CN107213505A - 一种抑制瘢痕形成的γ‑聚谷氨酸和透明质酸纤维伤口敷料及其制备方法 - Google Patents

一种抑制瘢痕形成的γ‑聚谷氨酸和透明质酸纤维伤口敷料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抑制瘢痕形成的γ‑聚谷氨酸和透明质酸纤维伤口敷料及其制备方法，该纤维敷料是通过微流体纺丝技术制备，基于水溶性天然高分子γ‑聚谷氨酸和透明质酸复合制成，通过调节微流体纺丝参数制备定向有序排布的纤维敷料，该纤维敷料定向有序排布结构诱导伤口皮肤成纤维细胞取向生长和迁移，实现胶原蛋白纤维定向有序分布，从而抑制皮肤伤口愈合过程增生性瘢痕形成的问题，增强敷料功效。

Description

一种抑制瘢痕形成的γ-聚谷氨酸和透明质酸纤维伤口敷料 及其制备方法
技术领域
本发明属于纳米纤维伤口敷料的制备技术领域，具体涉及一种抑制瘢痕形成的γ-聚谷氨酸和透明质酸纤维伤口敷料及其制备方法，还涉及所述伤口敷料在制备促进创面修复、诱导组织再生或抑制创面瘢痕形成的药品或美容品中的应用。
背景技术
增生性瘢痕是病理性瘢痕中的一种主要类型，常导致瘙痒、疼痛、活动障碍等诸多并发症，已成为创面修复及术后美容领域研究的重点。其主要病理学特征是大量成纤维细胞增生和胶原的过度沉积及无序排列。目前主要以手术和非手术治疗为主，但仍然缺乏足够的认识和特效的治疗手段及药物。微纳米纤维敷料因具有仿生皮肤细胞外基质及高的比表面积和三维结构等诸多优点，在皮肤组织修复及功能重建领域得到了广泛的研究。然而，目前微纳米纤维敷料主要采用静电纺丝方法制得，其无序非取向诱导皮肤成纤维细胞生长的特性使得术后皮肤增生性瘢痕问题仍未得到有效解决。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的技术问题，提供一种抑制瘢痕形成的γ-聚谷氨酸和透明质酸纤维伤口敷料，该纤维敷料定向有序排布结构诱导伤口皮肤成纤维细胞取向迁移和增值，实现胶原蛋白纤维取向形成，不仅高效诱导创面皮肤再生修复，同时有效抑制皮肤伤口愈合过程增生性瘢痕形成的问题，增强敷料功效。
本发明的另一个目的是提供所述伤口敷料的制备方法。
本发明的另一个目的是提供所述伤口敷料在促进创面修复及诱导组织再生并抑制创面瘢痕形成中的应用。
为了实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种抑制瘢痕形成的γ-聚谷氨酸和透明质酸纤维伤口敷料，其以γ-聚谷氨酸和透明质酸为纺丝原料，通过微流体纺丝方法制备得到。
进一步地，所述γ-聚谷氨酸(γ-PGA)分子量范围为10万～200万道尔顿，优选100万道尔顿；所述透明质酸(HA)分子量为50万～200万道尔顿，优选70万～100万道尔顿。
进一步地，所述γ-聚谷氨酸与透明质酸的质量比为1∶1～5∶1，优选3∶1～5∶1。
进一步地，所述敷料还包括助纺高分子，所述助纺高分子为聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种或两种的混合物；γ-聚谷氨酸和透明质酸的总质量与助纺高分子的质量比为3∶1～10∶1，优选5∶1～10∶1。
一种抑制瘢痕形成的γ-聚谷氨酸和透明质酸纤维伤口敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将γ-聚谷氨酸、透明质酸和助纺高分子溶解在溶剂中得到聚合物溶液；
(2)将步骤(1)制备得到的聚合物溶液置入微流体纺丝装置纺丝；
(3)将步骤(2)得到的纤维敷料干燥。
步骤(1)中，所述溶剂为水、乙醇、乙酸水溶液，或乙醇和水的混合溶剂；γ-聚谷氨酸和透明质酸和助纺高分子的总质量浓度为2wt％～10wt％，优选5wt％。
步骤(1)中，将天然高分子γ-聚谷氨酸和透明质酸，以及助纺高分子溶解在溶剂中，机械搅拌得到均匀的聚合物纺丝液。
步骤(2)中，将步骤(1)制备得到的聚合物溶液置入微流体纺丝装置的注射器中，设置推进速率和旋转电机旋转速率后启动纺丝，先挑出一根纤维连在纤维接收器上，由接收器上的接收板旋转卷绕出连续均一的丝，同时设置步进平移台的步进平移速率，使得卷出的丝位置随之偏移，理论等间距收集使之可以不重叠，得到等间距平行微丝正列。
