CN101906156B - 一种双功能蛋白及其衍生物的结构及用途 - Google Patents

一种双功能蛋白及其衍生物的结构及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种重组双功能蛋白及其衍生物的结构及用途，属于生物工程技术领域。本发明采用计算机辅助分子设计的技术，结合接头工程的手段，设计并制备获得了同时具有降血糖和降血脂双重功能的重组蛋白；并在此基础上对所得目标重组蛋白进行了聚乙二醇化学修饰。目标重组蛋白及其化学修饰衍生物在糖尿病模型小鼠上表现出了显著的降血糖和降血脂活性。本发明所述分子可用于糖尿病及其并发疾病的治疗。

Description

一种双功能蛋白及其衍生物的结构及用途
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种双功能蛋白及其衍生物的分子结构，以及具有该结构的分子在糖尿病及其并发疾病治疗中的用途。
背景技术
糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种多病因的代谢系统疾病，其特点为慢性高血糖并伴随有胰岛素分泌和(或)作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。该疾病又可分为两种类型：一型糖尿病，又称胰岛素依赖性糖尿病；二型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)，又称非胰岛素依赖型糖尿病。其中，T2DM占总发病人数的95％以上。
随着生活水平的提高和老龄化的加重，我国糖尿病患者的数量在不断增加。据权威数据预测，到2030年，我国糖尿病或者的数量将高达4200万(新英格兰医学杂志第356卷第3期，214页)。而多种流行病学数据也表明，目前我国糖耐量降低(impaired glucose tolerance，IGT)患者的数量也增长迅速，这个人群将来发展成为T2DM患者的可能性极大。
T2DM的具体发病机理现在尚不清楚，遗传、环境以及生活方式的改变等都可能起到了重要作用。在该病的发生和发展过程有，有两方面的病变是十分明显的：胰岛素抵抗(insulinresistant，IR)和胰岛素分泌的相对不足。发病初期首先出现的是胰岛素抵抗，紧随其后的是胰岛素分泌的代偿性增加。随着胰岛素抵抗的不断加重，胰岛β细胞不堪重负而出现损伤，继而胰岛素分泌出现相对不足，最终导致糖尿病症状的出现。发病初期，病人尚可通过锻炼和控制饮食维持正常血糖水平，但随着病程的发展，后期则必须使用药物以维持正常血糖水平。病人需终身用药并不断监测血糖水平，严重影响到其生活质量。
目前已有多种药物应用于糖尿病的临床治疗，但仍有许多糖尿病病人无法通过现有药物的治疗维持正常血糖水平。而且，由于靶点单一或者选择性不够高等原因，目前已有药物多具有较强副作用，长期用药会给病人带来较大危害。再者，在糖尿病综合症的预防及治疗中，这些已有药物的作用也有限，而糖尿病并发肾病及心血管疾病往往具有较高的致命性。所以，研究开发新的多靶点、多途径起效的糖尿病治疗用药物分子势在必行。
近年来的研究发现，脂肪组织既可储存能量，还能分泌多种具有重要生物活性的蛋白因子，脂联素(adiponectin，AD)即是其中之一。该分子可降低甘油三酯(triglyceride，TG)和血糖水平，减轻胰岛素抵抗并增加胰岛素敏感性(insulin sensitivity，IS)，抑制动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的形成。脂联素是从人脂肪组织的cDNA文库中克隆得到的，由247个氨基酸组成，分四个结构域：氨基末端信号序列、短的高变区(不同物种间不具有同源性)、胶原区及C端球状结构域(globular domain of adiponectin，gAD)。脂联素无昼夜分泌规律，在血浆中具有较高浓度(5-30微克每毫升)，占血浆蛋白的0.01％，此浓度比其它血浆蛋白高3倍以上。
血浆中的脂联素主要以两种形式存在，全长型的脂联素蛋白(full length adiponectin，fAD)和截短型的球状域蛋白。研究表明，球状域蛋白虽然只占总量的极少部分，但可能具有更高的生物活性。全长蛋白和球状域蛋白在骨骼肌都可以刺激AMPK的磷酸化和活化，且球状域蛋白的活性更强一些。单独给予球状域蛋白可以剂量依赖性的刺激胰岛素介导的葡萄糖摄取，其机制是刺激AMPK的活化。和胰岛素相比，脂联素具有降脂、减轻体重、抗炎和抑制血管生成等优点，是一种潜在的、有希望的降糖调脂药物，可能在二型糖尿病的治疗中具有较高的应用价值(Nature Medicine杂志，第7卷第8期941页；Endocrine Review杂志，第26卷第3期439页)。
已有数据表明脂联素可能在糖尿病的治疗中有较高价值，但这并不意味着脂联素本身就可以作为糖尿病治疗用药物。事实上，脂联素的分子原形并不是糖尿病治疗用的理想分子。这主要是由以下原因造成的。(1)首先，糖尿病是一种发病机理复杂、病程漫长的慢性代谢系统综合症，其治疗往往需要长期给药以稳定的控制血糖，而蛋白质类药物多是注射途径给药的，为维持有效药物浓度，病人需反复注射，这一点导致了病人的依从性较差。如果能延长脂联素分子在人体内的半衰期，将很大程度上提高病人的依从性，增加脂联素及其改构体或衍生物用于糖尿病临床治疗的可能性。(2)其次，同样是由于长期反复给药，药物分子的免疫原性和抗原性都是不得不考虑的问题，如果免疫原性太强，一旦产生内源性抗体，将会导致临床治疗的中途停止。所以，通过特定途径降低脂联素分子的免疫原性和抗原性是极有必要的。(3)再者，脂联素在人体内主要起到减轻胰岛素抵抗及降血脂的作用，对胰岛素分泌及血糖水平的直接影响是极为有限的，而血糖水平的控制在糖尿病及其综合症的预防及治疗中是极为重要的一点。所以，通过分子改构，使得脂联素具有更强的降血糖活性是将该分子开发为糖尿病治疗用药物分子的重要一环。综上可见，有必要对脂联素进行分子改构和(或)相应的的化学修饰，以使得改构体分子及其结构衍生物更适合于糖尿病的临床治疗。
