用限制性内切酶和DNA测序（Invitrogen公司）鉴定获得含有五倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR5。
实施例8多倍（奇数倍）含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆
按照实施例6的加倍方法，采用同实施例6的酶切反应和连接体系，获得七倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR7、九倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR9、十一倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR11、十三倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR13、十五倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR15、十七倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR17、十九倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR19、二十一倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR21、二十三倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR23、二十五倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR25等，依次类推。
实施例9多倍（奇数倍）含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆
按照实施例7的加倍方法，采用同实施例7的酶切反应和连接体系，获得七倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR7、九倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR9、十一倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR11、十三倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR13、十五倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR15、十七倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR17、十九倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR19、二十一倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR21、二十三倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR23、二十五倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR25等，依次类推。
实施例10多倍（偶数倍）含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆
按照实施例4的加倍方法，采用同实施例4的酶切反应和连接体系，获得六倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR6、八倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR8、十倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR10、十二倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR12、十四倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR14、十六倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR16、十八倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR18、二十倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR20、二十二倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR22、二十四倍“-RGD-”基团序列的质粒pSL-AYR24等，依次类推。
实施例11多倍（偶数倍）含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆
按照实施例5的加倍方法，采用同实施例5的酶切反应和连接体系，获得六倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR6、八倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR8、十倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR10、十二倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR12、十四倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR14、十六倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR16、十八倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR18、二十倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR20、二十二倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR22、二十四倍“-RGD-”基因序列的质粒pSL-AYR24等，依次类推。
实施例12
对构建的部分质粒pSL-AYR1、pSL-AYR2、pSL-AYR4、pSL-AYR8、pSL-AYR12、pSL-AYR16、pSL-AYR24采用限制核酸性内切酶BglII/BamHI消化，然后进行DNA琼脂糖凝胶电泳，用EB染色观察鉴定。
用限制性核酸内切酶BglII/BamHI以上质粒进行酶切消化，反应体系如下：
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μL。
在37℃恒温水浴15min进行酶切消化，然后将酶切产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳，用EB染色观察。
结果可知，所有质粒酶切后均得到2个条带，小条带理论值分别为51bp、102bp、204bp、408bp、612bp、816bp和1224bp，大条带理论值均为3216bp。由图3显示，与提供的DNA标准分子量(M)对比，所有质粒酶切后的条带都是符合理论值（正确）的。
构建的所有质粒进一步通过DNA测序（Invitrogen）鉴定，并且基因序列全部正确，没有发生任何基因缺失或基因突变。
对质粒pSL-AYR1、质粒pSL-AYR2、质粒pSL-AYR3、质粒pSL-AYR4、质粒pSL-AYR5、质粒pSL-AYR6、质粒pSL-AYR7、质粒pSL-AYR8、质粒pSL-AYR9、质粒pSL-AYR10、质粒pSL-AYR11、质粒pSL-AYR12、质粒pSL-AYR2413、质粒pSL-AYR14、质粒pSL-AYR15、质粒pSL-AYR16、质粒pSL-AYR17、质粒pSL-AYR18、质粒pSL-AYR19、质粒pSL-AYR20、质粒pSL-AYR21、质粒pSL-AYR22、质粒pSL-AYR23、质粒pSL-AYR24、质粒pSL-AYR36进行了正向或正反向测序，结果正确。
