CN109464701B - Va@plga-cs-ha复合抗菌缓释微球的制备方法及其在骨修复支架材料中的应用 - Google Patents

Va@plga-cs-ha复合抗菌缓释微球的制备方法及其在骨修复支架材料中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种VA@PLGA‑CS‑HA复合抗菌缓释微球的制备方法及其在骨修复支架材料中的应用，属生物医用材料领域。本发明微球的制备方法是首先将PLGA溶液与VA溶液混合均匀，形成W1/O乳液；将壳聚糖溶液与PVA水溶液混合均匀，得到CS/PVA溶液；将透明质酸钠溶液与PVA溶液混合，配制HAS/PVA溶液；然后将CS/PVA溶液与W1/O乳液混合，得到稳定的W1/O/W2乳液；再将W1/O/W2乳液与HAS/PVA溶液混合，加入三聚磷酸钠水溶液，最后静置、离心、洗涤、干燥后制得。本发明方法简单有效，具有良好的生物安全性，且制得的微球具有优异的抗菌、降解等性能，适合用作骨缺损修复材料。

Description

VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的制备方法及其在骨修复 支架材料中的应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的制备方法及其在骨修复支架材料中的应用。
背景技术
随着外伤，骨病、肿瘤，先天畸形等原因造成的关节软骨面缺损经常出现在临床工作中，但由于其自身修复能力非常有限，几乎无法自行修复，因此人们对软骨组织修复材料的需求日益增多。目前针对慢性骨感染所致的骨缺损治疗，临床上常用的方法包括系统使用抗生素抗感染治疗和局部使用抗生素缓释系统。但由于慢性骨感染患者局部骨及软组织瘢痕化，血供差等原因，全身应用抗生素很难达到局部有效杀菌，因此疗效欠佳。而局部抗生素缓释给药系统能在局部释放高浓度抗生素，且可避免全身毒性，在治疗骨髓炎方面表现出了显著的优越性。但现有的缓释骨修复材料仍存在局部抗菌药物难以持续达到有效的抗菌浓度、药物难以实现控制释放等缺陷，因此，临床上急需可控药物释放和可控降解的生物活性抗菌骨修复材料，用于有效修复慢性骨感染引起的骨缺损，降低手术失败率及感染复发率。
目前，临床应用最广泛有效的抗生素递药系统材料是聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，常用的负载抗生素有庆大霉素、妥布霉素和万古霉素等。目前报道的可降解的、已用于局部抗生素缓释的无机和有机载体材料有羟基磷灰石(HAP)、磷酸钙骨水泥(CPC)、硫酸钙、聚乳酸(PLA)，聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)，聚己内酯(PCL)、壳聚糖、胶原蛋白、海藻酸盐等。壳聚糖(Chitosan，CS)是一种天然高分子生物材料，具有无毒性、无刺激性、生物相容性、生物可降解性、易于改性等优良性能，在骨、软骨和皮肤组织工程等方面表现出了良好的应用前景。透明质酸钠(Hyaluronic acid sodium salt，HAS)是皮肤和其它组织中广泛存在的天然生物分子，是构成人体细胞间质、关节滑液等结缔组织的主要成分，在关节腔中几乎以纯态形式存在。它能促进细胞的增殖、分化，清除氧自由基，促进伤口愈合、调节渗透压、润滑、促进细胞修复及改善关节的重要作用。
本发明综合PLGA、壳聚糖、透明质酸钠、万古霉素等材料的优点，制备出了一种可用于骨关节炎软骨缺损修复的复合抗菌缓释支架材料。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的制备方法及其在骨修复支架材料中的应用。
为了实现本发明的上述第一个目的，本发明采用的技术方案如下：
一种VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶解于二氯甲烷中，配制质量百分比浓度为5～15wt％的PLGA溶液；将壳聚糖(CS)溶解于冰乙酸中，配制质量百分比浓度为0.5～1.5wt％的壳聚糖溶液，备用；将透明质酸钠(HAS)溶解于蒸馏水中，配制质量百分比浓度为1～3wt％的透明质酸钠溶液，备用；将万古霉素盐酸盐(VA)溶解于蒸馏水中，配制质量百分比浓度为25～100mg/ml的万古霉素溶液；将聚乙烯醇(PVA)溶解于蒸馏水中，配制质量百分比浓度为0.3～3wt％的PVA溶液，备用；
