CN110759974A - 一种磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物，其制备方法及应用 - Google Patents

一种磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物，其制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110759974A
CN110759974A CN201810833188.6A CN201810833188A CN110759974A CN 110759974 A CN110759974 A CN 110759974A CN 201810833188 A CN201810833188 A CN 201810833188A CN 110759974 A CN110759974 A CN 110759974A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rvg
dspe
peg
rabies virus
derived peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810833188.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110759974B (zh
Inventor
黄伟
高钟镐
韩明峰
张哲明
陈丽青
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Materia Medica of CAMS
Original Assignee
Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Materia Medica of CAMS filed Critical Institute of Materia Medica of CAMS
Priority to CN201810833188.6A priority Critical patent/CN110759974B/zh
Publication of CN110759974A publication Critical patent/CN110759974A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110759974B publication Critical patent/CN110759974B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/407—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with other heterocyclic ring systems, e.g. ketorolac, physostigmine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

一种磷脂‑聚乙二醇‑狂犬病毒衍生肽聚合物，其制备方法及应用。本发明涉及实现血脑屏障穿透功能的磷脂‑聚乙二醇‑狂犬病毒衍生肽(DSPE‑PEG‑RVG‑15),通过RVG‑15与乙酰胆碱受体的相互作用介导入脑，可以作为药物递送载体，用于构建释药系统，实现载药入脑的目的。本发明通过自组装法构建了DSPE‑PEG‑RVG‑15/DOX纳米释药系统，制备方法较简单，经济，所得的纳米粒粒径较小，较均一，颗粒圆整，跨血脑屏障效率较高，毒性较小，具有较好的发展前景。

