KR102642551B1 - 에리스로포이에틴 유래 펩티드를 포집한 발모 촉진용 리포좀, 이를 포함하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물 - Google Patents
에리스로포이에틴 유래 펩티드를 포집한 발모 촉진용 리포좀, 이를 포함하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명에 따른 에리스로포이에틴 유래 펩티드를 포집한 리포좀은 모유두세포의 성장을 촉진시키고, 모유두세포의 혈관내피 성장인자의 발현을 촉진시키며, 모낭주기 조절능 활성을 높일 수 있으므로, 상기 리포좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 탈모 방지 또는 발모 촉진, 또는 모발 건강 증진이 향상시킬 수 있다.
Description
본 발명은 에리스로포이에틴 유래 펩티드를 봉입한 안정한 발모 촉진용 리포좀, 그를 이용하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물에 관한 것이다.
모발은 일정한 모주기(hair cycle)를 거치게 되며, 모유두(dermal papilla)의 자극을 받은 모모세포 (keratinocyte)가 활발히 분열·증식하여 모발이 자라는 성장기(anagen), 모구(hair bulb)에 혈액공급이 끊기고 모유두가 모낭으로부터 분리되는 퇴행기(catagen) 및 세포 증식이 멈춰 모발이 성장하지 않는 휴지기(telogen)를 거쳐 다시 성장기로 들어가거나 모발이 두피로부터 빠지는 탈락기(exogen)로 가게 된다.
사람의 모발은 각각 독립된 성장주기를 가져 일부는 탈락기로, 일부는 성장기로 들어가며 전체적으로 동일 수준의 모발수를 유지하게 되는데, 일반적으로 탈모 현상이라 함은 모발이 휴지기 상태에서 빠지는 일반적인 휴지기 탈모 현상과 비정상적인 탈모 현상인 생장기 탈모 현상으로 구별할 수 있는데, 특히 후자를 탈모증이라 일컫는다.
탈모의 원인은 아직까지 명확히 밝혀지지 않았으나 유전적인 원인이 크게 자리하고 있으며, 두피 내 혈액 순환불량, 남성 호르몬의 과잉 작용, 피지 분비 과잉, 노화, 스트레스 등에 의해서도 발생하는 것으로 알려져 있다.
일반적인 탈모증 치료방법에는 대표적인 탈모 치료약으로 알려진 미녹시딜, 프로페시아, 아보다트와 같은 약물 치료법 등의 탈모 방지 및 발모제 와 타인의 모발을 이식받는 모발 이식법 등이 개발되고 있으나, 대부분의 양모제들은 탈모 방지에는 어느 정도의 효과를 나타내지만 발모와 관련된 효과는 그리 만족할 만한 것이 아니다.
대한민국 등록특허공보 제10-1467568호에는 미녹시딜, 피부연화제 및 피부저류제를 필수적으로 함유하는 조성물의 발모 효과가 기재되어 있으나, 종래기술은 어떠한 유효성분으로 인하여 발모 효과가 발휘되는지 여부를 예측하지 못하고 있다. 그 외 프로페시아나 아보다트 등은 원래 전립선비대증의 치료약물로 알려져 있었으나, 발모 효과 또한 입증되어 시판된 약물로서 효능은 뛰어나지만 남성에게는 발기부전증, 여성에게는 불임 등의 부작용이 보고되고 있다.
따라서, 상기 언급된 탈모 치료제는 충분하지 않은 효과나 부작용 등으로 인해 보다 효과적이고 안전한 탈모 치료 또는 육모를 위한 약물의 개발이 필요한 실정이다.
한편, 피부를 통한 흡수경로는 각질층을 통한 흡수, 모낭과 피지선을 통한 흡수, 에크린한선을 통한 흡수 등의 3가지 경로가 있으며, 그 중 각질층을 통한 흡수가 가장 중요한 흡수 경로로 알려져 있다. 각질층은 각질세포 간격이 비극성 지질로 이루어져 있어 극성 물질의 경우 세포질이나 간극(Interstices) 내의 단백질부분과 수소결합 등의 방법으로 결합이 되어 피부를 통해 흡수되지 못한다. 때문에 극성 물질은 거의 흡수가 되지 않고 친유성(Lipophilic) 물질은 흡수가 될 수가 있다.
