CN102294021A - 一种可降低血糖的药物制剂 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂的技术领域，具体涉及一种可降低血糖的药物制剂，解决临床降低血糖时多种药物多次注射、使用繁琐且给病人带来很大痛苦的问题，可降低血糖的药物制剂，其特征在于其是以脂联素球状结构域（gAd）和胰高血糖素样肽-1（GLP-1）为主要成分，包括浓度为200ng/ml到2000ng/ml的gAd、3μg/ml到15μg/ml的GLP-1、药用缓冲液、稳定剂以及水，pH为7.4。本发明的特点在于：(1)一种既能缓解机体组织的IR状态，又能激发机体胰岛素分泌的新型降血糖药物；(2)药物配伍种类少；(3)便于临床推广使用。

Description

一种可降低血糖的药物制剂

技术领域

本发明属于药物制剂的技术领域，具体涉及一种可降低血糖的药物制剂，具体是一种以脂联素球状结构域（gAd）和胰高血糖素样肽-1（GLP-1）为主要成分的药物制剂。

背景技术

胰岛素抵抗（Insulin resistant，IR）是2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）、冠心病、高血压、血脂异常、肥胖等多种代谢相关疾病的共同病理生理基础（Fang J, Alderman MH. Serum uric acid and cardiovascular mortality the NHANES I epidemiologic follow-up study, 1971-1992. National Health and Nutrition Examination Survey [J]. JAMA. 2000, 283(18):2404-2410.）。因此，如何改善IR成为临床医学亟待解决的现实问题。IR是指胰岛素作用的靶器官对胰岛素作用的敏感性下降，即正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种代谢状态，其根本原因为胰岛素信号传递受阻或减弱。IR发生的相关因素可以分为遗传及环境两类。前者与胰岛素信号传导的各个环节、调控糖脂代谢的多种基因多态性和基因突变有关；环境因素主要是摄食过多（尤其摄入脂肪过多），体力活动过少，体内脂肪堆积引起的一系列代谢变化及一些细胞因子的表达异常（Montague CT, O'Rahilly S. The perils of portliness: causes and consequences of visceral adiposity [J]. Diabetes. 2000, 49(6):883-888.）。目前临床上降低血糖是通过多次注射不同种类的药物实现的，操作繁琐，患者痛苦，意外感染的风险较大。

脂联素（Adiponectin）是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽，研究表明其在肥胖、T2DM、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化患者血浆其含量是减低的。脂联素具有改善脂代谢紊乱，改善胰岛素抵抗，抑制动脉粥样硬化的作用。脂联素的球状结构域（Globular domain of adiponectin，gAd）是脂联素的活性部位，具有与全长脂联素相同的生物学活性。在肌组织，gAd通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-acti-vated protein kinase，AMPK）和过氧化物酶体增值物活化受体-γ（PPAR-γ），增加脂肪酸的氧化，减少甘油三酯的含量，改善肌肉组织的IR。

胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide 1，GLP-1）在生理状态下从肠内释放，进入血液循环中后可以增强葡萄糖依赖性胰岛素分泌，显示出降低血糖作用，是目前治疗糖尿病的一种有效药，可在控制血糖的同时降低患者的体质量。

目前，gAd尚处于研发阶段，GLP-1已用于临床，但是尚无配伍药物。

通过gAd和GLP-1的合理配伍，在有效强化临床治疗效果的同时，可减少临床操作环节，减轻患者痛苦，降低意外感染的风险。

发明内容

本发明为了解决临床降低血糖时多种药物多次注射、使用繁琐且给病人带来很大痛苦的问题，提供了一种由gAd和GLP-1为主要成份的稳定的可降低血糖的药物制剂，通过gAd和GLP-1的合理配伍，强化了临床治疗效果。