Description

一种磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物，其制备方法及 应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种多肽修饰的脑靶向化药递送系统及其应用，具体涉及一种对血脑屏障高穿透性狂犬病毒糖蛋白(Rabies virus glycoprotein,RVG)衍生肽与磷脂-聚乙二醇连接构成的脑靶向递送系统及其应用。
背景技术
脑是人体重要器官，是生命机能的调节器。脑部疾病已严重危害人类健康，脑部疾病种类繁多，发病机制复杂，且由于血脑屏障(blood brain barrier,BBB) 的存在，治疗难度较大。血脑屏障是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障，这些屏障能够阻止某些物质由血液进入脑组织。这种结构可使脑组织少受甚至不受循环血液中有害物质的损害，从而保持脑组织内环境的基本稳定，对维持中枢神经系统正常生理状态具有重要的生物学意义。但是BBB同时也可拒绝大部分的药物入脑，使得药物难以到达脑部病灶。为克服跨BBB难题，实现脑部疾病的有效治疗，目前已有报道的方法包括：脑部注射给药(如颅腔内给药)、动脉注射高渗物质暂时打开BBB、将水溶性药物制成脂溶性前药、主动靶向分子介导跨过BBB等。
二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)，作为科学研究中广泛使用的一种双亲性磷脂-PEG共轭物，含有亲水性PEG和疏水性DSPE。如此独特的 DSPE-PEG分子，可以作为辅助型材料用来表面功能化一系列的药物传递系统如基于磷脂的纳米粒子、基于聚合物的纳米粒子、基于无机材料的纳米粒子等。PEG 的引入可以降低免疫原性和抗原性，并可达到长循环的功能；DSPE用于作为纳米粒子的疏水性结构以便有效装载药物。
嵌段聚合物胶束是药剂学纳米体系研究的重要领域之一，近年来发展迅速。利用两亲型聚合物通过自组装方式形成纳米胶束，药物可以加载于内部疏水核心，也可加载于外部亲水层。
阿霉素(DOX)，具有较强的抗肿瘤作用，可以直接作用于DNA，插入DNA 的双螺旋链，使后者解开，改变DNA的模板性质，抑制DNA聚合酶从而既抑制 DNA合成，也抑制RNA合成。此外，阿霉素具形成超氧基自由基的功能，并有特殊破坏细胞膜结构和功能的作用，是一款经典的广谱抗癌药物。阿霉素的多种制剂临床应用于治疗急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、骨肉瘤及软组织肉瘤、肺癌等多种恶性肿瘤。但因其不能透过血脑屏障，其对脑胶质瘤的治疗作用不大。
主动靶向分子主要是能特异性地结合BBB上的受体或转运体一类分子。采用主动靶向分子修饰的给药系统可模拟BBB上的受体或转运体介导相应内源性的配体或底物跨过BBB转运的过程，此方法能够极大程度地降低脑部损伤，并且可以增加药物的脑部摄取效率。
狂犬病毒糖蛋白衍生的由29个氨基酸构成的多肽RVG-29是一种主动靶向分子，可特异性的与血脑屏障上的乙酰胆碱受体进行特异性结合，介导药物跨过血脑屏障，但由于29个氨基酸结构过长，对所形成的纳米颗粒粒径有一定影响。本课题组前期对狂犬病毒糖蛋白衍生肽结构及靶向效率进行考察，筛选出由15个氨基酸构成，脑靶向效率与RVG-29相当的狂犬病毒糖蛋白衍生肽片段。本课题组前期构建了以RVG-15为靶头修饰的脑靶向载体递送核酸入脑，用以治疗脑胶质瘤，体外实验与体内实验均得到较好效果(黄伟.一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽修饰的脑靶向核酸递送载体及其应用：中国，201710277357.8[P].2017-4-25.)。本发明将该狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG-15修饰聚乙二醇-磷脂，构建PE-PEG-RVG-15载药系统，可包载递送传统化药入脑，对那些体外有效但体内难以跨越BBB的药物入脑治疗脑部疾病提供了一个种新方法。
发明内容
本发明解决的技术问题是克服现有脑靶向给药系统的缺陷和不足，提供一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽修饰的脑靶向递送载体及其应用，为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种脑靶向载体磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物，其中狂犬病毒衍生肽(RVG-15)可通过n型乙酰胆碱受体介导跨血脑屏障，入脑效率与经典阳性对照药RVG-29相当，而长度缩短近一半，可大幅缩减合成成本，并有利于减小聚合物粒径。RVG-15的氨基酸序列如序列表1所示，所用的氨基酸可为D 型或L型，优选L型。聚乙二醇的聚合度n为5～450，优选8～230，进一步优选18～115，更优选25～55，进一步更优选30～50，最优选40～45，进一步最优选45。R为磷脂基。其中磷脂R可为自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)基、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺 (DPPE)基、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)基、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)基、二月桂酰磷脂酰乙醇胺中(DLPE)基。优选二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)基。
其中，R基的结构如下：
二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)基：
二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)基：
Figure BDA0001743194890000032
二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)基：
Figure BDA0001743194890000033
二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)基：