경피 흡수의 가장 큰 장벽은 전술한 바와 같이 각질층내의 각질세포와 이들 사이의 각질 세포간 지질이다. 대부분의 유효 성분은 피부 각질층의 저항성 때문에 경피 투과율이 낮아지므로 이를 극복하고 유효성분의 투과를 촉진시킬 수 있는 다양한 방법이 필요하다. 에탄올, 프로필렌글리콜, 계면활성제, 지방산류 등과 친지성 물질의 혼합은 필요한 속도와 유효 농도로 성분을 경피 전달하는 매우 효과적인 방법이다.
효과가 탁월한 성분이라도 친수성 유효성분은 나노 크기화 외 친수성의 특성을 친유성화 하여야만 피부침투가 극대화되므로 나노 사이즈의 액정을 만들 수 있는 나노기술이 기능성을 표방하는 화장품에도 필수적으로 요구되는 기술로 대두되고 있다.
또한, 유효 성분을 레시틴이나 피부 세포간 지질 성분 등으로 만든 리포좀 사용은 훨씬 더 효과적인 경피 흡수 방법이다(공개특허 10-2001-0083712). 피부에서의 약물의 투과의 한 수단으로 70년대부터 부각되기 시작한 것은 리포좀 제제이며, 코티코스테로이드(corticosteroid)와 베타메타손(betamethasone)의 경우 일반 에멀젼 제형에 비해 피부 투과가 효과적으로 이루어지는 것을 관찰하였다(Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1994;11(2-3):97-118).
리포좀은 여러 약물의 운반체로서 기능성 화장품의 원료로 활용되는 천연 생리활성 성분들을 피부세포 내에 안정하게 흡수시키는 데 유효하게 이용되고 있다. 비록 그 제형으로서의 안정성에 대한 문제점 또한 많이 대두되고 있으나 리포좀의 제형은 유용한 미용성분을 담을 수 있는 캡슐레이션의 한 개념으로서 아직까지도 미백, 주름방지, 항노화의 효능을 위한 천연성분들을 비교적 안정하게 피부에 전달시키는 매개체로서 각광받고 있으며 현재 나노화장품 제형과 접목된 형태로도 계속 연구되고 있다.
종래기술로서 특허문헌 1은 펩티드를 적용하는데 위험성 및 직접적인 효능 검증이 부족하고, 특허문헌 2는 단순히 리포좀을 이용한 화장료 조성물에 관한 것에 불과하고, 특허문헌 3은 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 배양물을 포함하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물에 관한 것이다.
Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1994;11(2-3):97-118
본 발명은 모유두세포의 성장을 촉진시키고, 모유두세포의 혈관내피 성장인자의 발현을 촉진시키며, 모낭주기 조절능 활성을 높일 수 있는 에리스로포이에틴 유래 펩티드를 포집한 리포좀을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 리포좀을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물, 또는 모발 건강 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 에리스로포이에틴 유래 펩티드를 포집한 리포좀을 제공하는 것이 바람직하다.
상기 에리스로포이에틴 유래 펩티드가 아래 염기서열을 포함하는 것이 바람직하다: (염기서열) Leu His Val Leu Lys Ala Val Ser Gly Leu Leu Thr Leu Thr Met Ile Arg Arg Ala
상기 리포좀이 에리스로포이에틴 유래 펩티드 보다 높은 인간모유두 세포의 증식 효과를 갖는 것이 바람직하다.
상기 리포좀이 모낭주기 조절관련 유전자인 Wnt10b, β-catenin 및 Noggin의 발현을 증가시키는 것이 바람직하다.
상기 리포좀이 혈관내피성장인자(VEGF) 및 인슐린 유사 성장인자(IGF-1) 중 하나 이상의 발현을 증가시키는 것이 바람직하다.
상기 리포좀이 에리스로포이에틴 유래 펩티드 보다 높은 혈관내피 성장인자 또는 인슐린 유사 성장인자 또는 모두의 증가 효과를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구체예로서, 본 발명은 상기 리포좀을 포함하는 모발 성장유도 및 성장주기 조절용 조성물을 제공하는 것이 바람직하다.
상기 모발 성장유도 및 성장주기 조절용 조성물은 저장안정성이 우수한 것이 바람직하다.
상기 모발 성장유도 및 성장주기 조절용 조성물 중 상기 리포좀 농도가 0.03~0.1중량%인 것이 바람직하다.
상기 모발 성장유도 및 성장주기 조절용 조성물은 탈모 방지 또는 모발 재생의 촉진 효과를 갖는 것이 바람직하다.