(2)按比例将步骤(1)所述PLGA溶液与VA溶液混合均匀后超声分散，形成W1/O乳液，其中：所述PLGA溶液与VA溶液的体积比为2～10：1；
(3)按比例将步骤(1)所述壳聚糖溶液与PVA水溶液混合均匀，得到CS/PVA溶液；其中：所述壳聚糖溶液与PVA水溶液的体积比为0.5～2：1；
(4)按比例将步骤(3)所述CS/PVA溶液与步骤(2)所述W1/O乳液混合，超声分散均匀后，得到稳定的W1/O/W2乳液，其中：所述CS/PVA溶液与W1/O乳液的体积比为2～6：1；
(5)取适量步骤(1)所述透明质酸钠溶液，加入PVA溶液，配制HAS/PVA溶液，其中：所述透明质酸钠溶液与步骤(3)采用的壳聚糖溶液的体积比为1：1，所述HAS/PVA溶液与W1/O/W2乳液的体积比为4～6：1；
(6)将步骤(4)所得W1/O/W2乳液与步骤(5)所得HAS/PVA溶液混合，室温搅拌0.5～2h后升温至45℃，继续搅拌20～40min，然后加入适量三聚磷酸钠水溶液，搅拌1～2h后静置8～12h，离心、洗涤，收集沉淀，冷冻干燥，制得所述的VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球。
进一步地，上述技术方案，步骤(1)所述PLGA溶液质量百分比浓度优选为10wt％；所述壳聚糖溶液的质量百分比浓度优选为1wt％；透明质酸钠溶液的质量百分比浓度优选为1.5wt％。
进一步地，上述技术方案，步骤(2)所述PLGA溶液与VA溶液的体积比优选为5：1。
进一步地，上述技术方案，步骤(3)所述壳聚糖溶液与PVA水溶液的体积比优选为1：1，所述PVA水溶液的质量百分比浓度优选为3wt％。
进一步地，上述技术方案，步骤(4)所述CS/PVA溶液与W1/O乳液的体积比优选为4：1。
进一步地，上述技术方案，步骤(5)所述HAS/PVA溶液与W1/O/W2乳液的体积比为5：1，所述加入的PVA溶液质量百分比浓度优选为0.4wt％。
进一步地，上述技术方案，步骤(6)所述三聚磷酸钠水溶液的质量百分比浓度优选为5wt％，所述三聚磷酸钠水溶液与步骤(3)采用的壳聚糖溶液的体积比优选为1：1。
本发明第二个目的在于提供上述方法制得的VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的应用，可用于制备骨修复支架材料。
进一步地，上述所述的骨修复支架材料为VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料。
一种VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(i)将明胶溶解于蒸馏水中，配制质量百分比浓度为1～10％的明胶溶液，备用；
(ii)按配比将羟基磷灰石(HAP)和VA@PLGA-CS-HA微球一并加入到步骤(1)所述明胶溶液中，磁力搅拌30～90min后超声分散均匀，得到HAP/VA@PLGA-CS-HA混合液；
(iii)将步骤(ii)所得HAP/VA@PLGA-CS-HA混合液置于模具中-15～-25℃冷冻，然后在-40～-60℃条件下冷冻干燥，脱模，获得支架；再将所得支架用EDC/NHS乙醇溶液浸泡5～7h，最后洗涤、干燥，获得所述的VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料。
进一步地，上述技术方案，步骤(ii)所述羟基磷灰石与VA@PLGA-CS-HA微球的质量比优选为2：3。
进一步地，上述技术方案，步骤(i)所述明胶溶液的质量百分比浓度优选为5wt％。
进一步地，上述技术方案，步骤(iii)所述混合液在模具中冷冻的温度优选为-20℃，所述冷冻干燥的温度优选为-50℃。
进一步地，上述技术方案，步骤(iii)所述EDC/NHS乙醇溶液中EDC浓度为0.05～0.2mol/L，优选为0.1mol/L；NHS浓度为0.01～0.1mol/L，优选为0.05mol/L。
与现有技术相比，本发明涉及的一种VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的制备方法及其在骨修复支架材料中的应用具有如下有益效果：