本发明可通过如下的技术方案实现：

可降低血糖的药物制剂，其特征在于其是以gAd和GLP-1为主要成分，包括浓度为200ng/mL到2000ng/mL的gAd、3                                                

g/mL到15

g/mL的GLP-1、药用缓冲液、稳定剂以及水，pH为7.4。

药用缓冲液为柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘露醇缓冲液中的一种或多种。药物缓冲液在本发明所述药物制剂中的浓度为：柠檬酸盐缓冲液0.02~0.05mmol/L、磷酸盐缓冲液0.005~0.02mmol/L、甘露醇缓冲液5~15%（V/V）。

稳定剂为EDTA、苯甲醇、间甲酚或辛酸纳。稳定剂在本发明所述药物制剂中的浓度为： EDTA为0.03~0.06mol/L、苯甲醇0.5~1.0%（V/V）、间甲酚0.5~1.0%（V/V）、辛酸纳0.2~0.5%（V/V）。

本领域技术人员可轻松获知本发明所述药物制剂中的药用缓冲液和稳定剂的化学成分和配制方法。

本发明所述的制剂形式为冻干剂型或液体剂型。冻干剂型或液体剂型的制备方法都是常规方法。

本发明的特点在于：（1）一种既能缓解机体组织的IR状态，又能激发机体胰岛素分泌的新型降血糖药物；（2）药物配伍种类少；（3）便于临床推广使用。

附图说明

图1：3T3-L1细胞的培养和鉴定。

图2：本发明所述药物降低糖尿病大鼠血糖效果。

具体实施方式

通过以下的实施例对本发明进行具体说明，这些是本发明的优选实施方式，本发明并不局限于这些实施例。

0.01mmol/L磷酸盐缓冲液为例，稳定剂的浓度和种类以0.03mol/L EDTA为例

实施例1：可降低血糖的药物制剂，包括浓度为200ng/mL的gAd、13

g/mL的GLP-1、0.01mmol/L的磷酸盐缓冲液和0.03mol/L EDTA，其余为水，pH为7.4。

制备方法：1）、药用缓冲液的制备：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄、0.24g KH₂PO₄、12g EDTA·2Na溶于800ml蒸馏水中，最后加蒸馏水定容至800mL，即可获得0.01mmol/L磷酸盐缓冲液、稳定剂0.03mol/L EDTA混合液，即为本发明所述药用缓冲液（因为本实施例以制备1000mL药物液体针剂为目的，故需要给添加gAd和GLP-1留出一定的体积）。

2）、使用步骤1）获得的药用缓冲液，采用常规操作方法将gAd、GLP-1蛋白（或其水溶液）分别配制为浓缩液，然后分别常规测定gAd浓缩液和GLP-1浓缩液的蛋白浓度。如，本实施例中测得的gAd浓缩液浓度为166

g/mL，GLP-1浓缩液浓度为210

g/mL。

3）、取1.205mL步骤2）获得的gAd浓缩液和64.677mL步骤2）获得的GLP-1浓缩液与步骤1）获得的800mL药用缓冲液混匀，使用水定容至997mL（预留3mL用于调整pH）。