상기 탈모는 안드로겐성 탈모, 휴지기 탈모, 약제성 탈모, 기계적 탈모, 외상성 탈모, 압박성 탈모, 생장기 탈모, 비강성 탈모, 매독성 탈모, 지루 탈모, 증후성 탈모, 반흔성 탈모, 선천성 탈모, 원형 탈모, 머리 백선, 전두 탈모, 감모증, 유전성 단순 감모증 및 전신 탈모로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
상기 조성물이 에어로졸, 액체, 용액, 젤, 페이스트, 크림, 연고, 폼 및 분말 중 어느 하나의 제형으로 되는 것이 바람직하다.
상기 조성물이 팩, 밴드 또는 패치 중 어느 하나에 포함되는 것이 바람직하다.
상기 팩은 국소형 패치, 시트타입, 거즈타입, 크림타입 및 젤타입 중 어느 하나인 것이 보다 바람직하다.
상기 조성물이 약학적 조성물 또는 화장료 조성물 중 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 화장료 조성물이 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이를 포함하는 군에서 선택되는 제형인 것이 바람직하다.
상기 약학적 조성물이 정제, 캅셀제, 주사제, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제를 포함하는 군에서 선택되는 제형인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 에리스로포이에틴 유래 펩티드를 포집한 리포좀 베이스는 모유두세포의 성장을 촉진시키고, 모유두세포의 혈관내피 성장인자의 발현을 촉진시키며, 모낭주기 조절능 활성을 높일 수 있으므로, 상기 리포좀 베이스를 유효성분으로 포함하는 조성물은 탈모 방지 또는 발모 촉진, 또는 모발 건강 증진이 향상시킬 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 펩티드가 포집된 리포좀의 입도분포도와 그를 시각화한 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 2은 실시예 2에 따른 펩티드가 포집된 리포좀의 인간 모유두세포의 성장을 촉진시키는 효능을 개략적으로 도시한 것이다.
도 3a 내지 도 3c는 실시예 2에 따른 펩티드가 포집된 리포좀의 인간 모유두세포의 모낭주기조절과 관련된 유전자 발현 수준을 촉진시키는 효능을 개략적으로 도시한 것이다.
도 4는 실시예 2에 따른 펩티드가 포집된 리포좀이 세포 내 수준에서 모발성장과 관련 성장인자인 VEGF을 촉진시키는 효능을 개략적으로 도시한 것이다.
도 5은 실시예 2에 따른 펩티드가 포집된 리포좀이 모발성장과 관련 성장인자인 VEGF을 단백질 수준에서 촉진시키는 효능을 개략적으로 도시한 것이다.
도 6은 실시예 2에 따른 펩티드가 포집된 리포좀이 모발성장과 관련 성장인자인 IGF을 촉진시키는 효능을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2은 실시예 2에 따른 펩티드가 포집된 리포좀의 인간 모유두세포의 성장을 촉진시키는 효능을 개략적으로 도시한 것이다.
도 3a 내지 도 3c는 실시예 2에 따른 펩티드가 포집된 리포좀의 인간 모유두세포의 모낭주기조절과 관련된 유전자 발현 수준을 촉진시키는 효능을 개략적으로 도시한 것이다.
도 4는 실시예 2에 따른 펩티드가 포집된 리포좀이 세포 내 수준에서 모발성장과 관련 성장인자인 VEGF을 촉진시키는 효능을 개략적으로 도시한 것이다.
도 5은 실시예 2에 따른 펩티드가 포집된 리포좀이 모발성장과 관련 성장인자인 VEGF을 단백질 수준에서 촉진시키는 효능을 개략적으로 도시한 것이다.
도 6은 실시예 2에 따른 펩티드가 포집된 리포좀이 모발성장과 관련 성장인자인 IGF을 촉진시키는 효능을 개략적으로 도시한 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태를 들어 상세히 설명한다. 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 단계가 다른 단계와 “상에” 또는 “전에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 단계가 다른 단계와 직접적 시계열적인 관계에 있는 경우뿐만 아니라, 각 단계 후의 혼합하는 단계와 같이 두 단계의 순서에 시계열적 순서가 바뀔 수 있는 간접적 시계열적 관계에 있는 경우와 동일한 권리를 포함할 수 있다.
본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용 오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
본 발명은 에리스로포이에틴 유래 펩티드를 포집한 리포좀을 제공하는 것이 바람직하다. 상기 에리스로포이에틴 유래 펩티드를 리포좀내에 포집하는 방법은 본 발명의 범위 내에서 당업자에게 자명한 다른 방법을 사용할 수도 있다.