借助于蛋白质工程的技术手段，结合计算机辅助药物分子设计的方法，我们可以使得一个蛋白质具有我们所需要的多种功能。该技术在药物蛋白质设计领域已经得到广泛应用。利用此技术，通过在脂联素球状结构域的N末端融合特定的促胰岛素分泌多肽，我们可以获得具有双重功能的脂联素C端球状结构域变构体融合蛋白质。
将两个分子融合表达需要在其中间添加特定的连接序列(linker)。为保证目的融合蛋白的生物活性，同时为使目的分子具有较好的理化稳定性，往往需要对连接序列进行优化。由于分子侧链较小且具有一定的柔性，甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)经常被用于分子连接。这两个氨基酸的多串联形式(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸)3或(甘氨酸-丝氨酸)7-甘氨酸目前已被作为一个通用linker用到融合蛋白构建中。但是，在我们的前期研究中发现，由15个氨基酸组成的多串联甘氨酸-丝氨酸作为linker虽然可以较好的保持融合蛋白两个结构域各自的生物活性，但由于该linker较长，使得最终获得的目的蛋白具有较强的免疫原性甚至有一定的毒性。在本发明中，我们针对这一linker结构做了工程化设计，最终获得了符合要求的linker结构并应用到目的分子连接中。
聚乙二醇(PEG)修饰技术是近年来发展起来的一种分子变构技术，该技术通过对蛋白质多肽类药物分子进行聚乙二醇共价偶联以降低其免疫源性、增强其稳定性并延长其体内半衰期，目前以成功应用于多个蛋白质多肽类药物分子开发上。聚乙二醇具有较强的与水分子耦合的能力，将它共价结合到蛋白质多肽分子上可显著提高底物分子的水合半径，极大程度上降低肾排除；聚乙二醇修饰还可以显著提高蛋白质多肽分子在人体内的稳定性，增强蛋白质多肽对人体内蛋白酶的抵抗能力；此外，聚乙二醇修饰还可以遮蔽蛋白质多肽分子表面的可识别位点，降低该分子被内皮网状系统摄取的几率(Advanced Drug Delivery Reviews杂志，2002年第54卷第479页)。
公开号为CN 101332294A的发明专利公开了脂联素C末端球状结构域用于治疗糖尿病缺血性心脏病的应用。该专利所使用的是球状结构域原形分子，故而与本发明所述及的重组蛋白质分子没有冲突。专利号ZL200510100468.9的发明专利对可溶性肿瘤坏死因子a受体II-脂联素C末端球状结构域融合蛋白的分子结构进行了保护，希望借助于球状结构域的三聚化促使可溶性肿瘤坏死因子a受体II形成同源二或者三聚体，以增强其拮抗肿瘤坏死因子a的能力并延长其半衰期。该专利从分子结构到目的均与本发明没有冲突。公开号为CN1483041A的专利涉及与一些蛋白融合的胰高血糖素样肽-1化合物，所述蛋白具有延长胰高血糖素样肽-1化合物体内半衰期的作用。该发明最终的分子结构与本发明不存在冲突。公开号为CN 1927888A的专利设计降血糖肽与溶菌酶的融合蛋白及其用途，该专利最终分子结构与本发明不存在冲突。公开号为CN 1893980A的专利涉及与白蛋白样物质相连的胰高血糖素样肽-1融合蛋白，其最终分子结构与本发明所述及的分子结构不存在冲突。公开号为CN1802386A的专利涉及与特定IgG4-Fc衍生物融合的特定GLP-1类似物，该专利所保护的最终分子结构与本发明所述及的分子结构之间不存在冲突。
本发明采用蛋白质工程的方法，利用计算机辅助分子设计的手段，结合接头工程的技术，通过对脂联素的C端球状结构域进行分子改构以及聚乙二醇化学修饰，获得了更适合糖尿病及其并发症临床治疗的药物分子。所获得的变构体分子及其化学修饰衍生物作用靶点多元化且作用途径广泛，较脂联素原形分子具有更强的降血糖活力、更低的免疫原性及更高的体内稳定性，可能在糖尿病及其并发疾病的临床治疗中具有较高应用价值。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种重组双功能蛋白质的分子结构，所述分子结构符合以下结构要求：多肽A-Linker-多肽B，并且其中：
(1)多肽A为序列1(SQD ID NO：1)所示的氨基酸序列，其序列为：
His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa2-Ser-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Glu-Xaa6-Xaa7-Ala-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Phe-Ile-Xaa11-Trp-Leu-Xaa12-Xaa13-Gly-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23
其中：
Xaa1为：Gly、Ser、Val或Ala；
Xaa2为：Leu、Ser、Val、Gly或Ala；
Xaa3为：Lys、Arg、Ala、Val或Gly；
Xaa4为：Gln、Tyr、Ala、Phe或Gly；
Xaa5为：Met、Leu、Ala、Ile或Gly；
Xaa6为：Glu、Gly、Ala、Asp或Gln；
Xaa7为：Glu、Gly、Gln、Asp或Ala；
Xaa8为：Val、Gly、Ala、Leu或Met；
Xaa9为：Lys、Arg、Gly、Leu或Ala；
Xaa10为：Leu、Glu、Gly、Asp或Ala；