进一步地，所述溶液推速为0.1～1mL/h，优选0.4～0.7mL/h；旋转电机转速设置为800～1500rad/min，优选1000～1200rad/min；步进平移台步进平移速率为20～50mm/min，优选30～40mm/min。
进一步地，所述操作温度和压力为常温常压。
步骤(3)所述的干燥为30～50℃真空干燥，优选40℃真空干燥；干燥时间为12～24h。
按照上述所有的制备方法制得的敷料都在本发明的保护范围之内。
按照上述所有的制备方法制得的敷料在制备促进创面修复、诱导组织再生或抑制创面瘢痕形成的药品或美容品中的应用也都在本发明的保护范围之内。
有益效果：
(1)本发明在现有技术的基础上，通过微流体纺丝技术制备新型纤维敷料，从模拟皮肤细胞外基质(ECM)主要成分-胶原蛋白/多糖结构出发，以天然高分子γ-聚谷氨酸和透明质酸为原始材料，通过调节微流体纺丝参数制备定向有序排布的纤维敷料，该纤维敷料定向有序排布结构诱导伤口皮肤成纤维细胞取向生长和迁移，实现胶原蛋白纤维定向有序分布，从而抑制皮肤伤口愈合过程增生性瘢痕形成的问题，增强敷料功效。
(2)本发明制备过程简单易行，无高电压流、安全、节能、便捷，易实现工业化生产，在伤口敷料领域具有很好的应用潜力。
附图说明
图1为微流体纺丝装置示意图；
图2为实施例1制备得到γ-PGA/HA纳米纤维扫描电镜图谱：(a)微流体纺丝方法制得的纤维微观形貌，(b)商业化静电纺丝纤维微观形貌；
图3为实施例1制备得到γ-PGA/HA纤维敷料生物相容性评价结果；
图4为实施例1制备得到γ-PGA/HA纤维敷料在第七天时促进大鼠创面皮肤修复再生和抑制瘢痕效果评价效果图：(a)空白对照组，(b)商业化静电纺丝敷料，(c)微流体纺丝纤维敷料；上层为皮肤创面愈合宏观照片，下层为胶原蛋白纤维马松染色图片。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实验所用的仪器和材料
1.微流体纺丝装置
本发明实施例所用的微流体纺丝装置购自于南京捷纳思新材料有限公司，见图1。电源：AC：220V，50Hz；额度功率：300w；使用环境：常温常压，静态环境；可选注射器规格：0.5-200mL；进样速度范围：0.1ul/h-150ul/h；旋转速度：0-1440rad/min；平移速度：0-1000mm/min。
2.商业化静电纺丝纤维敷料
本发明实施例所用的商业化静电纺丝纤维敷料由海藻酸钙无纺布组成，成分为海藻酸钙纤维，经环氧乙烷灭菌后应无菌，一次性使用。
实施例1：
(1)将γ-PGA、HA和PVA粉末溶解在水中，其中γ-PGA分子量为100万道尔顿，HA分子量为100万道尔顿，γ-PGA与HA的质量比为3∶1，γ-PGA/HA和PVA的质量比为10∶1，γ-PGA/HA和PVA的总质量浓度为5wt％，机械搅拌得到均匀的聚合物纺丝液；
(2)常温常压下，将聚合物溶液置入注射器中，设置推进速率为0.4mL/h。旋转电机速率设置为1200rad/min，先挑出一根纤维连在上述所述的接收器上，由接收器上的接收板即玻璃片旋转卷绕出连续均一的丝。步进平移台设置步进平移速率为35mm/min，使得卷出的丝位置随之偏移，理论等间距收集使之可以不重叠，得到等间距平行微丝正列；
(3)将收集到的纤维敷料真空干燥处理，真空干燥温度为40℃，时间为24h。得到γ-聚谷氨酸和透明质酸纤维伤口敷料。
实验结果：
(1)图2为实施例1制备得到γ-PGA/HA纳米纤维扫描电镜图谱：(a)微流体纺丝方法制得的纤维微观形貌，(b)商业化静电纺丝纤维微观形貌。从图2中可以看出，该实施例条件下制得的纤维丝较商业化静电纺丝纤维具有定向有序性。
(2)图3为实施例1制备得到γ-PGA/HA纤维敷料生物相容性评价结果。本发明采用的生物相容性评价实验详见实施例8。从图3可以看出，实验组γ-PGA/HA纤维敷料处理的细胞增值率超过空白对照组，可以促进L929皮肤成纤维细胞的增殖和黏附，具有良好的生物相容性。