Figure BDA0001743194890000034
二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)基：
Figure BDA0001743194890000035
本发明中选用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，也可用二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)替代，反应条件与使用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)相同。
本发明中在DSPE-PEG末端引入马来酰亚胺基团(MAL)，RVG-15末端引入半胱氨酸(Cys)，二者可通过加成反应得到聚合物DSPE-PEG-RVG-15，反应如图 1示
优选的制备方法如下：
(1)取摩尔比略大于1：1的RVG-15-Cys和DSPE-PEG2000-MAL溶于pH为 8的Hepes，氮气保护下搅拌下常温反应16h。
(2)选用截留分子量为200-25000的透析袋进行透析，优选截留分子量为 12000的透析袋。去离子水中透析，透析时间为24h。
(3)液体冷冻干燥后得冻干粉备用，即得脑靶向复合物磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽(DSPE-PEG2000-RVG-15)。
本发明将PEG修饰的磷脂类聚合物与具有血脑屏障穿透性的狂犬病毒衍生肽相结合，制备了具有主动靶向作用的长循环载体材料，可以直接或者再经过其他途径用于药物载体、基因载体等用途。
本发明的再一个方面，提供了上述的磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物在作为体内、体外递送载体的应用。
在一个实施方案中，参照梁伟等人的文献(参见Yiguang Wang,et al,Pharmaceutical Research,Vol.27,No.2,February 2010)，用聚合物包载阿霉素，并进行粒径、透射电镜、包封率的测定。其方法步骤如下：
取DSPE-PEG2000-RVG-15于去离子水中，加入DSPE-PEG2000，恒温水浴，再加入阿霉素(DOX)，继续恒温水浴30min，即得DSPE-PEG2000-RVG-15/DOX胶束。其中优选DSPE-PEG2000-RVG-15与DSPE-PEG2000的质量比为1：5，1：10，1： 20，1：50；最优选为1：10。DSPE-PEG2000-RVG-15可通过搅拌、加热、超声助溶，优选超声助溶。DSPE-PEG2000-RVG-15与DSPE-PEG2000共恒温水浴温度可为 25℃，40℃，50℃和60℃，优选50℃，水浴时间优选30min。
本发明提供的磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物作为体外递送载体的应用，其方法和步骤如下：
(1)体外释放实验
将阿霉素胶束溶液转移至透析袋中，两端扎紧后置于10ml的相应pH值(5.0 和7.4)的等渗同pH的BS缓冲液中，以中国药典2015版四部溶出度测定法之第三法(小杯法)的装置和方法37℃恒温振荡，回旋速度为100rpm。定时取出0.5ml 释放介质，同时补充同温同体积新鲜释放介质。取出的释放介质离心(12000rpm， 10min)，取上清液应用高效液相色谱法测定盐酸阿霉素的累积含量。
(2)细胞增殖抑制
将材料冻干制剂用培养液稀释成预定浓度的溶液。每个浓度设6个复孔，并设对照组和调零组。将适量对数生长期的细胞接种于96孔板中，继续培养24h后，介质以含有不同药物浓度的新鲜培养液替换，分别继续培养24h或48h。每孔加入CCK-8试剂20μl。继续孵育2h，于450nm处测定吸收值，并以650nm为参考波长。计算细胞活力，公式如下：
细胞活力(％)＝[(OD实验-OD调零)/(OD对照-OD调零)]×100
本发明提供的磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物作为体内递送载体的应用，其方法和步骤如下：
(1)以DiR为荧光探针，PEG-DSPE-RVG-15：mPEG-DSPE＝1:9或者0:1，采用薄膜分散法制备DiR胶束。
(2)取6周龄的雌性ICR小鼠，将小鼠随机分为2组，分别尾静脉注射(1) 中所制的DiR胶束200μl。注射1、4h和24h后，将小鼠用异氟烷麻醉，用小动物活体成像仪观察体内荧光现象。
有益效果：
1、本发明制备的纳米材料具有穿透血脑屏障的功能，解决了载药入脑的脑部疾病治疗的瓶颈问题。
2、本发明制备跨的BBB纳米材料核心狂犬病毒衍生肽由15个氨基酸构成，细胞摄取效率稍差于阳性对照RVG-29，但肽链长度减小一半，更有利于形成小粒径的纳米粒，便于实现脑靶向递送，且极大节约了生产成本。
3、本发明制备纳米材料具有良好的生物相容性和血液长循环的功能，可大幅降低一些化药的毒副作用。
4、本发明制备的纳米材料可包载多种无法跨BBB的化药，对开发那些体外药理活性好，但体内无法跨BBB入脑发挥作用的传统药物提供了一个新途径。
附图说明
图1：RVG-15-Cys和DSPE-PEG2000-MAL的反应式
图2：RVG-15-Cys的基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF-MS)图谱
图3：DSPE-PEG2000-MAL的MALDI-TOF-MS图谱
图4：DSPE-PEG2000-RVG-15的MALDI-TOF-MS图谱
图5：RVG-15-Cys的傅立叶变换红外图谱
图6：DSPE-PEG2000-MAL的傅立叶变换红外图谱
图7：DSPE-PEG2000-RVG-15的傅立叶变换红外图谱
图8：DSPE-PEG2000/DOX的动态光散射(DLS)粒径分布图
图9：DSPE-PEG2000-RVG-15/DOX的DLS粒径分布图
图10：DSPE-PEG2000/DOX胶束透射电镜图
图11：DSPE-PEG2000-RVG-15/DOX胶束透射电镜图
图12：不同pH下DSPE-PEG2000/DOX和DSPE-PEG2000-RVG-15/DOX中DOX 的释放曲线。
图13：DSPE-PEG2000-RVG-15对大鼠C6细胞的活力抑制结果图
图14：阴性对照组对C6细胞迁移能力的影响结果图
图15：DSPE-PEG2000/DOX对C6细胞迁移能力的影响结果图
图16：DSPE-PEG2000-RVG-15/DOX对C6细胞迁移能力的影响结果图