Xaa11为：Glu、Gly、Asp或Ala；
Xaa12为：Lys、Arg、Gly或Ala；
Xaa13为：Asn、Lys、Arg、Gly或Ala；
Xaa14为：Gly、Lys、Arg或Ala；
Xaa15为：Pro、Gly、Ser、Val、Ala或缺失；
Xaa16为：Ser、Gly、Leu、Val、Ala或缺失；
Xaa17为：Ser、Ile、Leu、Gly、Ala或缺失；
Xaa18为：Gly、Ile、Leu、Ser、Ala或缺失；
Xaa19为：Ala、Ile、Leu、Ser、Gly或缺失；
Xaa20为：Pro、Gly、Leu、Ser或缺失；
Xaa21为：Pro、Gly、Ala、Ser、Val或缺失；
Xaa22为：Pro、Gly、Leu、Ser、Val或缺失；
Xaa23为：Ser、Gly、Leu、Ala、Val或缺失；
并且其中：
如果Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa18、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa22或Xaa23缺失时则多肽A序列中该氨基酸下游的氨基酸缺失，
(2)Linker的结构为Ala-Met-Gly、Gly-Met-Gly或Gly-Ala-Met-Gly，
(3)多肽B为序列2(SQD ID NO：2)所示的氨基酸序列，其序列为：
Ala-Tyr-Val-Tyr-Arg-Ser-Ala-Phe-Ser-Val-Gly-Leu-Glu-Thr-Tyr-Val-Thr-Ile-Pro-Asn-Met-Pro-Ile-Arg-Phe-Thr-Xaa1-Ile-Phe-Tyr-Asn-Gln-Gln-Asn-His-Tyr-Asp-Gly-Ser-Thr-Gly-Xaa2-Phe-His-Cys-Asn-Ile-Pro-Gly-Leu-Tyr-Tyr-Phe-Ala-Tyr-His-Ile-Thr-Val-Tyr-Met-Xaa3-Asp-Val-Xaa4-Val-Ser-Leu-Phe-Xaa5-Xaa6-Asp-Xaa7-Ala-Met-Leu-Phe-Thr-Tyr-Asp-Gln-Tyr-Gln-Glu-Asn-Asn-Val-Asp-Gln-Ala-Ser-Gly-Ser-Val-Leu-Leu-His-Leu-Glu-Val-Gly-Asp-Gln-Val-Trp-Leu-Gln-Val-Tyr-Gly-Glu-Gly-Glu-Arg-Asn-Gly-Leu-Tyr-Ala-Asp-Asn-Asp-Asn-Asp-Ser-Thr-Phe-Thr-Gly-Phe-Leu-Leu-Tyr-His-Asp-Thr-Asn-Xaa8
其中：
Xaa1为：Lys、Arg、Ala或Gly；
Xaa2为：Lys、Arg、Gly、Cys、Ala或Gln；
Xaa3为：Lys、Arg、Gly、Cys、Ala或Gln；
Xaa4为：Lys、Arg、Gly、Cys、Ala或Gln；
Xaa5为：Lys、Arg、Gly、Cys、Ala或Gln；
Xaa6为：Lys、Arg、Gly、Cys、Ala或Gln；
Xaa7为：Lys、Arg、Gly、Cys、Ala或Gln；
Xaa8为：Lys、Gly、Ala、Cys或缺失。
本发明的目的之二在于提供发明目的一所述重组蛋白与聚乙二醇的共价结合物，该共价结合物连接有至少1个聚乙二醇分子，其中所述聚乙二醇分子连接到所述蛋白质的Cys、Lys或His氨基酸上，并且其中所述聚乙二醇的分子量范围在2000到60000道尔顿。
本发明的目的之三在于提供目的之一所述重组蛋白质的用于制备治疗糖尿病、糖尿病并发动脉粥样硬化、肥胖症、老年痴呆症或心肌梗塞的疾病的药物的用途。本课题组在前期研究中发现，发明目的一所述重组双功能蛋白可显著改善糖尿病模型小鼠的胰岛功能，明显降低其血糖水平，显著提高其空腹胰岛素水平，并改善其脂代谢。此外，所述蛋白还可起到抑制饮食、抑制胃排空、促进胰岛RINm5F细胞增殖、抑制胰岛RINm5F细胞凋亡的作用。
本发明的目的之四在于提供目的二所述重组蛋白与聚乙二醇的共价结合物的用于制备治疗糖尿病、糖尿病并发动脉粥样硬化、肥胖症、老年痴呆症或心肌梗塞的疾病的药物的用途。本课题组的前期研究数据表明，聚乙二醇修饰可显著延长所述重组蛋白的半衰期，增强其理化稳定性，并明显降低其免疫原性。在动物实验中，糖尿病模型小鼠经所述重组蛋白与聚乙二醇的共价结合物治疗两周，空腹血糖水平降至10.0mmol/L以下(11.1mmol/L认定为高血糖标准)，糖化血清蛋白水平显著降低，血脂水平恢复正常，胰岛素抵抗状态得到显著改善。最为关键的是，经治疗，糖尿病模型小鼠的胰岛功能得到了显著的改善，病理切片结合HE染色分析表明病变状况有明显缓解。
附图说明
本发明附图5张，它们分别是：
图1：实施例1所述目标重组蛋白质样品的SDS-PAGE分析图。其中，第一道(标号M)为低分子量蛋白标准；第二道(标号1)为分离纯化后的重组蛋白质样品(箭头所指处)，其表观分子量约20KDa，与理论分子量一致。低分子量蛋白标准的分子量自上至下依次为94KDa、66.2KDa、45KDa、35KDa、28.5KDa、20KDa及14.4KDa。
图2：实施例3所述目标重组蛋白质的聚乙二醇修饰产物的SDS-PAGE分析图。其中，第一道(标号M)为低分子量蛋白标准；第二道(标号1)为聚乙二醇(分子量5KDa)修饰重组蛋白质样品(箭头所指处)，其表观分子量约35KDa(由于聚乙二醇的高度水合效应，修饰物的表观分子量远高于其理论分子量25KDa)。低分子量蛋白标准的分子量自上至下依次为94KDa、66.2KDa、45KDa、35KDa、28.5KDa、20KDa及14.4KDa。