상기 에리스로포이에틴 유래 펩티드가 아래 염기서열을 포함하는 것이 바람직하다(한국 특허공개번호 제10-2021-0123838호 참조): (염기서열) Leu His Val Leu Lys Ala Val Ser Gly Leu Leu Thr Leu Thr Met Ile Arg Arg Ala
상기 리포좀은 에리스로포이에틴 유래 펩티드 보다 높은 인간모유두 세포의 증식 효과를 갖는 것이 바람직하다.
상기 리포좀은 모낭주기 조절관련 유전자인 Wnt10b, β-catenin 및 Noggin의 발현을 증가시키는 것이 바람직하다.
상기 리포좀은 에리스로포이에틴 유래 펩티드 보다 높은 혈관내피 성장인자의 증가 효과를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구체예로서, 본 발명은 상기 리포좀을 포함하는 모발 성장유도 및 성장주기 조절용 조성물을 제공하는 것이 바람직하다.
상기 모발 성장유도 및 성장주기 조절용 조성물은 저장안정성이 우수한 것이 바람직하다.
상기 모발 성장유도 및 성장주기 조절용 조성물 중 상기 리포좀 농도는 0.01~0.5중량%, 바람직하게는 0.03~0.1중량%이다. 상기 리포좀 농도가 0.03중량% 미만이면 유의미한 효과를 기대하기 어렵고, 0.1중량% 이상이면 함유량에 비해 효과가 미미하여 경제적으로 바람직하지 않다.
상기 모발 성장유도 및 성장주기 조절용 조성물은 탈모 방지 또는 모발 재생의 촉진 효과를 갖는 것이 바람직하다.
상기 탈모는 안드로겐성 탈모, 휴지기 탈모, 약제성 탈모, 기계적 탈모, 외상성 탈모, 압박성 탈모, 생장기 탈모, 비강성 탈모, 매독성 탈모, 지루 탈모, 증후성 탈모, 반흔성 탈모, 선천성 탈모, 원형 탈모, 머리 백선, 전두 탈모, 감모증, 유전성 단순 감모증 및 전신 탈모로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 조성물은 에어로졸, 액체, 용액, 젤, 페이스트, 크림, 연고, 폼 및 분말 중 어느 하나의 제형으로 가능하며, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 로션은 용액과 유사하지만 용액보다 더 진하고 본질적으로 더 완화시키는 경향이 있다. 로션에는 일반적으로 물과 오일이 혼합되어 있으며 용액보다 알코올이 적은 경우가 많다.
예를 들어, 크림은 거의 같은 비율의 오일과 물의 에멀젼을 가지고 있다. 피부의 각질층 외층까지 잘 침투한다. 크림은 로션보다 두껍고 용기에서 꺼낼 때 모양이 유지된다.
또한, 본 발명의 조성물은 팩, 밴드 또는 패치 중 어느 하나에 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 팩은 국소형 패치, 시트타입, 거즈타입, 크림타입 및 젤타입 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
상기 팩은 마스크팩, 손팩, 발팩, 종아리팩, 헤어팩, 허벅지팩, 복부팩, 옆구리팩, 팔뚝팩, 턱팩 및 목팩 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물 또는 화장료 조성물 중 어느 하나에 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명에서의 약학적 조성물은 정제, 캅셀제, 주사제, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제 등을 포함하는 군에서 선택되는 제형일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 제제시에 통상적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 점막 투여 및 점안 투여, 국소투여 등의 방식으로 투여할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 섭취 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.0001-100 ㎎/kg(체중)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 추가될 수 있는 적합한 성분의 선택은, 당업자에게 자명한 범위에서, 본 발명의 피부 외용제 조성물이 용액, 로션, 림, 연고, 겔, 폼 또는 경피 패치로 제형화 되는지 여부에 어느 정도 의존할 것이다.
예를 들어, 착색제(색소), 착향제(향료), 현탁화제, 유화제, 용해보조제, 안정제, 등장제, pH조절제, 점도조절제, 용제 등을 포함할 수 있다. 화장료 조성물에 통상적으로 부가되는 성분이나 함량 등은 당업자에게 자명할 것이다.
한편, 본 발명의 화장료 조성물은 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이 등을 포함하는 군에서 선택되는 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 실시예 또는 실험예를 통해 예시적으로 보다 상세히 설명하고자 한다.
(실시예 1) 펩티드 합성
고체상 펩티드 합성(Solid Phase Peptide Synthesis) 기술에 따라 하기 표 1의 서열에 따라 단량체로 합성되었으며, 순도의 측정은 고성능 액체크로마토그래피(SHIMADZU prominence HPLC) 분석에 의해 수행되었다. (peptron, Daejeon, Korea). 구체적으로, 천연 에리스로포이에틴 수용체의 타겟 지역(site 2)의 서열 중 중요한 아미노산 서열(Arg103, Ser104, Leu105, Leu108 및 Arg110)에 결합할 수 있는 에리스로포이에틴 유래 펩티드를 합성하였다.