图17：ICR小鼠尾静脉注射DSPE-PEG2000/DiR1h、4h、24h体内荧光变化情况
图18：ICR小鼠尾静脉注射DSPE-PEG2000-RVG-15/DiR1h、4h、24h体内荧光变化情况
具体实施方式
实施例1：DSPE-PEG2000-RVG-15的合成
称取19mg DSPE-PEG2000-MAL、30mgRVG-15-Cys于10mlpH为8的HEPEs 缓冲液中，氮气保护下室温搅拌反应16h，反应式如图1所示。反应结束后，装入截留分子量为12000的透析袋去离子水中透析24h。液体冷冻干燥得到 DSPE-PEG2000-RVG-15粉末。
取冻干后的DSPE-PEG2000-RVG-15和反应物基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF-MS)测分子量，结果见图2-4。从图2-4可知，RVG-15-Cys的分子量约为1964，DSPE-PEG2000-MAL的分子量约为2875，目标产物DSPE-PEG2000 -RVG-15约为4844，接近两反应物的分子量和，说明得到目标产物。
取冻干后的DSPE-PEG2000-RVG-15和反应物进行傅立叶变换红外图谱分析，结果如图5-7所示。结果表明，RVG-15-Cys在3300左右处的S-H键伸缩振动产生的强峰在产物消失，也可说明反应成功。
实施例2：聚合物包载阿霉素的DSPE-PEG胶束的制备
取2.5mgDSPE-PEG2000-RVG-15于去离子水中，超声助溶。加入 DSPE-PEG200022.5mg，50℃恒温水浴30min，再加入5mg阿霉素(DOX)，继续 50℃恒温水浴30min，即得DSPE-PEG2000-RVG-15/DOX胶束。另制取不带RVG-15 的DSPE-PEG2000/DOX胶束作为阳性对照，制备方法如上。制得的DSPE-PEG2000-RVG-15/DOX胶束与DSPE-PEG2000/DOX胶束分别用超速离心法测包封率和载药量；分别过0.22μm水性滤膜，马尔文纳米粒度仪测胶束粒径。
胶束粒径分布图如图8图9所示，DSPE-PEG2000/DOX粒径为13.11nm；包封率为95.09％；载药量为14.41％。DSPE-PEG2000-RVG-15/DOX粒径为13.97nm；包封率为94.76％；载药量为14.43％。与参照梁伟等人的文献报道结果相近。
透射电镜观察两种胶束的形态，结果如图10，11所示。结果表明两种胶束在电镜视野下均呈球形，颗粒较圆整，粒径在15nm作用，与马尔文粒径仪给出的结果相一致。
实施例3：包载阿霉素的聚合物胶束体外累计释放度的测定
将阿霉素胶束溶液(含盐酸阿霉素1mg)转移至透析袋中，两端扎紧后置于 10ml的相应pH值(5.0和7.4)的等渗PBS缓冲液中，以中国药典2015版四部溶出度测定法之第三法(小杯法)的装置和方法，37℃恒温振荡，回旋速度为100rpm。在0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、27、30、33、36、48、56、71、79h定时取出0.5ml释放介质，同时补充同温同体积新鲜释放介质。取出的释放介质离心 (12000rpm，10min)，应用高效液相色谱法测定盐酸阿霉素的累积含量。
如12显示，随着pH值的降低，盐酸阿霉素释放速率增加。这种释放性质提示在肿瘤pH较低的微环境下该聚合物释放药物的效率比其他正常环境下高，进而可说明该系统对正常组织的毒副作用较低。
药理实验：
实验例1：聚合物细胞毒性试验
细胞毒性评价实验采用CCK-8法测定。取对数生长期的C6细胞，以5×103/ 孔或3×103/孔的密度接种于96孔板，于37℃、5％CO2孵育24h。分别加入 DSPE-PEG-RVG-15浓度为100、75、50、25、10、7.5、5、2.5、1μg/mL的RPMI-1640 培养液100μL，继续孵育24h或48h。孵育结束后，吸去培养液，每孔加入含 10％CCK-8的培养液100μL，孵育2h后于酶标仪450nm处测定OD值。
细胞活力(％)＝(OD实验孔-OD调零孔)/(OD对照孔-OD调零孔)×100％。
结果如图13所示，与不同浓度的DSPE-PEG-RVG-15的细胞活力均高于90％，表明聚合物毒性较小，具有良好的安全性。
实验例2：DSPE-PEG2000-RVG-15/DOX抑制细胞迁徙能力考查
将对数生长期的C6细胞以1.5×105个/ml的密度接种于12孔板中，于37℃， 5％CO2条件下培养24h，用10μl枪头与细胞表面垂直划痕，每孔1条，用PBS 洗去悬浮细胞和杂质，于显微镜下拍照，记录为0时刻划痕。向副孔中分别加入 0.5μmg/ml的DSPE-PEG2000-RVG-15/DOX和DSPE-PEG2000/DOX，继续于37℃， 5％CO2条件下培养，24h后显微镜下拍照，观察划痕愈合情况，以考察 DSPE-PEG2000-RVG-15/DOX胶束对C6细胞的横向迁移的抑制能力。结果如图 14-16所示。结果表明DSPE-PEG2000-RVG-15/DOX组对划痕愈合抑制情况明显强于空白对照组和DSPE-PEG2000/DOX组。
实验例3：磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物在体内穿透血脑屏障的效率
以DiR为荧光探针，PEG-DSPE-RVG-15：mPEG-DSPE＝1:9或者0:1，采用薄膜分散法制备DiR胶束。
取6周龄的雌性ICR小鼠，将小鼠随机分为2组，分别尾静脉注射上述所制的DiR胶束200μl。注射1、4h和24h后，将小鼠用异氟烷麻醉，用小动物活体成像仪观察体内荧光现象。
结果如图17、18所示。结果表明注射PEG-DSPE-RVG-15/DiR的小鼠24小鼠后入脑效果明显，而PEG-DSPE/DiR入脑能力很小，进一步表明RVG-15连接到载体上后可显著提高纳米胶束穿透血脑屏障的能力，确证了RVG-15修饰的纳米胶束具有脑靶向性能。
序列表
<110> 中国医学科学院药物研究所
<120> 一种磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物，其制备方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 狂犬病毒(Rabies virus)
<400> 1
Tyr Thr Ile Trp Cys Asp Ile Phe Thr Asp Ser Arg Gln Lys Arg
1 5 10 15