图3：实施例1所述目标重组蛋白质样品在健康ICR小鼠腹腔注射糖耐量试验(IPGTT)中的降血糖效果。具体试验过程按实施例4开展。图中，横坐标标号1为空白对照组(腹腔注射同体积生理盐水)，标号2为重组蛋白质组(按25noml/kg剂量腹腔注射目标重组蛋白质)，每组10只健康雄性ICR小鼠。纵坐标以平均值加减标准偏差表示。数理统计采用SPSS软件，进行单因素方差分析。(***)p＜0.001，极显著差异。
图4：实施例1所述目标重组蛋白质样品在糖尿病模型动物的降血糖作用。动物模型复制及药物治疗方案按实施例7进行，分别于造模前、造模结束、治疗第一周结束和治疗第二周结束取空腹血测定血糖浓度。模型对照组(○)只给予生理盐水，治疗组
Figure GSB00000101204100061
给予实施例1所述目标重组蛋白质样品(25nmol/kg)。横坐标为时间(第几周)，纵坐标为空腹血糖值(以平均值加减标准偏差表示)。5个向下的箭头代表五次注射链佐菌素(STZ，50mg/kg)造模，详参实施例10。经目标重组蛋白质样品治疗两周，糖尿病模型小鼠的空腹血糖明显降低。数理统计采用SPSS软件，进行单因素方差分析。(*)p＜0.05，显著性差异；(***)p＜0.001，极显著差异。每组10只雄性ICR糖尿病模型小鼠。
图5：实施例1所述重组蛋白质样品在糖尿病模型动物的提高空腹胰岛素浓度作用。动物模型复制及药物治疗方案按实施例7进行，于治疗第二周结束后摘眼球取空腹血测定胰岛素含量。胰岛素测定采用碘125胰岛素放射免疫分析药盒(北京普尔伟业生物科技有限公司)进行分析。横坐标第1组为糖尿病模型对照组，第2组为重组蛋白质治疗组(按25noml/kg剂量腹腔注射)。纵坐标为胰岛素浓度，以平均值加减标准偏差表示。每组10只雄性ICR糖尿病模型小鼠。结果数理统计采用SPSS软件，进行单因素方差分析。(**)p＜0.01，极显著差异。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步详述本发明。以下实施例的目的在于对本发明进行进一步阐明，但无论如何这些实施例并不意味着对本发明进行限制。说明书及实施例中采用的菌株、质粒、化学试剂等，如未特殊说明均按常规实验条件进行操作，或者按供应商提供的说明进行操作。
实施例1
重组蛋白质的分子构建及样品制备
所述重组蛋白质的氨基酸序列为：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Ala-Met-Gly-Ala-Tyr-Val-Tyr-Arg-Ser-Ala-Phe-Ser-Val-Gly-Leu-Glu-Thr-Tyr-Val-Thr-Ile-Pro-Asn-Met-Pro-Ile-Arg-Phe-Thr-Lys-Ile-Phe-Tyr-Asn-Gln-Gln-Asn-His-Tyr-Asp-Gly-Ser-Thr-Gly-Lys-Phe-His-Cys-Asn-Ile-Pro-Gly-Leu-Tyr-Tyr-Phe-Ala-Tyr-His-Ile-Thr-Val-Tyr-Met-Lys-Asp-Val-Lys-Val-Ser-Leu-Phe-Lys-Lys-Asp-Lys-Ala-Met-Leu-Phe-Thr-Tyr-Asp-Gln-Tyr-Gln-Glu-Asn-Asn-Val-Asp-Gln-Ala-Ser-Gly-Ser-Val-Leu-Leu-His-Leu-Glu-Val-Gly-Asp-Gln-Val-Trp-Leu-Gln-Val-Tyr-Gly-Glu-Gly-Glu-Arg-Asn-Gly-Leu-Tyr-Ala-Asp-Asn-Asp-Asn-Asp-Ser-Thr-Phe-Thr-Gly-Phe-Leu-Leu-Tyr-His-Asp-Thr-Asn
该重组蛋白质共有170个氨基酸组成，理论分子量19430.6道尔顿。按照大肠杆菌密码子表，结合大肠杆菌密码子的偏爱性，设计并合成该重组蛋白质氨基酸序列相对应的核酸序列，核酸序列合成工作委托德国GENEART公司完成。
将目的基因序列分别通过相应的酶切位点插入到以下表达载体：pET22b(T7启动子，周质表达)、pET28a(T7启动子)、pET32a(T7启动子，融合硫氧还原蛋白表达)、pGEX-KG(tac启动子，融合谷胱甘肽转移酶表达)、pTYB11(T7启动子，融合内含肽进行自裂解表达)、pQE30(T5启动子，融合组氨酸标签表达)以及pMAL-p5X(tac启动子，融合麦芽糖结合蛋白表达)。重组质粒转化大肠杆菌DH5alpha，经琼脂糖平板结合抗性筛选，获得所需质粒。双酶切反应结合琼脂糖电泳分析初步确定重组质粒正确性。目的质粒送样进行DNA序列测定(测序工作在南京金斯瑞公司完成)，最终确定重组质粒序列正确性。
提取质粒，重新转化表达宿主菌BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysR。具体操作操作按《分子克隆》第三版进行。挑取单菌落进行IPTG诱导表达，15％SDS-PAGE测定结合Quantity-One软件分析，筛选高产菌株。以生物量、表达量、蛋白可溶性及目标蛋白在全长蛋白所占比例为指标筛选最终所需工程菌株。经综合分析，最终确定以pET32a为表达质粒，BL21(DE3)为表达宿主菌。IPTG最佳诱导浓度为0.5mM。选定在OD600＝0.6到1.0之间进行诱导，最佳诱导时间为4小时。
经摇瓶培养，4度条件下8000rpm离心20分钟，每升培养基可获取湿菌约10g。湿菌经20mM PB pH7.2洗涤，重新8000rpm离心20分钟。沉淀物以100mM NaCl，5mM EDTA，20mMPB pH7.2按1/10(m/V)重悬，超声裂解。革兰氏染色，油镜检测裂解情况。