(1)本发明制得的VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球具有良好的力学性能、降解性能，以及合适的降解速率和优异的抗菌性能，能持续28天抑制金黄葡萄球菌的生长，因此适合用作骨缺损修复材料。
(2)本发明方法采用的原料均具有良好的生物安全性，大大降低了临床应用的安全性风险，且本发明制备方法不涉及有机试剂或有机化学反应，反应体系温和，条件可控，不存在毒性交联剂或助剂等残留问题，整个工艺简单有效，具有很好的临床应用前景。
附图说明
图1中1～9依次为实施例1～9制得的VA@PLGA-CS-HA复合微球的SEM照片；
图2为VA拟合标准曲线图；
图3为实施例1制得的3种微球样品的累积释放率随释放时间的变化曲线对比图；
图4为实施例1制得的3种微球样品和对照样品(万古霉素)释放万古霉素的浓度随释放时间变化的曲线对比图；
图5为实施例1制得的3种VA@PLGA-CS-HA微球的体外抗菌结果对比图；
图6为应用实施例1～9制得的VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料的SEM照片；
图7为应用实施例1～9制得的VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料的降解性能测试结果对比图；
图8为应用实施例10制得的3种VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料的体外抗菌结果对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施案例和附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施案例。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
实施例1
本实施例的一种VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将PLGA溶解于二氯甲烷中，配制成质量百分比浓度为10wt％的PLGA溶液，备用；将壳聚糖溶解于质量百分比浓度为2wt％的冰乙酸中，配制成质量百分比浓度为1wt％的壳聚糖溶液，备用；将透明质酸钠溶解于蒸馏水中，配制质量百分比浓度为1.5wt％的透明质酸钠溶液，备用；将万古霉素盐酸盐(VA)溶解于蒸馏水中，配制质量百分比浓度分别为25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml的万古霉素溶液，备用；将聚乙烯醇(PVA)溶解于蒸馏水中，配制质量百分比浓度为3wt％的PVA溶液，备用；将三聚磷酸钠溶解于蒸馏水中配制成质量百分比浓度为5wt％的三聚磷酸钠溶液，备用；
(2)按体积比VPLGA：VVA＝5：1，将PLGA溶液与VA溶液混合，漩涡混均5min，然后超声5min，形成W1/O乳液；
(3)按体积比VCS：VPVA＝1：1将壳聚糖溶液和PVA溶液混合均匀，得CS/PVA溶液；
(4)按体积比VCS/PVA：VW1/O＝4：1，将CS/PVA溶液与W1/O乳液混合，漩涡混均5min，超声5min，重复2～3次，得到稳定的W1/O/W2乳液；
(5)量取与步骤(3)中所用的壳聚糖溶液体积相当的透明质酸钠溶液，然后用加入质量百分比浓度为0.4wt％的PVA溶液，配制成HAS/PVA溶液，HAS/PVA溶液的总体积为W1/O/W2乳液的体积的5倍；
(6)将步骤(4)所得W1/O/W2乳液与步骤(5)所得HAS/PVA溶液混合，室温下800rpm机械搅拌1h，然后在1000rpm下升温至45℃，搅拌30min，然后再800rpm条件下加入与步骤(3)中所用的壳聚糖溶液体积相当的三聚磷酸钠溶液，继续搅拌1.5h，静置过夜(12h)，8000rpm离心5min，蒸馏水洗涤分散，8000rpm离心，收集沉淀，冷冻干燥，制得VA@PLGA-CS-HA复合微球；
(7)三种万古霉素投料不同的微球分别命名为VA@PLGA-CS-HA-25、VA@PLGA-CS-HA-50、VA@PLGA-CS-HA-100。
实施例2
本实施例的VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的制备方法，与实施例1的方法基本相同，区别仅在于：步骤(1)中PLGA溶液的质量百分比浓度为5wt％，壳聚糖溶液的质量百分比浓度为0.5wt％，透明质酸钠溶液的质量百分比浓度为1wt％。
实施例3
本实施例的VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的制备方法，与实施例1的方法基本相同，区别仅在于：步骤(1)中PLGA溶液的质量百分比浓度为5wt％，壳聚糖溶液的质量百分比浓度为1wt％，透明质酸钠溶液的质量百分比浓度为2wt％。
实施例4
本实施例的VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的制备方法，与实施例1的方法基本相同，区别仅在于：步骤(1)中PLGA溶液的质量百分比浓度为5wt％，壳聚糖溶液的质量百分比浓度为1.5wt％，透明质酸钠溶液的质量百分比浓度为3wt％。
实施例5
本实施例的VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的制备方法，与实施例1的方法基本相同，区别仅在于：步骤(1)中PLGA溶液的质量百分比浓度为10wt％，壳聚糖溶液的质量百分比浓度为0.5wt％，透明质酸钠溶液的质量百分比浓度为2wt％。
实施例6
本实施例的VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的制备方法，与实施例1的方法基本相同，区别仅在于：步骤(1)中PLGA溶液的质量百分比浓度为10wt％，壳聚糖溶液的质量百分比浓度为1wt％，透明质酸钠溶液的质量百分比浓度为3wt％。
实施例7
本实施例的VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的制备方法，与实施例1的方法基本相同，区别仅在于：步骤(1)中PLGA溶液的质量百分比浓度为15wt％，壳聚糖溶液的质量百分比浓度为0.5wt％，透明质酸钠溶液的质量百分比浓度为3wt％。
实施例8
本实施例的VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的制备方法，与实施例1的方法基本相同，区别仅在于：步骤(1)中PLGA溶液的质量百分比浓度为15wt％，壳聚糖溶液的质量百分比浓度为1wt％，透明质酸钠溶液的质量百分比浓度为1wt％。
实施例9
本实施例的VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的制备方法，与实施例1的方法基本相同，区别仅在于：步骤(1)中PLGA溶液的质量百分比浓度为15wt％，壳聚糖溶液的质量百分比浓度为1.5wt％，透明质酸钠溶液的质量百分比浓度为2wt％。
性能检测及表征
1、SEM测试
将上述实施例1～9制得的干燥好的VA@PLGA-CS-HA复合微球用导电胶固定在铜台上，喷金处理后，通过扫描电子显微镜(SEM)观察。测试结果如图1所示。
从图1可以看出，实施例2、5、7、8、9所制备的微球的表面比较光滑，证明壳聚糖和透明质酸没有很好得包裹在PLGA微球的表面上，相比实施例1、3、4、6制得的微球表面可以看到有明显的皱褶，说明PLGA微球的表面包裹有壳聚糖和透明质酸，实施例3和实施例6较实施例1和实施例4表面有较多的壳聚糖和透明质酸包裹；实施例6和实施例3相比可以看出微球表面有更多的壳聚糖和透明质酸包裹；所以从扫描电镜的结果可以看出VA@PLGA-CS-HA微球的最优制备条件为：PLGA的质量百分比浓度为10wt％、透明质酸的质量百分比浓度为1.5wt％、壳聚糖的质量百分比浓度为1wt％。
2、微球的包封率和载药量测试
(1)标准曲线的绘制：
称取一定量的盐酸万古霉素(VA)溶于蒸馏水，分别配制成质量浓度为700ug/mL、600ug/mL、500ug/mL、400ug/mL、300ug/mL、200ug/mL、100ug/mL、75ug/mL、50ug/mL、25ug/mL、用紫外分光光度计分别测量标准工作液在280nm的吸光度，测试结果如表1所示。
表1不同VA标准品浓度在280nm对应的吸光度表
标准品浓度(ug/ml) 吸光度
25 0.04158
50 0.15512
75 0.15756
100 0.37036
200 0.77236
300 1.16669
400 2.09527
500 2.54626
600 2.80626
700 3.02177
根据表1的测试结果，绘制得到的VA拟合标准曲线如图2所示。计算得出标准曲线方程式为：C＝(A+0.109)/0.004。
(2)准确称量干燥后的样品0.01g，溶解于1mL二氯甲烷中；加入2mL水，涡旋30s，静止2h，取上清液于洁净的烧杯中；测量提取液于紫外分光光度计在280nm的吸光度。代入已知标准曲线方程式中。计算微球中的药物浓度，然后代入公式(1)和(2)
Er＝W1/W0*100％ (1)
DL＝m1/m2*100％ (2)
式中：Er为包埋率；W1为微球中万古霉素含量；W0为始投药量；DL为微球中万古霉素含量；m1为微球中万古霉素含量；m2为微球总质量。
计算得出实施例1制得的三种不同万古霉素含量的VA@PLGA-CS-HA-25、VA@PLGA-CS-HA-50、VA@PLGA-CS-HA-100的包封率、载药量分别如下表2、3、4所示。
表2 VA@PLGA-CS-HA-25样品的包封率、载药量测试结果表
Figure GDA0002460145510000081
包封率(mean±SD)＝79.70±5.11
载药量(mean±SD)＝3.98±0.26。
表3 VA@PLGA-CS-HA-50样品的包封率、载药量测试结果表
平行组 1 2 3
吸光度 1.6606 1.5097 1.6874
载体的含药量(μg) 442.40 404.67 449.10
包封率(％) 88.48 80.94 89.82
载药量(％) 8.848 8.094 8.982
包封率(mean±SD)＝86.41±3.91
载药量(mean±SD)＝8.64±0.39。
表4 VA@PLGA-CS-HA-100样品的包封率、载药量测试结果表
平行组 1 2 3
吸光度 2.5046 2.3148 2.4351
载体的含药量(μg) 1306.8 1211.9 1272.05
包封率(％) 65.34 60.59 63.60
载药量(％) 13.07 12.12 12.72
包封率(mean±SD)＝63.18±1.96
载药量(mean±SD)＝12.63±0.39。
3、微球的药物体外释放性能测试
测试方法如下：准确称取3份VA@PLGA-CS-HA复合微球200mg，放入50mL的离心管中，每份样品加入10mL PBS(pH＝7.4)，随后将离心管置于37℃水浴，分别在所设置时间点取样(1d，3d，7d，14d，21d，28d，35d，42d，49d，56d)，1000rpm离心10min，取出全部上清液，收集于无菌的离心管中，-80℃待测。
将各个时间点收集的缓释液用紫外分光光度计进行检查，测定各时间点缓释液在最大吸收波长280nm处的吸光度(A)，根据标准曲线，计算相对应的缓释液所含的万古霉素的浓度，从而推算出各时间点的药物释放量。
从图3可以看出实施例1制得的3种微球在24h内没有有明显的突释；其中VA@PLGA-CS-HA-50的药物释放速率在所有时间点中都明显比VA@PLGA-CS-HA-25和VA@PLGA-CS-HA-100要高，而VA@PLGA-CS-HA-100的药物释放量在所有时间点中均比VA@PLGA-CS-HA-25和VA@PLGA-CS-HA-100要多，从图4可以看出在释放后期，三种微球所释放的万古霉素的浓度均在万古霉素的最小抗菌浓度之上。
4、微球的体外抗菌性能测试
(1)配制LB培养液和生理盐水，对细菌进行复苏，并且用生理盐水将菌液稀释至菌液浓度为105cfu/ml。
(2)称取50mg样品，紫外灭菌处理，将其放入50mL的锥形瓶中，加入1mL去LB培养液，并加入0.2mL菌液，在37℃摇床120rpm的条件下将样品和菌液共培养(共培养时间点分别为：1d，3d，7d，14d，21d，28d，35d，42d，56d)。
(3)取100μL的混合液采用培养基倾注法接种平皿，将培养皿置于37℃细菌培养箱培养24小时后计算菌落数。计算抑菌率，计算公式如下：
Relative CFU％＝CFU(24h)/CFU(0h)×100％。