(3)图4为实施例1制备得到γ-PGA/HA纤维敷料在第七天时促进大鼠创面皮肤修复再生和抑制瘢痕效果评价效果图：(a)空白对照组，(b)商业化静电纺丝敷料，(c)微流体纺丝纤维敷料；上层为皮肤创面愈合宏观照片，下层为胶原蛋白纤维马松染色图片。本发明采用的促进创面愈合及抑制瘢痕形成能力评价实验详见实施例9。
从图4创面修复宏观照片可以看出，本发明微流体纺丝法制得的γ-PGA/HA纤维敷料的创面愈合率优于商业化静电纺丝组和空白对照组，且无明显增生瘢痕，而商业化静电纺丝组和空白对照组瘢痕严重。
重要的是，图4中马松染色结果显示，γ-PGA/HA纤维敷料处理组创面新生胶原厚度明显大于对照组，且胶原纤维有序排列，说明γ-PGA/HA纤维敷料的有序阵列排布可以较好的诱导创面成纤维细胞趋向迁移排布进而表达胶原蛋白，同时在抑制瘢痕形成的同时高效促进创面修复重建和诱导皮肤组织再生。
实施例2：
(1)将γ-PGA、HA和PVA粉末溶解在水中，其中γ-PGA分子量为100万道尔顿，HA分子量为50万道尔顿，γ-PGA与HA的质量比为3∶1，γ-PGA/HA和PVA的质量比为5∶1，γ-PGA/HA和PVA的总质量浓度为5wt％，机械搅拌得到均匀的聚合物纺丝液；
(2)常温常压下，将聚合物溶液置入注射器中，设置推进速率为0.4mL/h。旋转电机速率设置为1000rad/min，先挑出一根纤维连在上述所述的接收器上，由接收器上的接收板即玻璃片旋转卷绕出连续均一的丝。步进平移台设置步进平移速率为30mm/min，使得卷出的丝位置随之偏移，理论等间距收集使之可以不重叠，得到等间距平行微丝正列；
(3)将收集到的纤维敷料真空干燥处理，真空干燥温度为30℃，时间为12h。得到γ-聚谷氨酸和透明质酸纤维伤口敷料，得到纤维丝排列有序性较好。
实施例3：
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-PGA)、透明质酸(HA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)粉末溶解在水中，其中γ-PGA分子量为200万道尔顿，HA分子量为100万道尔顿，γ-PGA与HA的质量比为5∶1，γ-PGA/HA和PVA的质量比为5∶1，γ-PGA/HA和PVP的总质量浓度为5wt％，机械搅拌得到均匀的聚合物纺丝液；
(2)常温常压下，将聚合物溶液置入注射器中，设置推进速率为0.7mL/h。旋转电机速率设置为1000rad/min，先挑出一根纤维连在上述所述的接收器上，由接收器上的接收板即玻璃片旋转卷绕出连续均一的丝。步进平移台设置步进平移速率为30mm/min，使得卷出的丝位置随之偏移，理论等间距收集使之可以不重叠，得到等间距平行微丝正列；
(3)将收集到的纤维敷料真空干燥处理，真空干燥温度为40℃，时间为24h。得到γ-聚谷氨酸和透明质酸纤维伤口敷料，得到纤维丝排列有序性较好。
实施例4：
(1)将γ-PGA、HA和PVA粉末溶解在水中，其中γ-PGA分子量为100万道尔顿，HA分子量为200万道尔顿，γ-PGA与HA的质量比为1∶1，γ-PGA/HA和PVA的质量比为10∶1，γ-PGA/HA和PVA的总质量浓度为5wt％，机械搅拌得到均匀的聚合物纺丝液；
(2)常温常压下，将聚合物溶液置入注射器中，设置推进速率为0.1mL/h。旋转电机速率设置为1200rad/min，先挑出一根纤维连在上述所述的接收器上，由接收器上的接收板即玻璃片旋转卷绕出连续均一的丝。步进平移台设置步进平移速率为40mm/min，使得卷出的丝位置随之偏移，理论等间距收集使之可以不重叠，得到等间距平行微丝正列；
(3)将收集到的纤维敷料真空干燥处理，真空干燥温度为40℃，时间为24h。得到γ-聚谷氨酸和透明质酸纤维伤口敷料，得到纤维丝排列有序性较好。
实施例5：
(1)将γ-PGA、HA和PVP粉末溶解在水中，其中γ-PGA分子量为200万道尔顿，HA分子量为70万道尔顿，γ-PGA与HA的质量比为5∶1，γ-PGA/HA和PVP的质量比为10∶1，γ-PGA/HA和PVP的总质量浓度为10wt％，机械搅拌得到均匀的聚合物纺丝液；
(2)常温常压下，将聚合物溶液置入注射器中，设置推进速率为0.1mL/h。旋转电机速率设置为1500rad/min，先挑出一根纤维连在上述所述的接收器上，由接收器上的接收板即玻璃片旋转卷绕出连续均一的丝。步进平移台设置步进平移速率为50mm/min，使得卷出的丝位置随之偏移，理论等间距收集使之可以不重叠，得到等间距平行微丝正列；