4）、使用浓HCl或浓NaOH溶液，常规操作，调节步骤3）获得的997mL溶液，pH至7.4；再使用水定容至1000mL，即获得本发明所述药液1000mL。

实施例2：可降低血糖的药物制剂，包括浓度为800ng/mL的gAd、3

g/mL的GLP-1，磷酸盐缓冲液0.02mmol/L和苯甲醇 0.5%（V/V），其余为水，pH为7.4。

制备方法参照实施例1，本领域技术人员可轻松获知，药用缓冲液为磷酸盐缓冲液，稳定剂为苯甲醇。

实施例3：可降低血糖的药物制剂，包括浓度为2000ng/mL的gAd、15

g/mL的GLP-1，甘露醇缓冲液10%（V/V）和间甲酚1.0%（V/V），其余为水，pH为7.4。

制备方法参照实施例1，本领域技术人员可轻松获知，药用缓冲液为甘露醇缓冲液，稳定剂为间甲酚。

实施例4：可降低血糖的药物制剂，包括浓度为1000ng/mL的gAd、8

g/mL的GLP-1，柠檬酸缓冲液0.05mmol/L和辛酸纳0.5%（V/V），其余为水，pH为7.4。

制备方法参照实施例1，本领域技术人员可轻松获知，药用缓冲液为柠檬酸缓冲液，稳定剂为辛酸纳。

试验例1：

本发明所述药物（具体为上述实施例1所述的药物）可增强3T3-L1细胞的葡萄糖摄取能力，从而可降低培养液中的葡萄糖浓度。

取液氮冻存的3T3-L1前脂肪细胞株解冻，无菌台下将其加入装有5ml基础培养基的离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，加入8ml DMEM高糖完全培养基，吹吸混匀后接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO₂孵箱中孵育。第二天换液并于倒置显微镜下观察其生长情况及生物学性状，此后每日观察，隔天换液，待细胞融合达90%左右时以胰酶消化并传代，传代至细胞数量达到实验所需数量时将细胞以5×10⁵-1×10⁶/cm²左右的密度接种于6孔细胞培养板，培养1-2d后根据细胞生长情况换分化培养液诱导分化，先用含IBMX的分化培养液[方法：将110mg 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）加入1ml 二甲基亚砜（Diphenylamine，DMSO）中，充分溶解后将其加入1000ml分化培养基中，即可得到IBMX终浓度为0.5mmol/L的分化培养基，0.22μm滤膜过滤灭菌，用时现配]培养4d，每天观察并换液，再用不含IBMX的分化培养液培养6d，每天观察并换液。

细胞分化成熟后用油红O染色法进行脂质鉴定。吸弃培养板里的分化培养基；1×PBS冲洗细胞2-3次；加入10%的甲醛磷酸盐缓冲液4ml/孔，室温固定1h；吸弃固定液；加入油红O溶液，室温染色3h；吸弃染色剂；无菌三蒸水冲洗2次，洗去未着色染料；显微镜下观察，照相。见本发明附图1。附图1中，A：前脂肪细胞（10×15）；B：分化早期细胞（10×25）；C：分化成熟细胞（10×25）；D：油红O染色鉴定（10×25）。3T3-L1前脂肪细胞株接种后24h左右贴壁，倒置显微镜下观察细胞呈梭形，与成纤维细胞形态相似，细胞突触伸展于细胞间隙呈网状（见图1 A）。后细胞逐渐融合，4-6d融合达90%以上。融合达90%以上后2d（第0d）开始诱导分化，第2d细胞形态开始变化，细胞逐渐由梭形变为圆形，胞体变大变圆，胞质中逐渐出现脂滴。脂滴先出现在细胞核周围，逐渐增多呈“花换状”、“串珠状”（见图1 B），后脂滴体积增大并逐渐融合（见图1 C）。油红O染色脂滴被染成亮红色（见图1 D），证实脂肪细胞已分化成熟。开始干预前成熟脂肪细胞达85%以上。

弃去已分化成熟的3T3-L1细胞的培养基，用1×PBS液冲洗2-3遍，后用含0.2%BSA的基础培养基孵育过夜。孵育结束后弃去培养基，用1×PBS液冲洗2-3遍，用本发明所述制备的药液与含2% BSA的高糖DMEM培养基的混合液干预，二者配比如表1所示。

表1：本发明所述药液干预成熟3T3-L1细胞的试剂组成

每组设3个复孔，每孔共加干预液4ml，对照组加入等体积的0.2%BSA的高糖DMEM培养基。5h后进行葡萄糖消耗率的测定。收集干预液残液以葡萄糖氧化酶法测定各组残液葡萄糖浓度。取9个试管，按表2加入各种试剂；试剂全部加入后，将试管放入37℃水浴锅中恒温15min使各种成分充分混匀；以空白管调零，在505nm下测定各管A₅₀₅值，并按照下述公式计算葡萄糖浓度：

表2：葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖浓度的试剂量

结果显示，各组细胞培养液中葡萄糖浓度差异显著（F=98.065，P=0.000）。其中，各药物组（药物体积依次为0.1、0.5、1.0、2.0、3.0mL）细胞培养液中葡萄糖浓度均显著低于对照组（P均<0.01），且药物5组较药物2组的葡萄糖浓度也显著降低（P<0.01），见表3。进一步对培养液中葡萄糖浓度降低程度与药物浓度进行相关性分析显示，在相同作用时间内，随着药物浓度的增加葡萄糖浓度降低程度逐渐增加（r=0.699，F=10.721，P=0.005）。说明本发明所述药物促进了脂肪细胞的糖摄取活性，显著降低了培养液中的葡萄糖浓度。