综合上述试验结果，本发明提供的用于克隆来自于野蚕丝素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽（-RGD-）的DNA分子及克隆方法获得的单倍含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽、双倍含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽、多倍含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因序列结果准确；该克隆方法操作简单，准确度高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1. 一种用于克隆含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的DNA分子，其特征在于，其编码链的序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种克隆来自于野蚕丝素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因重复序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：合成编码链序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子；所述DNA分子的编码链序列的5’端含有BglII的粘末端碱基，3’端具有BamHI的粘末端碱基，所述BglII位点的上游还具有AgeI的粘末端碱基；
步骤2：取所述DNA分子与如图1所示的pSLFA1180FA质粒连接获得转化质粒，转化感受态细胞，筛选阳性克隆、提取质粒、BglII/ BamHI双酶切、收集小片段即得；
所述连接具体为取限制性核酸内切酶AgeI和BamHI消化如图1所示的pSLFA1180FA质粒，收集大片段，与编码链序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子经T4连接酶连接。
3.一种克隆单倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因序列的方法，其特征在于，取限制性核酸内切酶AgeI和BamHI消化如图1所示的pSLFA1180FA质粒收集大片段，与编码链序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子经T4连接酶连接，获得单倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆；转化感受态细胞，筛选阳性克隆、提取质粒、BglII/ BamHI双酶切、收集小片段即得。
4.一种克隆双倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：取限制性核酸内切酶AgeI和BamHI消化如图1所示的pSLFA1180FA质粒，收集大片段P1，与编码链序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子经T4连接酶连接，获得单倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYR1；
步骤2：取限制性核酸内切酶BglII/EcoRI消化所述单倍克隆pSL-AYR1，收集小片段P2；取限制性核酸内切酶BamHI/EcoRI消化所述单倍克隆pSL-AYR1，收集大片段P3；取所述小片段P2与所述大片段P3经T4连接酶连接，获得双倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYR2；
步骤3：转化感受态细胞，筛选阳性克隆、提取质粒、BglII/ BamHI双酶切、收集小片段即得。
5.一种克隆多倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因序列的方法，所述多倍为大于1的奇数倍，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：取限制性核酸内切酶AgeI和BamHI消化如图1所示的pSLFA1180FA质粒，琼脂糖凝胶电泳回收第一消化产物中的大片段P1，与编码链序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子经T4连接酶连接，获得单倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYR1；
步骤2：取限制性核酸内切酶BglII/EcoRI消化所述单倍克隆pSL-AYR1，琼脂糖凝胶电泳回收第二消化产物中的小片段P2；取限制性核酸内切酶BamHI/EcoRI消化所述单倍克隆pSL-AYR1，琼脂糖凝胶电泳回收第三消化产物中的大片段P3；取所述小片段P2与所述大片段P3经T4连接酶连接，获得双倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYR2；
步骤3：取限制性核酸内切酶BglII/EcoRI消化所述双倍克隆pSL-AYR2，琼脂糖凝胶电泳回收第四消化产物中的小片段P4；取限制性核酸内切酶BamHI/EcoRI消化所述单倍克隆pSL-AYR1，琼脂糖凝胶电泳回收第三消化产物中的大片段P3；取所述小片段P4与所述大片段P3经T4连接酶连接，获得三倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYR3；
步骤4：重复步骤3，取限制性核酸内切酶BglII/EcoRI消化所述双倍克隆pSL-AYR2，琼脂糖凝胶电泳回收第四消化产物中的小片段P4；取限制性核酸内切酶BamHI/EcoRI消化所述三倍克隆pSL-AYR3，琼脂糖凝胶电泳回收第五消化产物中的大片段P5；取所述小片段P4与所述大片段P5经T4连接酶连接，获得五倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYR5；
步骤5：重复步骤4，获得奇数倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因序列的克隆；
步骤6：转化感受态细胞，筛选阳性克隆、提取质粒、BglII/ BamHI双酶切、收集小片段即得。
6.一种克隆多倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因序列的方法，所述多倍为大于2的偶数倍，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：取限制性核酸内切酶AgeI和BamHI消化如图1所示的pSLFA1180FA质粒，琼脂糖凝胶电泳回收第一消化产物中的大片段P1，与编码链序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子经T4连接酶连接，获得单倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYR1；
步骤2：取限制性核酸内切酶BglII/EcoRI消化所述单倍克隆pSL-AYR1，琼脂糖凝胶电泳回收第二消化产物中的小片段P2；取限制性核酸内切酶BamHI/EcoRI消化所述单倍克隆pSL-AYR1，琼脂糖凝胶电泳回收第三消化产物中的大片段P3；取所述小片段P2与所述大片段P3经T4连接酶连接，获得双倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYR2；
步骤3：取限制性核酸内切酶BglII/EcoRI消化所述双倍克隆pSL-AYR2，琼脂糖凝胶电泳回收第四消化产物中的小片段P4；取限制性核酸内切酶BamHI/EcoRI消化所述双倍克隆pSL-AYR2，琼脂糖凝胶电泳回收第六消化产物中的大片段P6；取所述小片段P4与所述大片段P6经T4连接酶连接，获得四倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYR4；
步骤4：重复步骤3，取限制性核酸内切酶BglII/EcoRI消化所述四倍克隆pSL-AYR4，琼脂糖凝胶电泳回收第七消化产物中的小片段P7；取限制性核酸内切酶BamHI/EcoRI消化所述双倍克隆pSL-AYR2，琼脂糖凝胶电泳回收第六消化产物中的大片段P6；取所述小片段P7与所述大片段P6经T4连接酶连接，获得六倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYR6；
步骤5：重复步骤4，获得偶数倍的含精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的多肽的基因序列的克隆；
步骤6：转化感受态细胞，筛选阳性克隆、提取质粒、BglII/ BamHI双酶切、收集小片段即得。
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