(3)将收集到的纤维敷料真空干燥处理，真空干燥温度为50℃，时间为24h。得到γ-聚谷氨酸和透明质酸纤维伤口敷料，得到纤维丝排列有序性较好。
实施例6：
(1)将γ-PGA、HA和PVA粉末溶解在水中，其中γ-聚谷氨酸分子量为100万道尔顿，HA分子量为150万道尔顿，γ-PGA与HA的质量比为3∶1，γ-PGA/HA和PVA的质量比为5∶1，γ-PGA/HA和PVA的总质量浓度为10wt％，机械搅拌得到均匀的聚合物纺丝液；
(2)常温常压下，将聚合物溶液置入注射器中，设置推进速率为0.1mL/h。旋转电机速率设置为1500rad/min，先挑出一根纤维连在上述所述的接收器上，由接收器上的接收板即玻璃片旋转卷绕出连续均一的丝。步进平移台设置步进平移速率为50mm/min，使得卷出的丝位置随之偏移，理论等间距收集使之可以不重叠，得到等间距平行微丝正列；
(3)将收集到的纤维敷料真空干燥处理，真空干燥温度为40℃，时间为24h。得到γ-聚谷氨酸和透明质酸纤维伤口敷料，得到纤维丝排列有序性较好。
实施例7：
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-PGA)、透明质酸(HA)和聚乙烯醇(PVA)粉末溶解在水中，其中γ-PGA分子量为10万道尔顿，HA分子量为50万道尔顿，γ-PGA与HA的质量比为1∶1，γ-PGA/HA和PVA的质量比为3∶1，γ-PGA/HA和PVA的总质量浓度为2wt％，机械搅拌得到均匀的聚合物纺丝液；
(2)常温常压下，将聚合物溶液置入注射器中，设置推进速率为0.1mL/h。旋转电机速率设置为800rad/min，先挑出一根纤维连在上述所述的接收器上，由接收器上的接收板即玻璃片旋转卷绕出连续均一的丝。步进平移台设置步进平移速率为20mm/min，使得卷出的丝位置随之偏移，理论等间距收集使之可以不重叠，得到等间距平行微丝正列；
(3)将收集到的纤维敷料真空干燥处理，真空干燥温度为30℃，时间为12h。得到γ-聚谷氨酸和透明质酸纤维伤口敷料，得到纤维丝排列有序性较好。
实施例8：
将上述实施例1-7制得的纤维敷料分别按照下述实验过程进行生物相容性评价。
(1)γ-PGA/HA纤维敷料的准备。首先将纤维材料剪成直径为1cm的圆形，超净工作台上紫外线照射2h，用75％酒精浸泡1h，然后用PBS冲洗3遍，不少于1h，将支架材料浸泡在DMEM细胞培养液中过夜，备用。
(2)细胞在材料上的增殖情况(MTT实验)。将L929细胞按1×106每孔接种于12孔培养板中，在其中6孔中细胞液加入纤维敷料材料，另外6孔为空白对照组。分别在培养1，3，5d时加入100μL MTT试剂并在37℃下孵育4h，然后加入150μL DMSO溶解甲瓒沉淀，通过酶标仪测定培养液在570nm和630nm波长下的吸收值，计算细胞增值率，计算公式为：
实验每组进行6个平行实验，取平均值减小系统误差。
实验结果显示，实施例1-7制得的纤维敷料均具有良好的生物相容性。
实施例9：
将上述实施例1-7制得的γ-PGA/HA纤维敷料分别按照下述实验过程进行促进创面愈合及抑制瘢痕形成能力评价。
(1)γ-PGA/HA纤维敷料的准备。首先将纤维材料剪成直径为1cm的圆形，超净工作台上紫外线照射2h，用75％酒精浸泡1h，然后用0.9％的生理盐水冲洗3遍后备用。
(2)动物模型的制备和创面处理
通过建立大鼠全层皮肤切口模型评价γ-PGA/HA纤维敷料促进创面愈合及抑制瘢痕形成的能力。所有动物实验操作均符合国际动物保护和伦理道德规范。实验对象选取15只雄性Sprague-Dawley大鼠(180-250g，南京军区南京总医院)，首先在老鼠腹腔注射氯胺酮(50mg/kg体重)对其进行麻醉处理，然后用剃刀除去老鼠背部毛发，再用碘伏对皮肤进行消毒。在肩胛骨两侧位置各建立1个圆形皮肤全层缺损(半径1cm)。随后，所有实验动物随机分为3组，分别为阳性对照组(商业化静电纺丝组)、阴性对照组(空白对照组)、实验组，每组5只：在老鼠背部缺损处分别用无菌PBS、纱布和γ-PGA/HA纤维敷料进行处理。