서열 (PN131497, MLP-H amino acid peptide) | Purity |
Leu His Val Leu Lys Ala Val Ser Gly Leu Leu Thr Leu Thr Met Ile Arg Arg Ala | > 95% |
(실시예 2) 펩티드가 포집된 리포좀의 제조
하기 표 2의 성분을 혼합하여 고압유화작업을 통해 비교예 1~2와 실시예 2의 구조체를 제조하였다. 비교예 2의 경우, 정제수에 중량비로 제조하였다.
성분 | 비교예1 | 비교예2 | 실시예2 |
실시예 1의 펩티드 (100 μM) | 0 | 1 | 1 |
Lecithin (Soya SPL 75H) | 1.5 | 0 | 1.5 |
GTCC | 3 | 0 | 3 |
Butylene glycol | 15 | 0 | 15 |
Pentylene Glycol | 2 | 0 | 2 |
DiPropylene Glycol | 3 | 0 | 3 |
Ethylexylglycerin | 0.05 | 0 | 0.05 |
정제수 | 75.45 | 99 | 74.45 |
(실험예 1) 리포좀의 입자 특성 분석
(실험예 1-1) 리포좀 크기 분석
실시예 2에서 제조한 리포좀의 크기 분포와 입자 수를 정량적 값으로 확인하기 위하여 광산란과 브라운 운동의 속성을 모두 활용하여 측정하는 Malvern (NS300) 모델장비를 이용하여 분석하였다. 나노입자추적분석기(Nano Tracking Analyzer)를 이용하여 리포좀 크기 분석 검증한 결과는 아래 표 3과 같으며, 도 1과 표 3에서 확인한 바와 같이, 구의 형태로 잘 형성되었으며, 입자의 평균 직경이 비교예 1은 109.2 nm이고 실시예 2는 106.4 nm로 확인되었다.
구분 | 비교예 1 | 실시예 2 |
입자의 평균 직경 | 109.2 nm | 106.4 nm |
(실험예 1-2) 제타 전위 측정
콜로이드 분산 안정성의 지표로 사용되는 제타 전위 측정하기 위해 전기영동 광산란 원리로 측정하는 Malvern (ZSP) 모델장비를 이용하여 분석하였다. 제타전위입도분석기(Zetapotential Particle size Analyzer)를 이용하여 측정된 표면 전하 분석 수치는 하기 표 4와 같이 비교예 1은 -39.9 mV이고, 실시예 2는 -39.2 mV로서, 보통의 전위 수치로 평균 -39~42 mV의 보통 및 안정한 범위에 속함에 따라, 기존제형 리포좀에 펩티드를 포집하여도 안정한 것으로 확인된다.
구분 | 비교예 1 | 실시예 2 |
제타포텐셜 | -39.9 mV | -39.2 mV |
(실험예 2) 리포좀 제형의 안정성 평가
(실험예 2-1) 냉동-해동 교차 조건 안정성 테스트
보관 조건인 냉동/해동 조건에서의 안정성을 확인하기 위해, 상기 실시예 2를 통해 제조된 펩티드가 포집된 리포좀의 제형 원액을 -20℃와 실온(25~30℃에서 교차 보관하며 색 변화, 탁도 변화, 침전 생성 유무를 확인하였다. 아래 표 5와 같이 총 3회 교차 보관을 시행하였고, 보관 조건 모두에서 색 변화 탁도 변화, 침전 생성 유무에 변함이 없음을 확인하였다.
보관조건 및 보관 횟수 | 1차 | 2차 | 3차 |
냉동 (-20℃) | + | + | + |
해동 (실온) | + | + | + |
(+: 안정, ±: 약간불안정, -: 불안정)
(실험예 2-2) 가속시험 테스트
상기 실시예 2를 통해 제조된 펩티드가 포집된 리포좀을 총 1개월간 장기보존시험 지정저장온도 보다 15℃이상 높은 온도인 40±2℃로 유지하며 색 변화, 탁도 변화, 침전 생성 유무를 확인하였다. 아래 표 6과 같이 1개월간 관찰한 결과, 색 변화, 탁도 변화, 침전 생성 유무에서 변함이 없음을 확인하였다.