Claims (11)

1.一种式(Ⅰ)所示磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物，其结构组成为：聚乙二醇分子链的一端通过马来酰亚胺基和半胱氨酸连接狂犬病毒衍生肽RVG-15，分子链另一端连接磷脂分子R的胺基端
Figure FDA0001743194880000011
2.根据权利要求1所述的聚合物，狂犬病毒衍生肽RVG-15的序列如序列表1所示。
3.根据权利要求2所述的聚合物，其特征在于，狂犬病毒衍生肽RVG-15氨基酸序列中的氨基酸选自L型或D型氨基酸。
4.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于R为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺基、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺基、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺基、二油酰磷脂酰乙醇胺基或二月桂酰磷脂酰乙醇胺基。
5.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于聚乙二醇的聚合度n优选8～230，进一步优选18～115，更优选25～55，进一步更优选30～50，最优选40～45，进一步最优选45。
6.制备权利要求1所述的聚合物，其特征在于，PEG与RVG-15之间以半胱氨酸与马来酰亚胺相连，反应如(Ⅱ)
Figure FDA0001743194880000012
7.权利要求1所述的磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物作为载体在体外和体内递送药物的应用。
8.根据权利要求7所述的聚合物的应用，其特征在于聚合物本身可在溶液中形成聚合物胶束，胶束可包载活性药物形成纳米制剂，用于疾病治疗。
9.根据权利要求8所述的聚合物的应用，其特征在于，聚合物胶束包载的活性药物可为脂溶性药物和亲水性药物。
10.根据权利要求8所述的聚合物的应用，其特征在于，包载的活性药物包括抗肿瘤药物阿霉素、丝裂霉素C、丝裂霉素C前药、丝裂霉素C衍生物、紫杉醇、多西紫杉醇或羟基喜树碱。
11.根据权利要求8所述的聚合物的应用，其特征在于，纳米制剂可使用自组装法、薄膜分散法、冷冻干燥法、化学梯度法和逆向蒸发法。
CN201810833188.6A 2018-07-25 2018-07-25 一种磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物，其制备方法及应用 Active CN110759974B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810833188.6A CN110759974B (zh) 2018-07-25 2018-07-25 一种磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物，其制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810833188.6A CN110759974B (zh) 2018-07-25 2018-07-25 一种磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物，其制备方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110759974A true CN110759974A (zh) 2020-02-07
CN110759974B CN110759974B (zh) 2021-11-09