表3：本发明所述药物对3T3-L1细胞培养液中葡萄糖浓度的影响（N=3，Mean ±S.D）

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与药物组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01。

试验例2：

本发明所述药物（具体为上述实施例2所述的药物）可改善3T3-L1脂肪细胞的胰岛素抵抗（IR）状态，增强IR细胞的糖摄取能力。

根据文献（易屏，陆付耳，陈广，等. 游离脂肪酸诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的分子机制[J]. 中国糖尿病杂志，2008，16（4）：221-224.）的方法制备3T3-L1脂肪细胞IR模型。将3T3-L1脂肪细胞接种于6孔板，诱导分化成熟后，换上含有0.2%的FAF BSA的高糖DMEN无血清培养基【配制方法：称取NaOH颗粒0.16g溶于水定容至l0mL，得到浓度为400 mmol/L的NaOH溶液；称取PA粉末0.1025g与1mL已配置好的400 mmol/L NaOH溶液共同置于50mL灭菌离心管内，90℃水浴加热，摇晃溶解至液体清亮，即为400mmol/L PA溶液。称取lg不含游离脂肪酸BSA（Fatty acid free BSA，FAF BSA）溶于三蒸水中定容至l0mL，得到10% FAF BSA溶液。取10%FAF BSA溶液7mL加入1mL配好的400 mmol/L的PA液中，立即在55℃水浴中振摇混匀，即为50 mmol/L PA溶液。用NaOH 和HCl调整pH值至7.2-7.4，于无菌超净台滤器过滤除菌，-20℃存储。使用时37℃水浴加热，振摇溶解，再按所需浓度加入培养基内】过夜，分4组，每组3孔，分别换上含0 mmol/L PA、0.25 mmol/L PA、0.5 mmol/L PA、1.0 mmol/L PA及1%FAF BSA的高糖DMEM培养24h，收集各组细胞培养液，参考实施例5，用葡萄糖氧化酶法测定各组细胞培养液葡萄糖的含量。

结果显示，在100nmol/L 胰岛素（INS）的作用下，不同浓度的PA作用于3T3-L1脂肪细胞，培养液中葡萄糖的浓度逐渐增加，各实验组（PA浓度分别为0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L）细胞培养液中G浓度均显著高于对照组（F=129.86，p=0.000），0.5 mmol/L PA组较0.25 mmol/L组明显升高（t=6.189，P=0.000），1.0 mmol/L较0. 5 mmol/L明显升高（t=-5.764，p=0.000），见表4。与对照组相比各实验组葡萄糖摄取率分别下降5.25%、10.29%、14.54%。说明PA具有引起3T3-L1脂肪细胞产生IR的作用，且1.0 mmol/L PA作用于3T3-L1细胞24h抑制细胞葡萄糖摄取的效果最显著。

表4：INS和PA对3T3-L1脂肪细胞培养液葡萄糖浓度的作用 （N=3，Mean±S.D）

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与上一实验组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01。

将3T3-L1脂肪细胞接种于6孔板，诱导分化成熟后，换上含有0.2%的FAF BSA的高糖DMEN无血清培养基过夜，分为4组，每组3孔，分别换上含100nmol/L胰岛素、1.0 mmol/L PA的高糖DMEM培养24h，后分别换以0.1mL、0.5mL、1.0mL的本发明所述药物干预5h，收集细胞培养液测定各组细胞培养液葡萄糖的含量。各组试剂组成如表5所示。