보관조건 | 기간 | ||||
0주 | 1주 | 2주 | 3주 | 4주 | |
40±2℃ | + | + | + | + | + |
(+: 안정, ±: 약간불안정, -: 불안정)
(실험예 2-3) 광선안정성 테스트
상기 실시예 2를 통해 제조된 펩티드가 포집된 리포좀을 총 1개월간 직사광선 상에서 색 변화, 탁도 변화, 침전 생성 유무를 확인하였다. 보관 당시 온도는 25~30℃로 유지하였다. 아래 표 7과 같이 1개월간 관찰한 결과, 색 변화, 탁도 변화, 침전 생성 유무에서 변함이 없음을 확인하였다.
보관조건 | 기간 | ||||
0주 | 1주 | 2주 | 3주 | 4주 | |
광선 상 실온 | + | + | + | + | + |
(+: 안정, ±: 약간불안정, -: 불안정)
(실험예 2-4) 장기안정성 테스트
상기 실시예 2를 통해 제조된 펩티드가 포집된 리포좀을 총 1개월간 상온에서 보관하며 색 변화, 탁도 변화, 침전 생성 유무를 확인하였다. 보관 당시 온도는 25~30℃로 유지하였다. 아래 표 8에 개시된 바와 같이, 1개월간 관찰한 결과, 색 변화, 탁도 변화, 침전 생성 유무에서 변함이 없음을 확인하였다.
보관조건 | 기간 | ||||
0주 | 1주 | 2주 | 3주 | 4주 | |
실온 | + | + | + | + | + |
(+: 안정, ±: 약간불안정, -: 불안정)
(실험예 2-5) 장기보관후 분산안정도 테스트
상기 실시예 2를 통해 제조된 펩티드가 포집된 리포좀을 총 1개월간 상온에서 보관한 후, 콜로이드 분산 안정성의 지표로 사용되는 제타 전위 측정하기 위해 전기영동 광산란 원리로 측정하는 Malvern (ZSP) 모델장비를 이용하여 초기 및 1개월 후의 제타전위를 측정하였다. 아래 표 9와 같이 실시예 2가 1개월 후에도 -41.9 mV 수치를 나타났으며, 이는 콜로이드 분산 안정된 범위에 속함에 따라 안정하게 리포좀이 분산되고 있는 것을 확인하였다.
구분 | 비교예 1 | 실시예 2 |
제타포텐셜 | -39.2 mV | -41.9 mV |
(실험예 3) 리포좀 제형의 안전성 평가
상기 실시예 2를 통해 제조된 펩티드가 포집된 리포좀의 피부안전성 테스트를 위해 피부 첩포 평가를 실시하였다. 상세하게는 Finn chamber에 paper disc를 올리고 충분히 적셔지도록 시료를 20 ㎕씩 분주하여 건강한 성인 5 명을 대상으로 팔 안쪽 부위에 Finn chamber를 이용하여 24시간 동안 시료를 첩포하였다. 첩포 제거 직후, 첩포 제거 1 시간 후 및 24 시간 후의 자극을 확인하였다. 아래 표 10은 피부반응증상에 따른 피부첩포 평가 기준이다.
기호 | 점수 | 피부반응 증상 |
- | 0 | Negative reaction : 무반응 |
± | 0.5 | Doubtful or Slight reaction : 희미한 또는 가까스로 감지할 수 있는 가벼운 홍반 |
+ | 10 | Weak (non-vesicular) positive reaction : 경계가 뚜렷하나, 약한 홍반, 부종 및 구진 |
++ | 2.0 | Strong(vesicular) positive reaction : 뚜렷한 홍반, 구진 및 소수포 |
그 결과, 아래 표 11의 결과와 같이, 펩티드가 포집된 리포좀의 피부에 대한 자극이 없는 것으로 확인되었다.
시료 | 피시험자 | 판정결과 | 자극도 | ||
첩포 제거 직후 | 첩포 제거 1시간 후 | 첩포 제거 24시간 후 | |||
실시예 2 | 1 | - | - | - | 0 |
2 | - | - | - | 0 | |
3 | - | - | - | 0 | |
4 | - | - | - | 0 | |
5 | - | - | - | 0 |
(실험예 4) 인간모유두세포의 증식 촉진 효과 확인
모유두세포는 주변 세포와의 상호작용을 통해 모발의 형성과 성장에 중추세포로 작용하며, 모유두세포의 증식 효능을 통해 육모효능을 확인할 수 있다. 이에 펩티드가 포집된 리포좀의 인간모유두세포의 증식 효능을 통한 육모효능을 확인하기 위해 다음과 같이 실시하였다.
96웰 플레이트에 각각 배양한 모유두세포를 실시예 2와 비교예 1을 모유두세포에 농도별로 처리하고 3일간 배양하였다. CCK-8 solution을 처리하여 세포를 450 nm에서 측정하였으며, 동시에 아무 처리하지 않은 음성 대조군과 단독 펩티드인 비교예 2를 처리하여 세포생존능 비교 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 2과 같이 단일 펩티드 및 음성대조군과 펩티드가 미포함된 리포좀을 비교하였을 때, 펩티드가 포집된 리포좀에서 인간모유두세포의 증식 효과가 나타났다. 이는 단일 리포좀에 의해 증식효능이 나타난 것이 아니며, 단일 펩티드 처리보다 높은 증식을 나타냄에 따라 펩티드가 포집된 리포좀이 세포 성장에 도움을 주는 것을 확인할 수 있었다.
(실험예 5) 인간모유두세포의 모낭주기 조절능 활성 평가
모낭의 형성을 촉진하기 위해 휴지기 중 세포의 신호에 의해 새로운 모낭을 형성하는 성장기가 시작되거나 모발 주기 중 성장기 동안 발현하는 유전자들을 유지하고 활성화시키는지 확인하기 위해 상기 실시예 2의 방법에 따라 제조된 펩티드가 포집된 리포좀에 대하여 인간 모유두세포의 모낭주기 조절능을 나타내는지 검증하고자 하였다.
6웰 플레이트에서 배양된 모유두세포에 상기 실시예 2과 비교예 1을 농도 별로 처리하고, 비교예 2를 처리하여 배양된 세포를 24시간 후에 total RNA를 분리하였다. 상기 분리된 RNA를 주형으로 Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher)를 이용해 cDNA를 합성하였다. 이후 PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix(Takara Bio)를 이용해 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 3a 내지 도 3c에 도시된 바와 같이, 미처리군과 펩티드가 미포함된 리포좀과 비교하여 펩티드가 포집된 리포좀을 처리한 모유두세포에서 모낭주기 조절관련 유전자인 Wnt10b, β-catenin, Noggin의 3종의 발현양상이 증가한 것을 확인하였다. 이를 통해 유전자 수준에서 휴지기 상태의 모발 주기를 성장기로 유도하는 활성이 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
(실험예 6) 인간모유두세포의 혈관내피성장인자(VEGF)의 발현 증가 효과 확인
모낭에서 발현되는 성장인자 중 하나인 VEGF는 모발성장유도와 모발 성장주기의 중요한 조절인자로서 작용한다. 실시예 2에 따른 펩티드가 포집된 리포좀이 혈관내피성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해, 인간 모유두세포에 상기 실시예 2와 비교예 1 및 2를 처리한 후, 혈관내피성장인자의 발현 정도를 ELISA kit (VEGF ; R&D systems)로 측정하여 확인하였다.
6웰 플레이트에서 배양된 모유두세포에 상기 실시예 2과 비교예 1을 농도별로 처리하고 비교예 2를 처리하여 24시간 후에 배양된 실험군의 배양액을 수거하여, ELISA kit (VEGF ; R&D systems)를 이용하여 선별된 VEGF와 bFGF의 농도를 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다.
배양액이 수거된 세포로부터 24시간 후에 total RNA를 분리하였다. 상기 분리된 RNA를 주형으로 Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher)를 이용해 cDNA를 합성하였다. 이후 PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix (Takara Bio)를 이용해 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 4와 도 5에서 확인하는 바와 같이, 펩티드 및 펩티드가 미포함된 리포좀을 처리하여 배양했을 때보다, 펩티드가 포집된 리포좀을 처리하여 획득된 배양액에서 VEGF 함량이 높게 나타나는 것으로 확인되었으며, 세포 수준에서의 VEGF 발현도 촉진되는 것으로 확인되었다. 결국, 발모 촉진 및 탈모방지에 유용한 사이토카인이 세포내에서 발현이 촉진되고, 사이토카인 분비가 증가가 두드러짐에 따라 유전자 수준 및 단백질 수준에서 모발성장유도와 모발 성장주기가 조절되는 것을 확인할 수 있다.