Family

ID=69327365

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810833188.6A Active CN110759974B (zh) 2018-07-25 2018-07-25 一种磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物，其制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110759974B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115177589A (zh) * 2021-04-07 2022-10-14 中国医学科学院药物研究所 一种紫杉醇脑靶向脂质体和其制备方法及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102014967A (zh) * 2008-03-21 2011-04-13 阿德利夫股份有限公司 芘携带肽穿过血脑屏障的用途
CN102836440A (zh) * 2011-06-25 2012-12-26 复旦大学 一种多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统及其制备方法
US20130012456A1 (en) * 2011-06-03 2013-01-10 Andreas Walz Compositions and methods for transport across the blood brain barrier
US20180028675A1 (en) * 2015-02-04 2018-02-01 United Arab Emirates University Rvg derived peptides

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102014967A (zh) * 2008-03-21 2011-04-13 阿德利夫股份有限公司 芘携带肽穿过血脑屏障的用途
US20130012456A1 (en) * 2011-06-03 2013-01-10 Andreas Walz Compositions and methods for transport across the blood brain barrier
CN102836440A (zh) * 2011-06-25 2012-12-26 复旦大学 一种多肽修饰的脑靶向纳米基因递释系统及其制备方法
US20180028675A1 (en) * 2015-02-04 2018-02-01 United Arab Emirates University Rvg derived peptides

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MIRA OSWALD等: "Targeting the Central Nervous System (CNS): A Review of Rabies Virus-Targeting Strategies", 《MOL PHARM》 *
孙蓉等: "angiopep-2修饰的脑靶向制剂研究进展", 《国际药学研究杂志》 *
张哲明等: "脑靶向纳米给药系统研究进展", 《国际药学研究杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115177589A (zh) * 2021-04-07 2022-10-14 中国医学科学院药物研究所 一种紫杉醇脑靶向脂质体和其制备方法及应用
CN115177589B (zh) * 2021-04-07 2024-02-06 中国医学科学院药物研究所 一种紫杉醇脑靶向脂质体和其制备方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110759974B (zh) 2021-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108578711B (zh) 一种乙酰化糖酯-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺共轭物及其制备方法与应用
WO2018233095A1 (zh) 具有淋巴靶向功能的生物自组装纳米晶注射剂及制备方法
CN106474064B (zh) 一种蒿甲醚纳米脂质体及其制备方法与应用
CN113384530B (zh) 一种多糖核心Nanocells及其制备方法与应用
CN108126210A (zh) 一种单靶向还原响应囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用
CN110759974B (zh) 一种磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物，其制备方法及应用
CN110898231B (zh) 一种功能化拉洛他赛脂质体及其制备方法与应用
CN107998081A (zh) 一种靶向还原响应囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用
CN108498485B (zh) 二氢青蒿素修饰的药物传递载体及其在药学中的应用
CN109481400B (zh) 一种肝靶向阿霉素/Bcl-2 siRNA共载纳米胶束及其制备方法和应用
CN108186573B (zh) 一种以脂质包裹介孔二氧化硅为载体的羟基喜树碱肝靶向制剂及其制备方法
US9326938B2 (en) Oligomer-contained nanoparticle complex release system
CN102188379A (zh) 载药脂质体的制备方法
CN115844822A (zh) 一种口服载药胶束组合物及其制备方法
CN111298116B (zh) 多肽载药温敏脂质体及其制备方法和应用
Liao et al. Preparation of galactosyl nanoparticles and their targeting efficiency to hepatocellular carcinoma
JP7204744B2 (ja) ｃ（ＲＧＤ－ＡＣＰ－Ｋ）修飾血中滞留型リポソーム
WO2020232701A1 (zh) 单醣标记的纳米脂质体药物递送系统,其制法及其作为药物靶定递送载体的应用
CN115177589B (zh) 一种紫杉醇脑靶向脂质体和其制备方法及应用
Zhang et al. Novel peptide-directed liposomes for targeted combination therapy of breast tumors
TWI734987B (zh) 單醣標記之奈米脂質體藥物遞送系統，其製法及其作為藥物靶定遞送載體之應用
CN114432248B (zh) 一种靶向复合载体、载药体系、制备方法及其用途
CN110200920B (zh) 一种还原敏感药物组合物及其制备和应用
CN110302159B (zh) 一种还原敏感脂质药物组合物及其制备方法和应用
CN110628011B (zh) 一种磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物，其制备方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant