CN112335656A - 一种改良型纳米化不育剂及其制备方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改良型纳米化不育剂及其制备方法和装置，包含如下步骤：将纯度大于99%的紫草素和纯度大于99%的炔雌醚以10:1的质量比溶解于食用油中，加入等量的蒸馏水；将上述所制备的药剂利用超声波细胞粉碎机进行纳米乳化处理，制得不育剂乳液；该不育剂乳液浓度在30mg/kg时，对于非靶动物无作用，这就很好的解决了误伤其他物种的问题，对于维持草原生态平衡是极为有利的；该不育剂乳液相对于现有技术，其最大的特点就是用药量大幅减少，但药效反而增加了，这使得本申请的技术方案能够真正的落地实施，降低防治成本，提升防治效果，为药物今后的投放提供技术支持。

Description

一种改良型纳米化不育剂及其制备方法和装置

技术领域

本发明涉及草地啮齿动物的防治领域，具体涉及一种改良型纳米化不育剂及其制备方法和装置。

背景技术

草地啮齿动物是草地生态系统组成的重要动物类群之一，具有多方面的生态学功能。鼠类对草原适度的啃食和挖掘对维持生态系统的平衡具有有利作用。但是，当鼠类的密度超过一定的阈值，就会形成鼠害。草原鼠害每年造成的畜牧业损失惊人，因此必须对害鼠种群数量进行有效控制。目前，传统化学灭鼠剂由于严重污染环境，并有潜在的产生二次中毒现象，已面临被淘汰的局面。不育控制由于其非致死性特点，受到广大研究者的重视。因此，害鼠不育控制将取代化学灭鼠剂，成为控制害鼠种群数量的主要方法。不育控制就是采用某种方法使雄性或雌性鼠绝育或阻碍其胚胎的着床发育，甚至于幼体的生长发育障碍，以降低鼠类的出生率，控制其种群数量和密度，其实质是生育率控制。用不育药物与饵基适当比例混合制成的不育剂饵料还具有操作安全及不易对环境造成污染等特点。

现有技术（申请号为CN201611034180.0，名称为一种植物源鼠类复合不育剂的制备方法）研究表明，主要成分为紫草素和炔雌醚的植物源复合不育剂ND-1（农大-1号）浓度为50mg/kg时，能够使小鼠（Mus musculus）、子午沙鼠（Meriones meridianus）繁殖启动期明显推迟，延长其繁殖周期，直接效果是相对降低了小鼠和子午沙鼠的年度繁殖次数和繁殖率。对雌、雄小鼠和子午沙鼠均有抗生育作用。然而，应用于野外控制草原害鼠种群数量的不育剂实施成本高昂，加之草原面积广袤，需要投放的不育剂数量级非常的大，因此性价比非常的低，很难将其产业化，草原害鼠依然无法得到有效的控制，这也是这一方式虽具备十分有优异的效果，但是依旧无法大规模应用的主要因素之一。

因此，在上述基础上，如何在降低用药量的同时，还能够提升药效，是目前仍然面临的最大问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改良型纳米化不育剂及其制备方法和装置，该不育剂乳液相对于现有技术，其最大的特点就是用药量大幅减少，但药效反而增加了，这使得本申请的技术方案能够真正的落地实施，降低妨治成本，提升防治效果，为药物今后的投放提供技术支持；而且用本申请方式改良后的纳米化不育剂乳液，不育剂乳液浓度为30mg/kg，对于非靶动物无作用，这就很好的解决了误伤其他物种的问题，对于维持草原生态平衡是极为有利的。

一种改良型纳米化不育剂的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

s1：将纯度大于99%的紫草素和纯度大于99%的炔雌醚以10:1的质量比溶解于食用油中，加入等量的蒸馏水；

s2：将上述所制备的药剂利用超声波细胞粉碎机进行纳米乳化处理，制得不育剂乳液。

优选地，所述不育剂乳液的主要成分微粒在100nm以下。

一种由上述制备方法制得的改良型纳米化不育剂，其特征在于：

所述不育剂由纯度大于99%的紫草素、纯度大于99%的炔雌醚、食用油、蒸馏水配置而成；所述不育剂中紫草素和炔雌醚的浓度为30mg/kg；其中，紫草素与炔雌醚的质量比为10:1。

一种用于投放上述改良型纳米化不育剂的装置，包括投料管，风管，网板，搅拌叶，扇叶；其特征在于：

所述投料管为V形管状结构，在投料管的顶部中央位置处设有轴孔，且在轴孔处具有向上的边沿；在轴孔内可转动的安装有风管，在风管的下端安装有搅拌叶，在搅拌叶上方的投料管上加装有网板；在风管的顶部安装有扇叶；

所述投料管埋在地下，且投料管的两端管口位于地面以上。

优选地，所述投料管的两端具有向下的弯头，目的是避免雨天雨水灌溉在投料管内。

优选地，所述投料管埋于地面后，投料管上的边沿位于地面之上。

优选地，所述扇叶上涂有或贴有反光材料或贴纸。

优选地，所述投料管内壁具有防滑结构。

进一步，所述防滑结构为凸起或防滑纹路。

本发明的有益效果在于以下：

第一、本申请中所披露的不育剂，其相对于现有同类技术，其所需要的浓度更小，并且药效能够达到甚至超过现有技术中50mg/kg的药效，这一技术效果，是不可想象的；通过本申请的方式，其大幅的降低了不育剂的成本，得到了更为经济、可持续控制效果的不育剂，为药物今后的投放提供技术支持。

第二、本申请中所制备的不育剂，其对于非靶动物是无作用的，这对于控制生态是极为有利的，既仅对鼠害有药效，那么在草原的其他物种如兔子吃了后，不会对其起作用，这样便不会对草原的食物链造成破坏；既本申请的不育剂解决鼠害问题时，不会引入新的问题，这是解决实际问题来说，其优势是非常明显的。

第三、本申请的不育剂，是控制而不是灭绝，其主要效果是延长生育周期（而不是无法生育）和控制生育率（而不是不生育）这两个方式达到鼠害的防止的，这就不会间接性破坏草原上以鼠为食的其他动物的生存食物保障，达到草原食物链的平衡。

第四、本申请的不育剂能够进一步提高利用率，这是降低不育剂使用量的最直接作用。

第五、本申请还公开了一种专门用于投放该不育剂的装置，该装置是专门针对老鼠的钻洞习性开发的；投放饵料时，将该装置半埋在地下，在投料管内投放一定量的饵料即可，老鼠钻入到投料管内，可直接食用饵料，食用完毕后可以无障碍的离开；考虑到草原上下雨天雨水会灌入投料管内使饵料发潮或变质影响食用口感，因此，特别设置投料管的端口向下弯折；此外，本申请的饵料被光照射后，药效会显著降低，因此投放和保存时均需要避光保存；本申请所设计的该装置，就可以起到避光保存，同时考虑到尘土进入到投料管内时，与饵料混合会影响小鼠的食用口感，因此设置网板，可以有效的将尘土与饵料隔开（尘土的自身重力以及草地啮齿动物对饵料的翻动），这样就减少了饵料被污染的概率；同时，设置风管，利用气流流速不同，使投料管内产生负压（根据伯努利原理可知），从而将滤下去的尘土从风管内抽出；为了增强抽出的效果，充分利用了草原上的风力，使风管转动，风管带动搅拌叶对尘土起到搅饶的作用，从而提升抽吸效果；除此之外，设置的网板第一个作用还能够方便鼠类稳定站立食用饵料，方便其落脚；第二个作用是可以有效的保护保护搅拌叶不被啃食。本申请的风管顶部还加盖有盖帽，盖帽的作用既能够起到防尘的作用，也能够起到防雨的作用，同时还能够达到空气流动的目的，方便风管下端产生负压。

附图说明

图1为本发明的不同浓度实验组脏器系数

注：图中不同小写字母表示脏器系数差异显著，显著水平为p<0.05。

图2为本发明的不同浓度实验组雄鼠的精子密度

注：图中不同小写字母表示精子密度差异，显著显著水平为p<0.05。

图3为本发明的不同处理组小鼠繁殖胎仔数

图中不同小写字母表示繁殖胎仔数差异显著，显著水平为p<0.05。

图4为本发明的不同处理组小鼠不同时期繁殖胎仔数。

图5为本发明的绵羊血液中炔雌醚含量变化图。

图6为本发明的绵羊血液中紫草素含量变化图。

图7为本发明的绵羊血液中炔雌醚含量显著性分析图。

图8为本发明的绵羊血液中紫草素含量显著性分析图。

图9为本发明的绵羊血液中孕酮水平标准曲线。

图10为本发明的投放饵料的装置示意图。

图11为本发明的风管与盖帽连接的剖切示意图。

图中，投料管1，边沿1-1，风管2，网板3，搅拌叶4，扇叶5。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的设备，如无特殊说明，均为自常规设备。下列实验组数并非实际实验组数，仅为审查员方便理解与内容的节约而抽取的特定组数。

请参考附图所示，为了低成本解决鼠害问题，本申请公开了一种改良型纳米化不育剂及其制备方法和装置。

首先是改良型纳米化不育剂的制备方法，该方法操作比较简单，具体如下：将紫草素与炔雌醚以10:1的质量比溶解于食用油中，然后加入等量蒸馏水，再将其置于超声波细胞粉碎机（ScientzⅡD）中，利用超声波细胞粉碎机进行纳米乳化处理，制得不育剂乳液（记作ND-1乳液），为了验证所制得的不育剂的技术效果，在制备时，可以分别制得多组不同浓度的不育剂乳液进行验证，具体验证过程如下：

首先，将成年实验小白鼠分为4组，每组10对，其中1组为对照组（既不投喂该不育剂乳液），其余3组分别用浓度为10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg（实际验证时，实施了多组实验组，为了简化内容，本申请仅摘取其中的三组进行举例说明）的不育剂乳液进行灌胃；每只小鼠单次灌胃ND-1乳液0.2ml，实验期间灌胃2次，间隔48h，每次灌胃后单独置于独立代谢笼中，期间自由摄食取水，收集灌胃后48h小时内粪便及尿液，-20℃冰箱冷冻保存，以测定小鼠对ND-1纳米乳液的吸收率，最后1次灌胃1周后进行解剖，测定雌性子宫、卵巢、雄性精囊腺和睾丸4项脏器系数以及雄性精子密度，共5项指标（脏器和胴体取样均为鲜重，单位g）。

脏器系数用以下公式计算：

进行繁殖控制实验，具体如下：

由上述实验组不育剂乳液浓度中，选择1种抗生育效果较好的理想浓度进行繁殖控制实验，重新选取小鼠4组，每组10对，其中对照组1组，实验组3组，设3种不同处理：雄性处理组（雄性给药，雌性不给药），雌性处理组（雌性给药，雄性不给药），雌雄处理组（雌、雄都给药）。实验组以理想浓度（既30mg/kg）不育剂乳液灌胃持续1周，共灌胃2次，间隔3d，对照组以相同量食用油灌胃，最后1次灌胃1周后所有组进行雌雄1：1合笼，记录合笼后小鼠繁殖情况。

对小鼠精子密度测定，具体如下：

在光学显微镜下，采用红细胞计数板计数，在1mm²的计数室中，计数25个方格中四周和中央共5个方格中的精子数量。计算方法：

精子密度（精子总数/ml）=精子数×稀释倍数×5×10⁴

色谱（采用高效液相色谱仪（Agilent1220））条件，具体如下：

Agilent HC-C18柱(250*4.6mm,5um )，流动相乙腈(A)-水(B)(v/v)溶液，洗脱程序0～5min，A(%)=40%～50%:5～10min，A(%)=50%～60%，10～15min，A(%)=60%～70%，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长280nm，检测时间15min，进样量10μL。

数据处理，具体如下：

采用SPSS19.0单因素方差分析对不同处理组小鼠雌性子宫脏器系数、雌性卵巢、雄性精囊腺、睾丸脏器系数和精子密度进行比较分析，对各组雌鼠新生幼仔数进行比较分析。

对上述实验结果的分析过程如下：

第一、分析不育剂乳液对小鼠繁殖器官的影响

3个不育剂浓度10mg/kg、20mg/kg和30mg/kg的实验组与对照组的子宫、卵巢、睾丸、精囊腺脏器系数与精子密度比较分析结果表明，不同浓度实验组雌性小鼠卵巢脏器系数与对照组无显著差异（图1-A）。不育剂浓度为30mg/kg实验组小鼠子宫脏器系数显著低于对照组（F=3.926，P<0.05，图1-B），说明不育剂浓度为30mg/kg实验组子宫出现明显萎缩现象。

不同浓度实验组睾丸脏器系数与对照组无显著差异（图1-C）。不育剂浓度为30mg/kg实验组精囊腺脏器系数、与精子密度均显著低于对照组（F=4.37，P<0.05；F=3.302 ，P<0.05，图1-D，图2）。结果表明，30mg/kg浓度的不育剂不育剂乳液使得小鼠精囊腺明显萎缩，产生精子数量显著降低。

由此可以证实，与现有技术中公开的50mg/kg浓度相比，本申请降低其浓度为30mg/kg后，降幅高达40％；依然能够起到很好的不育效果。

第二、，分析不育剂乳液对小鼠的繁殖影响

不育剂乳液浓度在30mg/kg时，实验结果表明对照组第1次繁殖胎仔数显著高于处理组，（F=6.968，P<0.05，图3-A）。对照组第2次繁殖胎仔数与雄性处理组无显著差异，雌性处理组、雄性处理组与雌雄处理组三者之间无显著差异，但对照组与雌性处理组、雌雄处理组存在显著差异（F=6.931，P<0.05；F=7.157，P<0.05，图3-B）。表明30mg/kg浓度不育剂不育剂乳液有效降低了小鼠的繁殖性能。

小鼠自雌雄合笼至第1窝幼体出生为止的天数为繁殖启动期，以相邻两胎仔鼠出生日期的时间差作为两胎间的胎间隔。不同处理组小鼠繁殖启动期与胎间隔如图4。从繁殖启动期来看，雌性处理组、雄性处理组与雌雄处理组繁殖启动期极显著高于对照组（F=29.614，P<0.05；F=35.149，P<0.05；F=42.17，P<0.05）。雌性处理组繁殖启动期较对照组推迟（8.11±2.40d），雄性处理组繁殖启动期较对照组推迟（7.56±2.76d），雌雄处理组较对照组推迟（6.54±2.89d）。从胎间隔来看，对照组胎间隔显著低于其余三组（F=79.149，P<0.05）雄性处理组胎间隔较对照组延长（8.34±1.74d），雌性处理组较对照组延长（7.21±1.54d），雌雄处理组较对照组延长（8.19±2.09d）。即30mg/kg浓度不育剂ND-1纳米乳液有效延长了雌性、雄性小鼠的繁殖周期，对雌性、雄性小鼠均具有明显的抗生育作用。

第三、分析小鼠对不育剂乳液的吸收情况

按本研究色谱条件对小鼠粪便及尿液紫草素与炔雌醚含量进行测定，在尿液中并未检测到紫草素与炔雌醚成分，在粪便中未检测到炔雌醚成分，紫草素在粪便中回收率如下（表1）。其中回收率最高的为30mg/kg浓度处理组中的雄性小鼠，其回收率为（53.23±10.35）%，回收率最低的为10mg/kg浓度处理组的雌性小鼠，其回收率为（45.17±6.54）%。30mg/kg浓度处理组平均回收率为（51.29±8.48）%，与普通回收率（82.0±2.90）%相比较，降低了（30.71±5.58）%，粪便中紫草素残留量显著减少，表明乳化处理提高了小鼠对其的吸收率。

表1 小鼠粪便中紫草素回收率

。

第四、不育剂乳液对非靶动物的影响

对于家鸽的实验研究：取12只家鸽，分为2组，每组雌雄各半。实验组家鸽进行灌胃处理。将浓度30mg/kg的不育剂ND-1纳米乳液，按照野外投放鼠饵料的配比配制成液体，每只家鸽灌胃一次量含有2mg 紫草素，0.2mg炔雌醚，共灌胃2次，间隔48h，对照组以相同量食用油灌胃，全部样品于最后一次灌胃1周后进行解剖，测定各项相关脏器系数，并进行血样采集，每只家鸽的采集量为6ml，血液样品于超低温冰箱保存，使用高效液相色谱仪检测血液中的药物成分含量。