菌体裂解液在4度条件下经12000rpm离心30min，弃去沉淀保留上清重复离心一次。取上清液过Ni柱层析纯化。具体操作在GE Healthcare的AKTA液相系统上进行。上样液流速1ml/min，整个层析过程保持该流速不变。洗涤液为20mM咪唑，20mM Tris-HCl，pH 8.0，洗脱液组成为500mM咪唑，20mM Tris-HCl，pH 8.0。洗脱组分分部收集，按UV检测器指示合并目标峰。透析除去咪唑，Lowry法测定蛋白浓度，15％SDS-PAGE测定蛋白纯度，计算蛋白总量。
经上述一步纯化，从1L培养液中可获得50mg左右纯度约95％的目标蛋白。所得蛋白经透析置换缓冲体系，最终缓冲体系为2mM CaCl2，20mM Tris-HCl，pH8.0。按照每0.1mg目的蛋白1微升酶的标准添加肠激酶，37度切割12小时。
切割产物经Ni柱纯化，收集流穿组分。合并流穿液超滤浓缩后再进行进一步层析纯化。以下操作均在GE Healthcare的AKTA液相系统上进行。层析柱选用Sephacryl S200分子排阻预装柱，流动相为150mM NaCl，20mM PB，pH7.2。设定280nm做监测波长，流速设定在0.8ml/min，上样量5mg总蛋白(蛋白浓度5mg/ml，1ml体积)，分部收集流出组分，SDS-PAGE分析后合并目标组分。样品分多次上样纯化，合并每次所得目标重组蛋白。
经上述制备操作，每升工程菌培养液可获得目标重组蛋白10mg左右，纯度约98％。该样品保存于零下70度冰箱以备后面做相应检测。
实施例2
重组蛋白质的构建及制备
所述重组蛋白质的氨基酸序列为：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Gly-Met-Gly-Ala-Tyr-Val-Tyr-Arg-Ser-Ala-Phe-Ser-Val-Gly-Leu-Glu-Thr-Tyr-Val-Thr-Ile-Pro-Asn-Met-Pro-Ile-Arg-Phe-Thr-Lys-Ile-Phe-Tyr-Asn-Gln-Gln-Asn-His-Tyr-Asp-Gly-Ser-Thr-Gly-Lys-Phe-His-Cys-Asn-Ile-Pro-Gly-Leu-Tyr-Tyr-Phe-Ala-Tyr-His-Ile-Thr-Val-Tyr-Met-Lys-Asp-Val-Lys-Val-Ser-Leu-Phe-Lys-Lys-Asp-Lys-Ala-Met-Leu-Phe-Thr-Tyr-Asp-Gln-Tyr-Gln-Glu-Asn-Asn-Val-Asp-Gln-Ala-Ser-Gly-Ser-Val-Leu-Leu-His-Leu-Glu-Val-Gly-Asp-Gln-Val-Trp-Leu-Gln-Val-Tyr-Gly-Glu-Gly-Glu-Arg-Asn-Gly-Leu-Tyr-Ala-Asp-Asn-Asp-Asn-Asp-Ser-Thr-Phe-Thr-Gly-Phe-Leu-Leu-Tyr-His-Asp-Thr-Asn
该重组蛋白质共由179个氨基酸组成。按照大肠杆菌密码子表，结合大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成该重组蛋白质氨基酸序列相对应的核酸序列(核酸序列合成工作委托德国GENEART公司完成)。
将目的基因序列分别通过相应的酶切位点插入到以下表达载体：pET32a(T7启动子，融合硫氧还原蛋白表达)、pGEX-KG(tac启动子，融合谷胱甘肽转移酶表达)以及pTYB11(T7启动子，融合内含肽进行自裂解表达)。
重组质粒转化克隆宿主菌DH5alpha并进行抗性筛选。重新提取质粒做双酶切鉴定。双酶切鉴定正确的重组质粒送样进行DNA测序(委托南京金斯瑞公司完成DNA测序工作)。最终确定重组质粒核酸序列的正确性。
筛选高产菌株工作可参考实施例1。最终发现重组蛋白在pGEX-KG和pTYB11表达质粒上表达量极低(PAGE检测未发现明显诱导条带)，在pET32a表达载体上可见明显诱导表达条带出现。最终选定表达载体为pET32a，宿主菌为BL21(DE3)。
蛋白纯化工作可参考实施例1。以下方面需要注意：(1)该蛋白理化性质不稳定，容易形成二聚体，在纯化过程中需添加5mM的beta-巯基乙醇；(2)该蛋白在肠激酶酶切割过程中会有明显的错误切割条带出现，降低切割反应温度至25度可显著降低错误切割的程度。
经上述制备操作，每升培养液最终可获得目标重组蛋白5mg左右，经12％SDS-PAGE测定结合Quantity-One软件分析，其蛋白纯度约95％。蛋白样品保存在零下70度冰箱以备后面相关检测使用。
实施例3
实施例1所得重组蛋白质的聚乙二醇修饰及修饰产物的制备
准确量取实施例1所得重组蛋白质10mg(1mg/ml，10ml)，透析置换缓冲体系。经透析后，最终反应体系为Buffer R5(100mM NaCl，5mM EDTA，20mM Na2HPO4-NaH2PO4，pH8.0)。按摩尔比1∶10向反应体系中添加马来酰亚胺活化的聚乙二醇(分子量20000道尔顿)，将反应混合物放置在4度恒温箱进行搅拌反应，搅拌装置的转速设定为60rpm。经24小时反应后，将反应混合物按1∶5(V/V)稀释至Buffer D5(5mM EDTA，20mM Tris-HCl，pH8.0)后进行液相层析纯化。