图5为实施例1制得的3种VA@PLGA-CS-HA微球的体外抗菌结果，可以看出在第1天VA@PLGA-CS-HA-100微球的Relative CFU达30.58％，证明杀死了69％的金黄葡萄球菌，而VA@PLGA-CS-HA-50和VA@PLGA-CS-HA-25的Relative CFU分别为57.53％、65.68％，VA@PLGA-CS-HA-100杀菌能力明显较其余两组高；到第7天VA@PLGA-CS-HA-100、VA@PLGA-CS-HA-50和VA@PLGA-CS-HA-25的Relative CFU分别为2.55％、7.35％、7.73％，Relative CFU均低于10％，证明三种微球均能有效杀死金黄葡萄球菌；在第14天到28天三种微球的Relative CFU均低于3％，证明三种微球均能有效抑制金黄葡萄球菌的生长。
应用实施例1
VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料的制备方法，所述方法包括如下步骤：
将明胶溶解于蒸馏水中配制成质量百分比浓度为5％的明胶溶液，备用；然后按比例将羟基磷灰石和VA@PLGA-CS-HA-50微球一并加入到明胶溶液当中，磁力搅拌60min，超声10min，得到HAP/VA@PLGA-CS-HA混合液，再将所得混合液置于模具当中，置于-20℃冰箱中，接着-50℃冷冻干燥，脱模，将所得支架用EDC/NHS乙醇溶液浸泡6h(EDC/NHS乙醇溶液中EDC浓度为0.1mol/L、NHS浓度为0.05mol/L)，最后用蒸馏水洗涤支架，置于-20℃冰箱中，然后-50℃冷冻干燥；其中：所述HAP/VA@PLGA-CS-HA混合液中HAP的浓度为0.1g/ml，微球的浓度为0.1g/ml。
应用实施例2
本应用实施例的VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料的制备方法与应用实施例1的制备方法基本相同，区别仅在于：所述HAP/VA@PLGA-CS-HA混合液中HAP的浓度为0.1g/ml，微球的浓度为0.2g/ml。
应用实施例3
本应用实施例的VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料的制备方法与应用实施例1的制备方法基本相同，区别仅在于：所述HAP/VA@PLGA-CS-HA混合液中HAP的浓度为0.1g/ml，微球的浓度为0.3g/ml。
应用实施例4
本应用实施例的VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料的制备方法与应用实施例1的制备方法基本相同，区别仅在于：所述HAP/VA@PLGA-CS-HA混合液中HAP的浓度为0.2g/ml，微球的浓度为0.1g/ml。
应用实施例5
本应用实施例的VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料的制备方法与应用实施例1的制备方法基本相同，区别仅在于：所述HAP/VA@PLGA-CS-HA混合液中HAP的浓度为0.2g/ml，微球的浓度为0.2g/ml。
应用实施例6
本应用实施例的VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料的制备方法与应用实施例1的制备方法基本相同，区别仅在于：所述HAP/VA@PLGA-CS-HA混合液中HAP的浓度为0.2g/ml，微球的浓度为0.3g/ml。
应用实施例7
本应用实施例的VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料的制备方法与应用实施例1的制备方法基本相同，区别仅在于：所述HAP/VA@PLGA-CS-HA混合液中HAP的浓度为0.3g/ml，微球的浓度为0.1g/ml。
应用实施例8
本应用实施例的VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料的制备方法与应用实施例1的制备方法基本相同，区别仅在于：所述HAP/VA@PLGA-CS-HA混合液中HAP的浓度为0.3g/ml，微球的浓度为0.2g/ml。
应用实施例9