家鸽经不育剂乳溶液灌药后，观察精神状态、行为表现等，均无异常反应。解剖显示心、肝、脾、肺、肾、胃、卵巢、子宫、睾丸等器官均未见器质性病变。经计算脏器系数，实验组与对照组的卵巢脏器系数差异不显著，雄性家鸽睾丸脏器系数差异不显著。表明，浓度30mg/kg的不育剂乳液对家鸽的繁殖器官没有任何影响；家鸽血液中药物含量如表2所示。

表2 家鸽血液药物含量均值表

对于绵羊的实验研究：根据绵羊的日食量结合野外投放不育剂的实际情况，按照1日的投药量将植物源复合不育剂乳液用橡皮球投药法对绵羊进行灌胃，每只绵羊灌胃1次量含有48mg紫草素，4.8mg炔雌醚，共灌胃2次，间隔48h。于灌药后第1、3、5、7天定期抽取血液，使用高效液相色谱仪检测血液中的药物成分含量，研究药物在血液中的含量变化情况。于交配后第17天和第24天使用颈静脉采血的方法采集血液，每支采血管抽取5ml，采集三管，每只羊共计采血15ml。血液样品于超低温冰箱保存，根据ELISA试剂盒说明书进行检测，使用酶标仪进行读数，绘制标准曲线,算出检样中孕酮的含量，判断实验母绵羊是否怀孕。

绵羊经不育剂ND-1微乳溶液灌药后，观察精神状态、行为表现等，均无异常反应。血液中的药物含量总体呈降低趋势。变化情况详见表3、图5、图6；

表3 绵羊血液药物含量均值表

对绵羊血液中炔雌醚和紫草素含量进行显著性分析。绵羊血液中炔雌醚的含量随着时间的发展在总体上有极显著差异。绵羊血液中的炔雌醚含量在8h、16h和3d这三个时间点无显著差异，但显著高于绵羊在第5d和第7d的血液中的炔雌醚含量，极显著高对绵羊在第10d的血液中炔雌醚含量。说明在10d中，绵羊血液中的炔雌醚含量出现了极显著下降的现象。

绵羊血液中紫草素的含量随着时间的发展在总体上也有极显著差异。在绵羊进行灌药第8h的血液中，紫草素含量显著高于灌药后第16h、3d、5d这三个时间点，但极显著高于第7d和第10d绵羊血液中的紫草素含量。说明在10d中，绵羊血液中的紫草素含量总体呈下降趋势，出现了极显著下降的现象。见图7、图8。

应用放射免疫测定法测定母绵羊交配后第17天和第24天血液中的孕酮含量，根据ELISA试剂盒说明书进行检测，使用酶标仪进行读数，得出OD值，绘制标准曲线，算出检样中孕酮的含量，根据妊娠标准评定，以0.5ng/ml为判定标准，若母绵羊交配后第17天血液中孕酮浓度高于此标准，则可为判定为妊娠；为避免个体差异及确保数据准确性，故再取第24天血液，进行检测，在2次检测结果中，3只母绵羊2次孕酮含量均高于文献判定妊娠标准，可判断为妊娠状态，件表4、图9。

表4绵羊血液中孕酮浓度

由此可以证明，本申请请求保护的不育剂对于非靶动物是不起效果的，证实本申请所提到的技术效果是完全可以达到的。

在妨鼠害过程中，需要对本申请中的不育剂乳液与饲料掺和在一起用成型机挤压成颗粒状（制成饵料）进行投放，本申请所制备的饵料是害怕光照的，一旦发生光照，药效会衰减非常严重，基于此在投放时，本申请公开了一种专用装置，具体如下：