液相系统采用GE Healthcare的AKTA中低压装置，层析柱为20×1.6(I.D.，cm)的硅烷化玻璃柱，层析填料为购自GE Healthcare的DEAE-Sepharose Fast Flow树脂。树脂先经20倍体积蒸馏水洗涤，再经抽真空脱气，然后装填层析柱。采用手工装柱的方法，具体按树脂说明书进行。整个纯化过程采用以下两种缓冲系统：BufferA3(20mM Tris-HCl，pH8.0)和Buffer B3(1M NaCl，20mM Tris-HCl，pH8.0)；流速设定在2ml/min。层析柱先经5倍柱体积的Buffer A冲洗。待冲洗结束且紫外检测稳定在基线后，开始上样。上样结束后，采用10倍柱体积的BufferA进行冲洗。待冲洗结束，设定线性洗脱程序：0％Buffer A3-100％Buffer B3，洗脱时间设定为60min。洗脱液分部收集，每管3ml，共收集40管。
洗脱过程出现两个主峰，第一个峰为修饰后的蛋白质，第二个峰为未修饰蛋白质。将第一个峰的样品合并。测定样品体积后，采用Lowry法测定样品的蛋白质浓度。采用10％SDS-PAGE的方法测定样品纯度，每孔的蛋白质上样量控制在8微克；染色时先采用考马斯亮蓝R250染色，然后采用碘-氯化钡染色。
实施例4
正常ICR小鼠腹腔注射糖耐量试验(IPGTT)
试验动物为ICR小鼠(雄性)，购自扬州大学实验动物中心。动物饲养按照以下要求操作：12小时照明，12小时黑暗，室温25度。动物取回后，适应7天，然后开始试验。
取ICR小鼠20只，分成两组，每组10只。于第一天的18点禁食(不禁水)，禁食18小时，到第二天12点开始正式测定试验。
于0时刻经眼眶后静脉取血，然后第2组给予重组蛋白质(按实施例1所述方案制备获得的重组蛋白质样品，给药剂量为25nmol/kg)；第1组给予相同量的生理盐水(8ml/kg)，给药方式为腹腔注射。同时，两组均按18mmol/kg剂量给高糖，给予方式同样为腹腔注射。此后，分别于第15min、30min、45min和60min经眼眶后静脉取血。血液室温放置15min，低速离心分离血清，采用Blood glucose test kit(上海荣盛生物药业有限公司)测定血糖含量，具体试验操作按照试剂盒的说明书进行。试验结果采用SPSS软件进行统计分析。
实施例5
双功能蛋白对正常ICR小鼠饮食的影响
试验动物为ICR小鼠(雄性)，购自扬州大学实验动物中心。动物饲养按照以下要求操作：12小时照明，12小时黑暗，室温25度。动物取回后，适应7天，然后开始试验。
取ICR小鼠14只，按每个鼠笼1只进行分组，共14组。其中前7组为给药组，后7组为对照组。于第一天的18点禁食(不禁水)，禁食18小时，到第二天12点开始正式测定试验。
于第二天12点整，前7组给予重组蛋白质(按实施例1所述方案制备获得的重组蛋白质样品，给药剂量为25nmol/kg)，后7组给予同样剂量的生理盐水(作为空白对照，8ml/kg)，给药方式均为腹腔注射。同时，每组小鼠均定量给予20g鼠粮和100g水。其后，让小鼠自由饮食。
于第三天12点整，移走鼠粮和水并分别称重(鼠粮为m1，水为m2)。减重法计算得到小鼠24小时吃的食物的质量(20-m1)和喝的水的质量(100-m2)。小鼠体重为m0，按以下公式计算小鼠吃的食物比重：[(20-m1)/m0]×100％；按以下公式计算小鼠喝的水的比重：[(100-m2)/m0]×100％。试验结果采用SPSS软件进行数理统计处理。
实施例6
双功能蛋白对正常ICR小鼠胃排空的影响
试验动物为ICR小鼠(雄性)，购自扬州大学实验动物中心。动物饲养按照以下要求操作：12小时照明，12小时黑暗，室温25度。动物取回后，适应7天，然后开始试验。
取ICR小鼠10只，按每个鼠笼1只进行分组，共10组。其中前5组为给药组，后5组为对照组。于第一天的18点禁食(不禁水)，禁食18小时，到第二天12点开始正式测定试验。
于第二天12点整，10组小鼠均按每组20g标准给予鼠粮。然后，让小鼠自由饮食1小时。其后，前5组给予重组蛋白质(按实施例1所述方案制备获得的重组蛋白质样品，给药剂量为25nmol/kg)，后5组给予同样剂量的生理盐水(作为空白对照，8ml/kg)，给药方式均为腹腔注射。在给药同时，撤掉所有鼠粮(并以天平称重m)并换用新的垫料。3小时后，处死小鼠，行胃切除术。
以天平准确测定鼠胃质量m0，然后用手术刀切开鼠胃并仔细取出其内容物，再以天平测定剩余空鼠胃质量m1。减重法计算其内容物质量。胃排空率按以下公式计算：胃排空率＝[(m0-m1)/(20-m)]×100％。试验结果采用SPSS软件进行统计学分析。
实施例7
双功能蛋白对糖尿病模型小鼠的治疗作用试验
试验动物为ICR小鼠(雄性)，购自扬州大学实验动物中心。动物饲养按照以下要求操作：12小时照明，12小时黑暗，室温25度。动物取回后，适应7天，然后开始试验。
糖尿病模型按以下方法复制。
小鼠分组：取ICR小鼠50只，按每组5只分成10组，让其自由饮食。
溶液配制：配制柠檬酸缓冲液并准确调整pH为4.0(该溶液现配现用，用前冰浴30min)。每组小鼠准确称取链佐菌素10mg(购自Sigma公司)，加柠檬酸缓冲液4ml，在冰上配制成浓度为2.5mg/ml的溶液(该溶液现配现用，室温放置不得超过15min)。
模型制备：于每日上午10点禁食，禁食时间为4小时，14点开始模型制备试验。于14点整，每只ICR小鼠按50mg/kg的剂量腹腔注射给予链佐菌素的柠檬酸溶液。其后，让小鼠自由饮食。该试验重复5天。其后，让小鼠自由饮食并恢复3天。
血糖测定：经3天恢复后，禁食4小时，眼眶后静脉取空腹血，以Blood glucose test kit(上海荣盛生物药业有限公司)测定血糖浓度。按血糖浓度高于11.1mmol/L为模型成立。
模型动物分组：舍弃造模不成功小鼠，以血糖高于11.1mmol/L且血糖值相近小鼠为造模成功小鼠。取20只造模成功小鼠随机分为2组，第一组为药物治疗组，第二组为空白对照组。
按以下方法进行模型动物治疗试验。
药物治疗组：给予重组蛋白质(按实施例1所述方案制备获得的重组蛋白质样品，给药剂量为25nmol/kg)，于每天上午9点腹腔注射给药。
空白对照组：给予相应体积的生理盐水(8ml/kg)，给药方式为腹腔注射。