本应用实施例的VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料的制备方法与应用实施例1的制备方法基本相同，区别仅在于：所述HAP/VA@PLGA-CS-HA混合液中HAP的浓度为0.3g/ml，微球的浓度为0.3g/ml。
性能检测及表征
1、SEM测试
将上述应用实施例1～9制得的VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料(分别记为G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9)用导电胶固定在铜台上，喷金处理后，通过扫描电子显微镜(SEM)观察。测试结果如图6所示。
从图6可以看出，G1、G2、G3组的支架由于羟基磷灰石的添加量较少所以支架的结构比较疏松，微球的表面没有太多的羟基磷灰石包裹，支架溶液在液体中崩解；从图6还可以看出，当羟基磷灰石的添加量增多，支架的结构更为紧密，G4、G5、G6组羟基磷灰石形成了明显的孔洞结构，而G7、G8、G9组的孔洞结构较少，所以在支架结构来考虑的话，G4、G5、G6组这三组的结构较好合适用作骨缺损修复材料。
2、体外降解性能测试
具体测试方法如下：将VA@PLGA-CS-HA/HAP支架裁成1cm×1cm×1cm的立方体，然后将样品浸泡于SBF模拟液中，置于37℃的摇床中，转速设置为120rpm。分别于1、3、7、14、21、28天取样，干燥至恒重后称重，并计算出降解率。
降解率＝(Wi-Wt)/Wi×100％，
Wi为样品降解前的质量；Wt为降解后样品的质量。
图7为应用实施例1～9制得的VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料的降解性能测试结果对比图。由图7可以看出，羟基磷灰石的添加量对支架的降解速率有明显的影响，G1、G2、G3组的支架的降解速率较快，在第一天分别降解18.49％、16.16％、14.57％，第3天到第28天的降解过程降解速度比较均衡，但是在28天时支架已经基本降解至原来重量的10％左右；G4、G5、G6组的支架在第一天分别降解6.19％、7.93％、6.39％，三组支架的在所有时间点的降解量均比G1、G2、G3组的少，而G7、G8、G9组的支架在所有时间点的降解量为所有组中最少，证明支架中羟基磷灰石的添加量越多，支架的降解速率越慢，而微球的添加量的多少对支架的降解速率没有明显的影响。
应用实施例10
综合上述应用实施例1～9制得的VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料的扫描电镜、力学性能和降解性能的测试数据，认为G6组的支架的制备比例为最优比例，本应用实施例VA@PLGA-CS-HA/HAP的制备以G6组支架的制备比例将VA@PLGA-CS-HA-25、VA@PLGA-CS-HA-50、VA@PLGA-CS-HA-100微球分别与羟基磷灰石制成3种VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料，依次命名为VA@PLGA-CS-HA/HAP25、VA@PLGA-CS-HA/HAP50、VA@PLGA-CS-HA/HAP100，并对其体外抗菌性能检测。
体外抗菌性能测试
测试方法参见微球的抗菌性能测试。图8为上述制得的3种VA@PLGA-CS-HA/HAP支架的体外抗菌结果，可以看出在第1天到第7天支架的抗菌能力与支架中所含有的万古霉素的量呈正相关，到达第14天时三种支架基本对金黄葡萄球菌完全杀灭，第14天后三种支架均明显对金黄葡萄球菌的生长有明显的抑制作用。

Claims (10)

1.一种VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)将聚乳酸聚乙醇酸共聚物PLGA溶解于二氯甲烷中，配制质量百分比浓度为5～15wt％的PLGA溶液；将壳聚糖CS溶解于冰乙酸中，配制质量百分比浓度为0.5～1.5wt％的壳聚糖溶液，备用；将透明质酸钠HAS溶解于蒸馏水中，配制质量百分比浓度为1～3wt％的透明质酸钠溶液，备用；将万古霉素盐酸盐VA溶解于蒸馏水中，配制质量百分比浓度为25～100mg/ml的万古霉素溶液；将聚乙烯醇PVA溶解于蒸馏水中，配制质量百分比浓度为0.3～3wt％的PVA溶液，备用；