一种用于投放上述改良型纳米化不育剂的装置，该装置主要包括投料管1，边沿1-1，风管2，网板3，搅拌叶4，扇叶5，盖帽6；其特征在于：

投料管1为V形管状结构，既投料管1的两端连通，中间凹陷，在投料管1内壁设有防滑纹路或防滑凸起；在投料管1的顶部中央位置处设有轴孔，且在轴孔处具有向上的边沿1-1；在轴孔内可转动的安装有风管2，在风管2的下端安装有搅拌叶4，在搅拌叶4上方的投料管1上加装有网板3；在风管2的顶部安装有扇叶5，同时在风管的顶部安装有盖帽6。

实施时，将投料管1（半）埋在地下，且投料管1的两端管口位于地面以上，将上述制备的饵料倒入到投料管1的凹陷部位，然后再在风管2的顶端加盖上盖帽即可。考虑到草原雨天雨水灌溉至投料管1内将饵料发泡、变质等，设置投料管1的两端具有向下的弯头；考虑到泥土进入到风管2与投料管1之间将风管2卡住无法转动，需要满足投料管1埋于地面后，投料管1上的边沿1-1位于地面之上；同时为了很好的提示草原牧民投料管1的投放地点，避免误破坏，在扇叶5上涂有或贴有反光材料或贴纸。

本申请所制备的饵料是害怕光照的，因此，本申请的装置是完全可以避免光照的，同时又能够保护饵料不易发生变质，影响小鼠食用欲望；本申请的网板3作用是尘土进入到投料管1内（经过草地啮齿动物对饵料的翻动或自身重力），可以落入到网板3以下，避免其污染饵料，同时能够为小鼠提供一个立足之地进行放心食用。此外，风管2的作用是利用为了形成负压，而将投料管1内积聚的尘土抽入到投料管1外，尽可能的使投料管1内保持干净。

产生负压的原因是风管2顶部处于地表之上，有风时在风管2顶部的气流流速较快，而风管2底端的几乎是静置的，根据伯努利原理，此时在风管2底端就会产生负压，将投料管1内的尘土抽吸出去，效果较佳；此外，为了提升抽吸效果，在风管2顶部追加扇叶5，由于风力的作用，扇叶5的转动会带动搅拌叶4转动，搅拌叶对位于投料管底部的尘土进行搅拌，能够提高抽吸效果；除此之外，分管2还能够增加投料管内的空气流通，避免饵料极易变潮变质的问题。一般草原处于平原地区，四周无遮挡，风力比较充沛，因此，能够风力是完全够用的。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种改良型纳米化不育剂的制备方法，其特征在于：包含如下步骤：

s1：将纯度大于99%的紫草素和纯度大于99%的炔雌醚以10:1的质量比溶解于食用油中，加入等量的蒸馏水；

s2：将上述所制备的药剂利用超声波细胞粉碎机进行纳米乳化处理，制得不育剂乳液。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述不育剂乳液的主要成分微粒在100nm以下。

3.一种由权利要求1的制备方法制得的改良型纳米化不育剂，其特征在于：

不育剂由纯度大于99%的紫草素、纯度大于99%的炔雌醚、食用油、蒸馏水配置而成；所述不育剂中紫草素和炔雌醚的浓度为30mg/kg；其中紫草素与炔雌醚的质量比为10:1。

4.一种用于投放改良型纳米化不育剂的装置，包括投料管，风管，网板，搅拌叶，扇叶；其特征在于：

所述投料管为V形管状结构，在投料管的顶部中央位置处设有轴孔，且在轴孔处具有向上的边沿；在轴孔内可转动的安装有风管，在风管的下端安装有搅拌叶，在搅拌叶上方的投料管上加装有网板；在风管的顶部安装有扇叶；

所述投料管埋在地下，且投料管的两端管口位于地面以上。

5.根据权利要求4所述的装置，其特征在于：所述投料管的两端具有向下的弯头，目的是避免雨天雨水灌溉在投料管内。

6.根据权利要求4所述的装置，其特征在于：所述投料管埋于地面后，投料管上的边沿位于地面之上。

7.根据权利要求4所述的装置，其特征在于：所述扇叶上涂有或贴有反光材料或贴纸。

8.根据权利要求4所述的装置，其特征在于：所述投料管内壁具有防滑结构。

9.根据权利要求8所述的装置，其特征在于：所述防滑结构为凸起或防滑纹路。

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