(실험예 7) 인간모유두세포의 인슐린유사성장인자-1 (IGF-1)의 발현 증가 효과 확인
모낭에서 발현되는 성장인자 중 하나인 인슐린 유사 성장인자(IGF-1, Insulinlike Growth Factor)는 각각 모낭과 모발의 형성을 촉진하며, 모낭의 성장을 조절하고, 모발의 성장기 유지에 기여하며, 정상적인 성장 주기로 컨트롤 한다. 실시예 2에 따른 펩티드가 포집된 리포좀이 인슐린 유사 성장인자 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해, 인간 모유두세포에 상기 실시예 2와 비교예 1 및 2를 처리한 후, 인슐린 유사 성장인자의 발현 정도를 qPCR로 확인하였다
6웰 플레이트에서 배양된 모유두세포에 상기 실시예 2과 비교예 1을 농도 별로 처리하고, 비교예 2를 처리하여 배양된 세포를 24시간 후에 total RNA를 분리하였다. 상기 분리된 RNA를 주형으로 Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher)를 이용해 cDNA를 합성하였다. 이후 PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix(Takara Bio)를 이용해 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, 미처리군과 펩티드가 미포함된 리포좀과 단일 펩티드와 비교하여 펩티드가 포집된 리포좀을 처리한 모유두세포에서 인슐린유사성장인자-1 (IGF-1)의 발현양상이 증가한 것을 확인하였다. 이를 통해 유전자 수준에서 휴지기 상태의 모발 주기를 성장기로 유도하는 활성이 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
Claims (18)
- 아래 염기서열을 포함하는 에리스로포이에틴 유래 펩티드를,
고압유화작업으로 제조하여 얻어진 105~107 nm 크기의 리포좀을 0.01~0.5중량%로 포함하여,
Wnt10b, β-catenin 및 Noggin의 발현을 증가시키는 모낭주기 조절용 조성물로서,
상기 리포좀이 레시틴, GTCC(글리시딜트리메틸암모늄키토산 클로라이드), Ethylhexylglycerin 및 글리콜을 포함하는, 모낭주기 조절용 조성물:
(염기서열) Leu His Val Leu Lys Ala Val Ser Gly Leu Leu Thr Leu Thr Met Ile Arg Arg Ala - 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 에리스로포이에틴 유래 펩티드 보다 높은 인간모유두 세포의 증식 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 모낭주기 조절용 조성물.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 혈관내피성장인자(VEGF) 및 인슐린 유사 성장인자(IGF-1) 중 하나 이상의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 모낭주기 조절용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 에리스로포이에틴 유래 펩티드 보다 높은 혈관내피 성장인자 또는 인슐린 유사 성장인자 또는 모두의 증가 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 모낭주기 조절용 조성물.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 저장안정성이 우수한 것을 특징으로 하는 모낭주기 조절용 조성물.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 탈모 방지 또는 모발 재생의 촉진 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 모낭주기 조절용 조성물.
- 제 10 항에 있어서, 상기 탈모는 안드로겐성 탈모, 휴지기 탈모, 약제성 탈모, 기계적 탈모, 외상성 탈모, 압박성 탈모, 생장기 탈모, 비강성 탈모, 매독성 탈모, 지루 탈모, 증후성 탈모, 반흔성 탈모, 선천성 탈모, 원형 탈모, 머리 백선, 전두 탈모, 감모증, 유전성 단순 감모증 및 전신 탈모로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 모낭주기 조절용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 에어로졸, 액체, 용액, 젤, 페이스트, 크림, 연고, 폼 및 분말 중 어느 하나의 제형으로 되는 것을 특징으로 하는 모낭주기 조절용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 팩, 밴드 또는 패치 중 어느 하나에 포함되는 것을 특징으로 하는 모낭주기 조절용 조성물.
- 제 13 항에 있어서, 상기 팩이 국소형 패치, 시트타입, 거즈타입, 크림타입 및 젤타입 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 모낭주기 조절용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 모낭주기 조절용 조성물.
- 제 15 항에 있어서, 상기 화장료 조성물이 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이를 포함하는 군에서 선택되는 제형인 것을 특징으로 하는 모낭주기 조절용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 모낭주기 조절용 조성물.
- 제 17 항에 있어서, 상기 약학적 조성물이 정제, 캅셀제, 주사제, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제를 포함하는 군에서 선택되는 제형인 것을 특징으로 하는 모낭주기 조절용 조성물.
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KR1020230001470A KR102642551B1 (ko) | 2023-01-04 | 2023-01-04 | 에리스로포이에틴 유래 펩티드를 포집한 발모 촉진용 리포좀, 이를 포함하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물 |
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2023
- 2023-01-04 KR KR1020230001470A patent/KR102642551B1/ko active IP Right Grant
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Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1994;11(2-3):97-118 |
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