(2)按比例将步骤(1)所述PLGA溶液与VA溶液混合均匀后超声分散，形成W1/O乳液，其中：所述PLGA溶液与VA溶液的体积比为2～10：1；
(3)按比例将步骤(1)所述壳聚糖溶液与PVA水溶液混合均匀，得到CS/PVA溶液；其中：所述壳聚糖溶液与PVA水溶液的体积比为0.5～2：1；
(4)按比例将步骤(3)所述CS/PVA溶液与步骤(2)所述W1/O乳液混合，超声分散均匀后，得到稳定的W1/O/W2乳液，其中：所述CS/PVA溶液与W1/O乳液的体积比为2～6：1；
(5)取适量步骤(1)所述透明质酸钠溶液，加入PVA溶液，配制HAS/PVA溶液，其中：所述透明质酸钠溶液与步骤(3)采用的壳聚糖溶液的体积比为1：1，所述HAS/PVA溶液与W1/O/W2乳液的体积比为4～6：1；
(6)将步骤(4)所得W1/O/W2乳液与步骤(5)所得HAS/PVA溶液混合，室温搅拌0.5～2h后升温至45℃，继续搅拌20～40min，然后加入适量三聚磷酸钠水溶液，搅拌1～2h后静置8～12h，离心、洗涤，收集沉淀，冷冻干燥，制得所述的VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球。
2.根据权利要求1所述的VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述PLGA溶液质量百分比浓度为10wt％；所述壳聚糖溶液的质量百分比浓度为1wt％；透明质酸钠溶液的质量百分比浓度为1.5wt％。
3.根据权利要求1所述的VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述PLGA溶液与VA溶液的体积比为5：1。
4.根据权利要求1所述的VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述壳聚糖溶液与PVA水溶液的体积比为1：1。
5.根据权利要求1所述的VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述CS/PVA溶液与W1/O乳液的体积比为4：1。
6.根据权利要求1所述的VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球的制备方法，其特征在于：步骤(5)所述HAS/PVA溶液与W1/O/W2乳液的体积比为5：1；步骤(6)所述三聚磷酸钠水溶液与步骤(3)采用的壳聚糖溶液的体积比为1：1。
7.权利要求1所述方法制得的VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球在制备骨修复支架材料中的应用。
8.根据权利要求7所述的VA@PLGA-CS-HA复合抗菌缓释微球在制备骨修复支架材料中的应用，其特征在于：所述骨修复支架材料为VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料。
9.一种VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(i)将明胶溶解于蒸馏水中，配制质量百分比浓度为1～10％的明胶溶液，备用；
(ii)按配比将羟基磷灰石(HAP)和VA@PLGA-CS-HA微球一并加入到步骤(1)所述明胶溶液中，磁力搅拌30～90min后超声分散均匀，得到HAP/VA@PLGA-CS-HA混合液；其中：所述VA@PLGA-CS-HA微球是权利要求1所述方法制得的；
(iii)将步骤(ii)所得HAP/VA@PLGA-CS-HA混合液置于模具中-15～-25℃冷冻，然后在-40～-60℃条件下冷冻干燥，脱模，获得支架；再将所得支架用EDC/NHS乙醇溶液浸泡5～7h，最后洗涤、干燥，获得所述的VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料。
10.根据权利要求9所述的VA@PLGA-CS-HA/HAP支架材料的制备方法，其特征在于：步骤(ii)所述羟基磷灰石与VA@PLGA-CS-HA微球的质量比为2：3。
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