表5：本发明所述药物干预3T3-L1脂肪细胞IR模型试剂组成

结果显示，不同浓度的本发明所述药物作用于3T3-L1脂肪细胞IR模型5h，细胞培养液中G浓度逐渐降低，各药物组（药物体积依次为0.1mL、0.5mL、1.0mL）细胞培养液中G浓度均显著低于对照组（F=33.209，P=0.000），且药物2组组较药物1组显著降低（t=10.167，P=0.001）；药物3组较药物2组无差异（t=-2.533，P=0.064），见表1-4。进一步对培养液中G浓度降低程度与药物浓度的相关性分析，随着药物浓度的增加，G浓度降低程度逐渐增加（F=35.499，r=-0.883，P=0.005）。该结果提示，本发明所述药物可增加3T3-L1脂肪细胞对胰岛素的敏感性。

表6：本发明所述药物对3T3-L1脂肪细胞IR模型葡萄糖摄取能力的影响（N=3，Mean±S.D）

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与上一药物组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01。

试验例3：

本发明所述药物（具体为上述实施例3所述的药物）可显著降低实验性糖尿病大鼠的空腹血糖浓度。

SD大鼠，雄性，清洁级，体重180~240g，由山西医科大学实验动物中心提供。禁食12h后参照文献[杨荣泽，严励，傅祖植，等. 糖尿病病鼠肾脏肾素血管紧张素系统活性的改变[J]. 中山医科大学学报，1997，18（2）：104.]的方法腹腔注射1% STZ溶液30mg/kg，连续3d。注STZ后第7d起，以尿糖试纸检测尿糖，凡尿糖定性在+++~++++者，再以血糖仪测定随机血糖，凡血糖>13.5mmol/L者确定为糖尿病造模成功。造模成功的40只大鼠随机分为4组，对照组和3个不同剂量药物组，每组10只。大鼠禁食8h后，尾尖采血，采用强生微量血糖仪测定血糖值。按0 mL/kg、1.0mL/kg、2.0mL/kg、3.0mL/kg腹腔注射给予本发明药物（用生理盐水补足体积0.5mL），而对照组腹腔注射生理盐水（NS）0.5mL，注射4h后测定空腹葡萄糖的浓度。

药物组和对照组大鼠在规定时间采血，用强生快速微量血糖仪测定血糖浓度。检测结果显示，药物作用4h后，对照组与各药物组大鼠的血糖水平有显著性差别（P<0.01），药物干预的三个实验组动物的血糖浓度均显著低于对照组，差异具有显著性，结果见表7、图2。在药物为1.0-3.0mL/kg的剂量范围内，实验组血清葡萄糖降低为20-36%，而对照组降低仅为9%，各实验组之间也有显著性差别（P<0.01）。经进一步统计分析发现，各组大鼠血糖降低的程度与药物的干预剂量相关，二者r=0.717，经检验该r值具有统计学意义（F=10.552、P=0.009），这说明本发明所述的药物具有降低糖尿病大鼠血糖的作用，且降糖幅度有剂量依赖性。

表7：本发明所述药物对大鼠空腹血糖的影响

注：^a表示对照组与各实验组相比血糖下降幅度有显著性差异，P<0.01；^b表示低剂量实验组与其它各组相比血糖下降幅度有显著性差异 ，P<0.01；^c表示中剂量组与其它各组相比血糖下降幅度有显著性差异，P<0.01；^d 表示高剂量组与其它各组相比血糖下降幅度有显著性差异，P<0.01。

Claims (4)

1.一种可降低血糖的药物制剂，其特征在于其是以脂联素球状结构域（gAd）和胰高血糖素样肽-1（GLP-1）为主要成分，包括浓度为200ng/mL到2000ng/mL的gAd、3                                                

g/mL到15g/mL的GLP-1、药用缓冲液、稳定剂以及水，pH为7.4。

2.根据权利要求1所述的一种可降低血糖的药物制剂，其特征在于药用缓冲液为柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘露醇缓冲液中的一种或多种。

3.根据权利要求1或2所述的一种可降低血糖的药物制剂，其特征在于稳定剂为EDTA、苯甲醇、间甲酚或辛酸纳。

4.根据权利要求3所述的一种可降低血糖的药物制剂，其特征在于所述的制剂形式为冻干剂型或液体剂型。

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