(3)创面的观察和创面愈合率的计算
于手术后1，3，5，7d打开敷料，观察创面愈合的情况，数码相机照相后，用OPTIMAS显微图象分析系统计算创面面积，留取创面及创周组织做病理切片，进行Masson染色，按下面公式计算创面愈合率：
γ-PGA/HA纤维敷料处理的伤口7天后创面愈合率评价见表1。
表1
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 实施例6 实施例7
实验组 97 84 90 87 92 83 82
阳性对照组 72 72 72 72 72 72 72
阴性对照组 46 46 46 46 46 46 46
表1显示，在第七天时，商业化静电纺丝组和空白对照组处理的创面愈合率分别为72％和46％，而由本发明微流体纺丝法制得的γ-PGA/HA纤维敷料均优于对照组，最高愈合率可达97％。观察创面愈合的情况，本发明微流体纺丝法制得的γ-PGA/HA纤维敷料无明显增生性瘢痕，商业化静电纺丝组和空白对照组瘢痕严重。γ-PGA/HA纤维敷料处理组创面新生胶原厚度明显大于对照组，且胶原纤维有序排列，说明γ-PGA/HA纤维敷料的有序阵列排布可以较好的诱导创面成纤维细胞趋向迁移排布进而表达胶原蛋白，同时在抑制瘢痕形成的同时高效促进创面修复重建和诱导皮肤组织再生。

Claims (10)

1.一种抑制瘢痕形成的γ-聚谷氨酸和透明质酸纤维伤口敷料，其特征在于：其以γ-聚谷氨酸和透明质酸为纺丝原料，通过微流体纺丝方法制备得到。
2.根据权利要求1所述的抑制瘢痕形成的γ-聚谷氨酸和透明质酸纤维伤口敷料，其特征在于：所述γ-聚谷氨酸分子量范围为10万～200万道尔顿，所述透明质酸分子量为50万～200万道尔顿。
3.根据权利要求1所述的抑制瘢痕形成的γ-聚谷氨酸和透明质酸纤维伤口敷料，其特征在于：所述γ-聚谷氨酸与透明质酸的质量比为1∶1～5∶1。
4.根据权利要求1所述的抑制瘢痕形成的γ-聚谷氨酸和透明质酸纤维伤口敷料，其特征在于：所述敷料还包括助纺高分子，所述助纺高分子为聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或两种的混合物；γ-聚谷氨酸和透明质酸的总质量与助纺高分子的质量比为3∶1～10∶1。
5.权利要求4所述的抑制瘢痕形成的γ-聚谷氨酸和透明质酸纤维伤口敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将γ-聚谷氨酸、透明质酸和助纺高分子溶解在溶剂中得到聚合物溶液；
(2)将步骤(1)制备得到的聚合物溶液置入微流体纺丝装置纺丝；
(3)将步骤(2)得到的纤维敷料干燥。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述溶剂为水、乙醇、乙酸水溶液，或乙醇和水的混合溶剂；γ-聚谷氨酸和透明质酸和助纺高分子的总质量浓度为2wt％～10wt％。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，将步骤(1)制备得到的聚合物溶液置入微流体纺丝装置的注射器中，设置推进速率和旋转电机旋转速率后启动纺丝，先挑出一根纤维连在纤维接收器上，由接收器上的接收板旋转卷绕出连续均一的丝，同时设置步进平移台的步进平移速率，使得卷出的丝位置随之偏移，理论等间距收集使之可以不重叠，得到等间距平行微丝正列。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述溶液推速为0.1～1mL/h，旋转电机转速设置为800～1500rad/min，步进平移台步进平移速率为20～50mm/min。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的干燥为30～50℃真空干燥，干燥时间为12～24h。
10.权利要求1～4中任意一项所述的伤口敷料在制备促进创面修复、诱导组织再生或抑制创面瘢痕形成的药品或美容品中的应用。
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