对以下指标进行分析测定：
(1)分别与治疗开始，治疗第一周结束和治疗第二周结束测定空腹血糖值。血糖测定采用Blood glucose test kit(上海荣盛生物药业有限公司)进行。
(2)于治疗第二周结束时行口服糖耐量试验(OGTT)：按2g/kg给予高糖，分别于0min、30min、60min和120min经眼眶后静脉取血测定血糖含量。血糖测定采用Blood glucose testkit(上海荣盛生物药业有限公司)进行。
(3)于治疗第二周结束时取空腹血测定胰岛素含量。胰岛素测定采用碘125胰岛素放射免疫分析药盒(北京普尔伟业生物科技有限公司)进行分析，样品送至东南大学附属中大医院化学发光实验室进行测定。
(4)于治疗第二周结束时取空腹血测定糖化血清蛋白含量。糖化血清蛋白含量测定采用糖化血清蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程有限公司)进行，最终数值在752分光光度计上读取。
(5)于治疗第二周结束时取小鼠肝脏、肾脏及胰腺进行HE染色分析病变情况，病变分析工作在东南大学附属铁道医学院病理系进行。
序列表
<110>中国药科大学
<120>一种双功能蛋白及其衍生物的结构及用途
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Gly，Ser，Val或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝Leu，Ser，Val，Gly或Ala
<220>
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<222>(12)..(12)
<223>Xaa＝Lys，Arg，Ala，Val或Gly
<220>
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<223>Xaa＝Met，Leu，Ala，Ile或Gly
<220>
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<222>(16)..(16)
<223>Xaa＝Glu，Gly，Ala，Asp或Gln
<220>
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<222>(17)..(17)
<223>Xaa＝Glu，Gly，Gln，Asp或Ala
<220>
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<222>(19)..(19)
<223>Xaa＝Val，Gly，Ala，Leu或Met
<220>
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<223>Xaa＝Lys，Arg，Gly，Leu或Ala
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<223>Xaa＝Leu，Glu，Gly，Asp或Ala
<220>
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<222>(27)..(27)
<223>Xaa＝Lys，Arg，Gly或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
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<222>(30)..(30)
<223>Xaa＝Gly，Lys，Arg或Ala
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<222>(31)..(31)
<223>Xaa＝Pro，Gly，Ser，Val，Ala或缺失
<220>
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<222>(32)..(32)
<223>Xaa＝Ser，Gly，Leu，Val，Ala或缺失
<220>
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<222>(33)..(33)
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<220>
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<222>(34)..(34)
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(39)..(39)
<223>Xaa＝Ser，Gly，Leu，Ala，Val或缺失
<400>1
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        35
<210>2
<211>138
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>Xaa＝Lys，Arg，Ala或Gly
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(42)..(42)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(62)..(62)
<223>Xaa＝Lys，Arg，Gly，Cys，Ala或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(65)..(65)
<223>Xaa＝Lys，Arg，Gly，Cys，Ala或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(70)..(70)
<223>Xaa＝Lys，Arg，Gly，Cys，Ala或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(71)..(71)
<223>Xaa＝Lys，Arg，Gly，Cys，Ala或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(73)..(73)
<223>Xaa＝Lys，Arg，Gly，Cys，Ala或Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(138)..(138)
<223>Xaa＝Lys，Gly，Ala，Cys或缺失
<400>2
Ala Tyr Val Tyr Arg Ser Ala Phe Ser Val Gly Leu Glu Thr Tyr Val
1               5                   10                  15
Thr Ile Pro Asn Met Pro Ile Arg Phe Thr Xaa Ile Phe Tyr Asn Gln
            20                  25                  30
Gln Asn His Tyr Asp Gly Ser Thr Gly Xaa Phe His Cys Asn Ile Pro
        35                  40                  45
Gly Leu Tyr Tyr Phe Ala Tyr His Ile Thr Val Tyr Met Xaa Asp Val
    50                  55                  60
Xaa Val Ser Leu Phe Xaa Xaa Asp Xaa Ala Met Leu Phe Thr Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Tyr Gln Glu Asn Asn Val Asp Gln Ala Ser Gly Ser Val Leu Leu
                85                  90                  95
His Leu Glu Val Gly Asp Gln Val Trp Leu Gln Val Tyr Gly Glu Gly
            100                 105                 110
Glu Arg Asn Gly Leu Tyr Ala Asp Asn Asp Asn Asp Ser Thr Phe Thr
        115                 120                 125
Gly Phe Leu Leu Tyr His Asp Thr Asn Xaa
    130                 135

Claims (4)

1.一种重组蛋白质，其特征在于其氨基酸序列为
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-lle-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Gly-Met-Gly-Ala-Tyr-Val-Tyr-Arg-Ser-Ala-Phe-Ser-Val-Gly-Leu-Glu-Thr-Tyr-Val-Thr-Ile-Pro-Asn-Met-Pro-Ile-Arg-Phe-Thr-Lys-lle-Phe-Tyr-Asn-Gln-Gln-Asn-His-Tyr-Asp-Gly-Ser-Thr-Gly-Lys-Phe-His-Cys-Asn-lle-Pro-Gly-Leu-Tyr-Tyr-Phe-Ala-Tyr-His-Ile-Thr-Val-Tyr-Met-Lys-Asp-Val-Lys-Val-Ser-Leu-Phe-Lys-Lys-Asp-Lys-Ala-Met-Leu-Phe-Thr-Tyr-Asp-Gln-Tyr-Gln-Glu-Asn-Asn-Val-Asp-Gln-Ala-Ser-Gly-Ser-Val-Leu-Leu-His-Leu-Glu-Val-Gly-Asp-Gln-Val-Trp-Leu-Gln-Val-Tyr-Gly-Glu-Gly-Glu-Arg-Asn-Gly-Leu-Tyr-Ala-Asp-Asn-Asp-Asn-Asp-Ser-Thr-Phe-Thr-Gly-Phe-Leu-Leu-Tyr-His-Asp-Thr-Asn。
2.根据权利要求1所述重组蛋白质与聚乙二醇的共价结合物，该共价结合物连接有至少1个聚乙二醇分子，其中所述聚乙二醇分子连接到所述蛋白质的Cys、Lys或His氨基酸上，并且其中所述聚乙二醇的分子量范围在2000到60000道尔顿。
3.权利要求1所述的重组蛋白质的用于制备治疗糖尿病、糖尿病并发动脉粥样硬化、糖尿病并发肥胖症、糖尿病并发老年痴呆症或糖尿病并发心肌梗塞的疾病的药物的用途。
4.权利要求2所述的重组蛋白质与聚乙二醇的共价结合物的用于制备治疗制备治疗糖尿病、糖尿病并发动脉粥样硬化、糖尿病并发肥胖症、糖尿病并发老年痴呆症或糖尿病并发心肌梗塞的疾病的药物的用途。
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